本申請是針對中國申請日為：2013年09月25日，申請?zhí)?01310443058.9、名稱為：“一種裂殖壺菌菌株及其誘變方法和應(yīng)用”的發(fā)明專利申請?zhí)岢龅姆职干暾垺?/p>

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種裂殖壺菌菌株及其誘變方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha)是哺乳動物生長所必需的多不飽和脂肪酸的一種，但由于需從外界攝取，因而被稱為必需脂肪酸。研究表明，dha對嬰幼兒大腦和視力發(fā)育具有非常重要的生理作用，并具有預(yù)防及治療心血管疾病、防治老年癡呆、抑制癌變等生理功能，因而廣泛用于食品、醫(yī)藥和飼料行業(yè)。

dha的傳統(tǒng)來源為深海魚油，但存在率低、資源有限和純化工藝復(fù)雜等缺陷。海洋微生物被認(rèn)為是dha最有前途的商業(yè)化來源，其中利用微藻(包括隱甲藻、真菌如裂殖壺菌和破囊壺菌等)培養(yǎng)生產(chǎn)dha具有更大的優(yōu)勢和生產(chǎn)潛能，但普遍存在發(fā)酵藻粉產(chǎn)率低、脂肪酸中dha含量不夠高的缺陷。微藻中裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)dha的含量相對比較高，因此也被認(rèn)為是最有希望實(shí)現(xiàn)dha產(chǎn)業(yè)化的微生物。

目前國內(nèi)外有關(guān)如何提高dha含量的研究主要集中在以下幾方面：(1)尋找高產(chǎn)dha的新菌株；(2)改進(jìn)發(fā)酵工藝；(3)優(yōu)化培養(yǎng)基；(4)添加外源因子。如培育的海洋真菌裂殖壺菌ouc88生產(chǎn)的dha占總脂肪酸的含量提高到23％～44％；在另一干法制取dha微藻油的方法的研究中，該方法可在1l發(fā)酵液中提取最高達(dá)27.6gdha；在第三種提高dha含量的研究中，通過優(yōu)化裂殖弧菌菌株發(fā)酵培養(yǎng)基，使裂殖弧菌產(chǎn)生的dha占總脂肪酸含量達(dá)到35％；在第四種提高dha含量的研究中，通過外源添加因子促進(jìn)微生物合成dha的方法，該方法通過在培養(yǎng)基中添加一種以上乙酸、檸檬酸和辛伐他汀，使dha占總脂肪酸含量最高達(dá)到42.65％。以上研究雖然都以提高菌株中脂肪酸的dha含量為目的，但往往考慮因素單一，并未綜合探索如何大幅提高菌株中dha含量，使得生產(chǎn)dha的工藝復(fù)雜、成本增加，生產(chǎn)效率低，不利于實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌生產(chǎn)dha的產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種能快速生長且高效合成dha的裂殖壺菌tc5-2。

本發(fā)明實(shí)施例的另一目的是提供一種獲得裂殖壺菌tc5-2的誘變方法。

本發(fā)明實(shí)施例的又一目的是提供一種裂殖壺菌tc5-2生產(chǎn)dha的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種裂殖壺菌菌株，其分類名稱為裂殖壺菌(schizochytriumlimacinum)tc5-2，并已于2013年3月12日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為cctccno：m2013075。

以及，一種裂殖壺菌tc5-2的誘變方法，包括以下步驟：

將裂殖壺菌菌種擴(kuò)大培養(yǎng)得到種子液，將所述種子液接種至裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得對數(shù)生長期菌液；

將所述對數(shù)生長期菌液制成菌膜，并利用能量為10～30kev的n⁺離子束采用脈沖式對所述菌膜進(jìn)行誘變處理，其中，所述誘變處理過程中的n⁺離子束的注入劑量為50×10¹⁷～200×10¹⁷ions/cm²；

將經(jīng)誘變處理后的菌膜進(jìn)行培養(yǎng)、篩選出dha產(chǎn)量高的裂殖壺菌tc5-2。

以及，上述裂殖壺菌株tc5-2或按照上述裂殖壺菌tc5-2的誘變方法獲得裂殖壺菌tc5-2用于生產(chǎn)dha的應(yīng)用。

上述新型的裂殖壺菌tc5-2繁殖能力強(qiáng)，且遺傳性能穩(wěn)定，是高產(chǎn)dha的理想菌株。

上述裂殖壺菌tc5-2的誘變方法中，通過n⁺離子束注入方式獲得最佳誘變菌株tc5-2，該誘變方法簡單易實(shí)施，誘變所得菌株突變率高，遺傳性能穩(wěn)定。

上述裂殖壺菌株tc5-2用于生產(chǎn)dha，其應(yīng)用工藝簡單，條件易控，效率高，且能顯著提高總脂肪酸和dha的含量，有利于實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌生產(chǎn)dha的產(chǎn)業(yè)化。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例裂殖壺菌tc5-2的誘變方法工藝流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例裂殖壺菌tc5-2的菌體形態(tài)圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供一種裂殖壺菌菌株，其分類名稱為裂殖壺菌(schizochytriumlimacinum)tc5-2，并已于2013年3月12日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為cctccno：m2013075。該裂殖壺菌tc5-2的繁殖能力強(qiáng)，且遺傳性能穩(wěn)定，是高產(chǎn)dha的理想菌株。

相應(yīng)地，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種裂殖壺菌tc5-2的誘變方法，其誘變方法工藝流程如圖1所示，該方法包括以下步驟：

s01.裂殖壺菌出發(fā)菌株的培養(yǎng)：以誘變前的裂殖壺菌為出發(fā)菌株，將出發(fā)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)得到種子液，將所述種子液接種至裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得對數(shù)生長期菌液；

s02.采用離子束誘變：在無菌條件下，將步驟s01中的對數(shù)生長期菌液制成菌膜，并利用能量為10～30kev的n⁺離子束采用脈沖式對所述菌膜進(jìn)行誘變處理，其中，誘變處理過程中n⁺離子束的注入劑量為50×10¹⁷～200×10¹⁷ions/cm²；

s03.將經(jīng)誘變后的菌膜進(jìn)行培養(yǎng)、篩選處理：將步驟s02中誘變后的菌膜進(jìn)行培養(yǎng)、篩選出dha產(chǎn)量高的裂殖壺菌tc5-2。

上述步驟s01中，裂殖壺菌tc5-2的出發(fā)菌株可以選用已知的裂殖壺菌，優(yōu)選來源于廣西北海海灘紅樹林分離篩選所得的裂殖壺菌菌株。

該步驟s01中，該裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基可以直接選用現(xiàn)有裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)選為下述利用裂殖壺菌tc5-2生產(chǎn)dha的方法中使用的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基。通過對現(xiàn)有的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，本發(fā)明的裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，可促進(jìn)細(xì)胞的快速分裂和生長繁殖，顯著提高菌種的生長率和繁殖率。

上述步驟s02中，采用氮離子束注入方式誘變菌種，致使裂殖壺菌發(fā)生變異，且隨注入劑量的穩(wěn)定增加，致死率也呈緩慢增長的趨勢，見表1所示。優(yōu)選地，上述氮離子束注入劑量可以是50×10¹⁷、100×10¹⁷、150×10¹⁷、200×10¹⁷ions/cm²。

上述步驟s03中，將經(jīng)步驟s02離子束誘變處理的誘變菌種進(jìn)行編號篩選。具體篩選方法是將編號的誘變菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，比較各種誘變菌株生產(chǎn)dha的含量，選出dha產(chǎn)率最高的誘變菌種。經(jīng)篩選，發(fā)現(xiàn)裂殖壺菌tc5-2的dha產(chǎn)率最高，高達(dá)46.3％，因此選定裂殖壺菌tc5-2為最佳菌株，其菌體形態(tài)如圖2所示。

該步驟s03中，誘變菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)可以將該誘變菌種直接接種至上述s01中的現(xiàn)有裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，優(yōu)選直接接種至下述利用裂殖壺菌tc5-2生產(chǎn)dha的方法中使用的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

由上所述，上述裂殖壺菌tc5-2的誘變方法中，通過n⁺離子束注入方式獲得最佳誘變菌株tc5-2，該誘變方法簡單易實(shí)施，誘變所得菌株突變率高，遺傳性能穩(wěn)定。

相應(yīng)地，本發(fā)明實(shí)施例還提供裂殖壺菌tc5-2的應(yīng)用，具體是將裂殖壺菌tc5-2用于生產(chǎn)dha。

在具體實(shí)施例中，利用裂殖壺菌tc5-2生產(chǎn)dha的方法包括如下步驟：

將上述裂殖壺菌tc5-2接種至裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

作為優(yōu)選實(shí)施例，上述裂殖壺菌無菌發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下含量的組分：

上述無菌發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖，氮源為玉米漿、大豆蛋白胨和酵母膏。除此之外，培養(yǎng)基中還添加復(fù)配的人工海水，除利用海水中天然存在的無機(jī)鹽外，培養(yǎng)基另外再通過添加人造海水以提供充足的p源、s源以及mn²⁺、zn²⁺等離子，除保證一定的鹽度外，還保持細(xì)胞的滲透壓平衡，并為細(xì)胞的生長繁殖提供了必需物質(zhì)。

在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例中，上述人造海水包含如下含量的組分：

上述無菌發(fā)酵培養(yǎng)基還添加種類豐富的維生素。將各種功能不同的維生素混合后，共同參與機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)，從而適合更多的裂殖壺菌菌種生長，進(jìn)一步促進(jìn)裂殖壺菌中dha的積累。如本發(fā)明通過對比實(shí)驗(yàn)，即不添加復(fù)合維生素(對比實(shí)施例2)時(shí)，其dha含量與添加復(fù)合維生素(實(shí)施例6)相比，減少40.7％，表明復(fù)合維生素提高裂殖壺菌tc5-2的dha含量。

在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例中，上述復(fù)合維生素溶液包含如下含量的組分：

另外，上述培養(yǎng)基中還添加10～30μmol/l外源因子烯草酮。

該培養(yǎng)基中加入微量的烯草酮后，能有效提高裂殖壺菌tc5-2中脂肪酸和dha含量的積累。與不添加烯草酮(對比實(shí)施例3)相比，添加烯草酮(實(shí)施例6)的菌株dha含量增加48.33％，表明烯草酮對裂殖壺菌dha合成有促進(jìn)作用，能顯著提高裂殖壺菌中dha的含量。

作為優(yōu)選實(shí)施例，上述擴(kuò)大培養(yǎng)的條件可以按照其他裂殖壺菌常規(guī)的培養(yǎng)條件進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。但是為了提高dha的產(chǎn)率和效率，在優(yōu)選實(shí)施例中，該擴(kuò)大培養(yǎng)的條件為：在前40小時(shí)內(nèi)溫度為21-25℃，然后溫度控制為15-20℃。

在進(jìn)一步優(yōu)選實(shí)施例中，上述擴(kuò)大培養(yǎng)過程中的通氣量為0.5～2.0vvm，且該擴(kuò)大培養(yǎng)在氣升式反應(yīng)器中進(jìn)行。

這樣，上述擴(kuò)大培養(yǎng)優(yōu)選先在較高的培養(yǎng)溫度下提高細(xì)胞濃度，然后降低溫度以積累dha；同時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選使用氣升式反應(yīng)器顯著降低機(jī)械攪拌對菌體生長的抑制，便于dha的積累。另外，通入一定量的空氣有助于提高培養(yǎng)基中氧濃度，有利于異養(yǎng)需氧型的裂殖壺菌的生長和繁殖。

由上所述，上述裂殖壺菌tc5-2不僅經(jīng)優(yōu)化處理的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)添加外源因子烯草酮，并結(jié)合優(yōu)化的發(fā)酵工藝進(jìn)行dha的工業(yè)化生產(chǎn)，培養(yǎng)條件考慮全面，應(yīng)用工藝簡單，條件易控，效率高，且能顯著提高總脂肪酸和dha的含量，有利于該菌株及其應(yīng)用工藝的大力推廣。

現(xiàn)以裂殖壺菌tc5-2的誘變、篩選以及生產(chǎn)dha的方法為例，對本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

裂殖壺菌tc5-2的誘變，包括以下步驟：

s11.裂殖壺菌的培養(yǎng)：以誘變前的裂殖壺菌(廣西北海海灘紅樹林分離篩選所得的裂殖壺菌株)為出發(fā)菌株，挑選出發(fā)菌株的單菌落，在10ml液體無菌發(fā)酵培養(yǎng)基(無菌發(fā)酵培養(yǎng)基包含的成分為：人造海水600g/l；大豆蛋白胨30g/l；酵母膏40g/l；葡萄糖90g/l；玉米漿15g/l；復(fù)合維生素溶液5g/l；烯草酮20μmol/l。其中，人造海水配方為：nacl28g/l、mgcl25g/l、kcl1g/l、cacl21.5g/l、nahso46g/l、na2co38g/l、na2so410g/l、mgso43g/l、mnso45g/l、kh2po44g/l、k2hpo47g/l、znso43g/l；復(fù)合維生素溶液配方為：維生素b13g/l、維生素b210g/l、維生素b58g/l、維生素b64g/l、維生素pp10g/l、生物素12g/l、葉酸45g/l、肌醇4g/l。)試管中，25℃和150r/min條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)后，以10％接種量接種到裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基(同上)的三角瓶中，25℃和150r/min條件下振蕩培養(yǎng)36小時(shí)，即得對數(shù)生長期菌液；

s12.離子束誘變：在無菌條件下，往每個(gè)滅菌的空平皿里加入1ml上述對數(shù)生長期菌液，涂勻制成菌膜，將能量為20kev的n⁺離子束以雙等離子體源脈沖式注入由對數(shù)生長期菌液制成的菌膜中，其中注入劑量為下文表1中實(shí)施例1的劑量。

實(shí)施例2

裂殖壺菌tc5-2的誘變，該誘變參照實(shí)施例1的誘變步驟，其中，在s12的離子束誘變步驟中，雙等離子體源脈沖式注入由對數(shù)生長期菌液制成的菌膜中，注入劑量為下文表1中實(shí)施例2的劑量。

實(shí)施例3

裂殖壺菌tc5-2的誘變，該誘變參照實(shí)施例1的誘變步驟，其中，在s12的離子束誘變步驟中，雙等離子體源脈沖式注入由對數(shù)生長期菌液制成的菌膜中，注入劑量為下文表1中實(shí)施例3的劑量。

實(shí)施例4

裂殖壺菌tc5-2的誘變，該誘變參照實(shí)施例1的誘變步驟，其中，在s12的離子束誘變步驟中，雙等離子體源脈沖式注入由對數(shù)生長期菌液制成的菌膜中，注入劑量為下文表1中實(shí)施例4的劑量。

將實(shí)施例1-4誘變處理后的菌膜進(jìn)行致死率的測定，測定結(jié)果如表1所述：

表1

由表1可知，在注入劑量分別呈50、100、150、200×10¹⁷ions/cm²梯度遞進(jìn)的條件下，注入劑量與菌種的致死率保持類似正比增長的趨勢?？紤]到菌種的正負(fù)突變率，n⁺離子束注入劑量選定為100×10¹⁷ions/cm²。

實(shí)施例5

經(jīng)n⁺離子束誘變后的誘變菌種的篩選：

將按照上述實(shí)施例2的誘變方法處理后的誘變菌膜用9ml培養(yǎng)液洗出，然后分別稀釋涂平板。25℃條件下培養(yǎng)72小時(shí)，待長出菌落后，挑選菌落，并按照下表2中進(jìn)行編號，隨后搖瓶培養(yǎng)，72小時(shí)后檢測所得各個(gè)菌株的脂肪酸及dha，由此確定dha產(chǎn)量最高的誘變菌株。其中，經(jīng)72小時(shí)后各編號菌株的脂肪酸及dha的檢測結(jié)果見下表2。

表2

由表2可知，編號為tc5-2的誘變菌株dha產(chǎn)量最高，且總脂肪酸含量的產(chǎn)量也高，為生產(chǎn)dha的理想菌株。

實(shí)施例6

利用實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha。

將實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2接種至實(shí)施例1步驟s11中的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將接種后的培養(yǎng)基置于5l機(jī)械攪拌反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)從而發(fā)酵產(chǎn)dha，控制溫度20℃，控制攪拌速度200r/min,通氣量0.5vvm。培養(yǎng)60h后進(jìn)行檢測，菌株量達(dá)到32.3g/l，總脂肪酸含量達(dá)到56.3％，dha含量達(dá)到46.3％。

對比例1

將實(shí)施例1步驟s11的出發(fā)菌株不經(jīng)誘變處理直接按照實(shí)施例6的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)60h后進(jìn)行檢測，菌株量達(dá)到22.6g/l，總脂肪酸含量達(dá)到45.4％，dha含量達(dá)到38.2％。

比較實(shí)施例6與對比例1可知，出發(fā)菌株經(jīng)誘變處理，誘變后篩選出的裂殖壺菌tc5-2菌株量提高42.9％，總脂肪酸含量提高24.01％，dha含量提高21.2％，此數(shù)據(jù)表明在同樣的發(fā)酵條件下，氮離子束誘變獲得的裂殖壺菌tc5-2的菌株量、總脂肪酸含量以及dha含量都顯著提高。

對比例2

按照實(shí)施例6對裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha，與實(shí)施例6不同之處在于，無菌發(fā)酵培養(yǎng)基不含有5g/l的復(fù)合維生素溶液，即將實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2接種至如下無菌發(fā)酵培養(yǎng)基：

人造海水600g/l；大豆蛋白胨30g/l；酵母膏40g/l；葡萄糖90g/l；玉米漿15g/l；烯草酮20μmol/l。其中，人造海水配方為：nacl28g/l、mgcl25g/l、kcl1g/l、cacl21.5g/l、nahso46g/l、na2co38g/l、na2so410g/l、mgso43g/l、mnso45g/l、kh2po44g/l、k2hpo47g/l、znso43g/l。

培養(yǎng)60h后進(jìn)行檢測，菌體量達(dá)到15.3g/l，總脂肪酸含量達(dá)到32.5％，dha含量達(dá)到27.5％。與實(shí)施例6相比，其菌體量減少52.6％，總脂肪酸減少42.3％，dha含量減少40.7％，表明復(fù)合維生素溶液為裂殖壺菌提供豐富的營養(yǎng)環(huán)境，進(jìn)一步有利于裂殖壺菌tc5-2的dha含量的提高。

對比例3

按照實(shí)施例6對裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha，與實(shí)施例6不同之處在于，無菌發(fā)酵培養(yǎng)基不含烯草酮組分，即將實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2接種至如下無菌發(fā)酵培養(yǎng)基：

人造海水600g/l；大豆蛋白胨30g/l；酵母膏40g/l；葡萄糖90g/l；玉米漿15g/l；復(fù)合維生素溶液5g/l。其中，人造海水配方為：nacl28g/l、mgcl25g/l、kcl1g/l、cacl21.5g/l、nahso46g/l、na2co38g/l、na2so410g/l、mgso43g/l、mnso45g/l、kh2po44g/l、k2hpo47g/l、znso43g/l；復(fù)合維生素溶液配方為：維生素b13g/l、維生素b210g/l、維生素b58g/l、維生素b64g/l、維生素pp10g/l、生物素12g/l、葉酸45g/l、肌醇4g/l。

培養(yǎng)60h后進(jìn)行檢測，菌體量達(dá)到30.1g/l，總脂肪酸含量達(dá)到43.5％，dha含量達(dá)到31.2％。與實(shí)施例6相比，其菌體量減少6.81％，總脂肪酸減少22.74％，dha含量減少32.58％，表明外源因子烯草酮促進(jìn)裂殖壺菌tc5-2合成dha。

實(shí)施例7

按照實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha：采用機(jī)械攪拌反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)dha。

將實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2接種至實(shí)施例1步驟s11中的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將接種后的培養(yǎng)基置于5l機(jī)械攪拌反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)從而發(fā)酵產(chǎn)dha，控制溫度25℃，控制溶氧30％，通氣量1.5vvm。培養(yǎng)60h菌株量達(dá)到41.2g/l，總脂肪酸含量達(dá)到52.5％，dha含量達(dá)到45.8％。

將該實(shí)施例7與實(shí)施例6相比，本實(shí)施例的擴(kuò)大培養(yǎng)能使其菌體量增加27.55％，總脂肪酸減少6.75％，dha含量減少1.04％，表明適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度和通氣量能促進(jìn)細(xì)胞的生長和繁殖，但不利于總脂肪酸和dha的積累，這可能與高溫促進(jìn)細(xì)胞的繁殖但抑制dha的合成有關(guān)。

實(shí)施例8

利用實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha：采用氣升式反應(yīng)器發(fā)酵產(chǎn)dha。

將實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2接種至實(shí)施例1步驟s11中的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將接種后的培養(yǎng)基置于10l氣升式反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)從而發(fā)酵產(chǎn)dha，控制溫度25℃，通氣量1.5vvm。培養(yǎng)60h菌株量達(dá)到40.1g/l，總脂肪酸含量達(dá)到55.2％，dha含量達(dá)到49.2％。

將該實(shí)施例8與實(shí)施例7的機(jī)械攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)相比，其菌體量略微下降2.67％，但總脂肪酸增加5.14％，dha含量增加7.42％。表明氣升式反應(yīng)器發(fā)酵降低了機(jī)械攪拌的剪切力，有利于dha含量的積累。

實(shí)施例9

按照實(shí)施例8對裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha，與實(shí)施例8不同之處在于在擴(kuò)大培養(yǎng)中，控制溫度25℃，通氣量調(diào)至0.5vvm。培養(yǎng)60h菌株量達(dá)到35.2g/l，總脂肪酸含量達(dá)到48.4％，dha含量達(dá)到46.2％。

將該實(shí)施例9與實(shí)施例8相比，其菌體量減少12.22％，總脂肪酸減少12.32％，dha含量減少6.10％。表明單獨(dú)減小通氣量，會使菌體量、總脂肪酸以及dha含量同時(shí)減少。這是因?yàn)榱阎硥鼐鷮儆诋愷B(yǎng)需氧型微生物，減小通氣量抑制其細(xì)胞的生長速率，尤其是直接降低菌體量和總脂肪酸的含量。

實(shí)施例10

利用實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)用于提取dha：采用氣升式反應(yīng)器溫度變換控制發(fā)酵產(chǎn)dha

將實(shí)施例5中篩選的裂殖壺菌tc5-2接種至實(shí)施例1步驟s11中的無菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，并將接種后的培養(yǎng)基置于10l氣升式反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)從而發(fā)酵產(chǎn)dha，在培養(yǎng)過程中，前40小時(shí)控制溫度25℃，然后控制溫度15℃，通氣量2.0vvm。培養(yǎng)60h菌株量達(dá)到38.6g/l，總脂肪酸含量達(dá)到57.2％，dha含量達(dá)到52.4％。

將該實(shí)施例10與實(shí)施例8的恒溫培養(yǎng)相比，其菌體量略微下降2.67％，但總脂肪酸增加5.14％，dha含量增加7.42％。表明前期在較高的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)可提高細(xì)胞濃度，然后降低培養(yǎng)溫度有利于積累dha。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。