本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種利用pcr-dgge快速識別水產品中耐藥菌多樣性的方法。

背景技術：

我國是世界上抗生素的最大生產國與消費國，過量使用或濫用抗生素現(xiàn)象較為普遍.根據國家食品藥品監(jiān)督管理局的統(tǒng)計數據，我國每年人均消費抗生素138g，是美國人的10倍。

抗生素廣泛用于人類和動物(畜禽/魚)的疾病防治或動物的促進長，然而，長期過量使用或濫用抗生素會對環(huán)境和人類健康構成巨大的潛在威脅，這是因為大部分的抗生素以原藥及其代謝產物的方式隨人、畜禽和魚的排泄物最終進入自然環(huán)境，導致細菌耐藥性增強，甚至出現(xiàn)超級細菌，嚴重威脅人類健康。

在實際的生產生活中，為了達到某種目的獲得最大經濟效益，人們往往認為加大抗生素的用量可以減少養(yǎng)殖損失，甚至盲目的錯誤使用抗生素的種類，導致抗生素濫用現(xiàn)象越來越嚴重，不僅危害人類的健康，對生態(tài)環(huán)境也造成了不可估量的損害。抗生素的頻繁使用導致致病微生物的“偽耐久性”，會對水產動物和環(huán)境中細菌產生選擇性壓力，可能導致環(huán)境中的細菌成為耐藥菌?？股氐念l繁使用導致致病微生物的“偽耐久性”，在水環(huán)境中，可施加選擇性壓力使水產動物和環(huán)境產生耐藥菌。

抗菌藥物在水產養(yǎng)殖中應用不當或增加導致細菌抗菌素耐藥性的演變和傳播，細菌的耐藥性已經成為全球范圍內極其嚴重的公共衛(wèi)生安全問題，抗菌素耐藥性致病菌構成一近幾十年來最嚴重的威脅人類健康。

細菌產生對抗生素的耐藥性會增加治療成本，因為致病微生物的耐藥性會導致治療的失敗，人類和動物病原體的抗生素耐藥性的傳播成為關注的重點。水產品是食品鏈的一部分，抗生素可以因食物的生產加工以及人的腸胃道進行轉移交換，從而進行傳播。因此，從水產品中的分離病原菌并獲得其耐藥性和參數檢測對人類健康、海鮮質量保護非常重要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種pcr-dgge技術快速檢測水產品耐藥菌多樣性的方法，以實現(xiàn)對水產品中不同抗生素耐藥菌篩選。

本發(fā)明基于pcr-dgge的方法，可實現(xiàn)快速檢測水產品不同程度的耐藥菌多樣性。

技術方案為，先用不同類型和濃度的抗生素篩選，從水產樣品中分離耐藥性程度不同的耐藥菌，提取dna，根據細菌16srdnav3可變區(qū)設計一對通用引物進行pcr擴增，dgge電泳分離片段并回收；再次擴增后測序，可實現(xiàn)快速檢測水產品中耐藥菌多樣性。

快速檢測水產品中耐藥菌多樣性的方法，步驟包括：

(1)水產品樣品勻漿并涂布在含不同濃度、類型抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)；

(2)分別提取收集菌體，獲得水產品中的總菌及耐受不同濃度、類型抗生素的耐藥菌，并提取dna；

(3)pcr擴增并純化；

(4)dgge電泳和成像；

(5)回收目的條帶，獲取總菌和耐藥菌dna重新擴增并測序；

(6)分析測序結果，確定水產品樣品中篩選的總菌和耐藥菌特異性菌株，判斷不同選擇條件下水產品樣品的菌株及其多樣性。分析的方法包括：ncbiblast程序進行相似性分析、香農-威納指數分析以及pcoa分析等?？梢圆捎胵uantityone分析軟件，對樣品豐富度、均勻度進行分析。

步驟(1)中，水產品樣品與0.8％～0.9％nacl溶液按1：6～10重量比混合拍打勻漿后稀釋8～12倍，涂布于平板培養(yǎng)。35℃～38℃下培養(yǎng)18～24h；優(yōu)選的培養(yǎng)溫度為37℃。

步驟(1)中，抗生素的濃度梯度范圍為相應水產品ec50值的10％～300％，優(yōu)選為ec50值的25％～200％，更優(yōu)選為ec50值的50％～150％。

所述的抗生素為磺胺嘧啶、四環(huán)素、鏈霉素中的至少一種。

步驟(2)中，用0.8％～0.9％nacl洗滌平板，收集菌體。

步驟(3)中，根據細菌16srdnav3可變區(qū)設計一對通用引物進行pcr擴增，其中在上游引物5’末端添加一個30-40bp的gc發(fā)卡結構。優(yōu)選的，pcr擴增的引物為，341f-gc：5-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3及518r：5-attaccgcggctgctgg-3，即seqidno.1和seqidno.2。其中gc發(fā)卡結構的序列為5-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggg-3。

步驟(2)的pcr擴增條件為：93～95℃預變性3～7min；93～95℃變性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25個循環(huán)；93～95℃變性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12個循環(huán)；72℃延伸8～15min。

步驟(3)優(yōu)選的pcr擴增條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20個循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10個循環(huán)；72℃延伸10min。

步驟(4)中，dgge電泳條件為：聚丙烯酰胺凝膠濃度8％，凝膠變性梯度為35％～55％，變性方向與電泳方向一致；在電泳溫度為60℃、100v條件下電泳8～12h，優(yōu)選為10h。用sybrgreeni染色20min。照膠儀紫外燈下凝膠成像，并用軟件bio-radquantityone4.6進行圖像分析，其中每條dgge泳道代表總菌和不同濃度抗生素篩出的耐藥菌樣品，不同位置條帶代表不同的細菌，而條帶亮度反映細菌的相對量。變性劑為7mol/l尿素和40％體積濃度去離子甲酰胺。

步驟(5)中，將總菌和不同耐藥菌dgge圖譜中清晰的共性和特異條帶標記割膠回收并擴增。擴增的引物序列為：上游引物f341：5-cctacgggaggcagcag-3，下游引物r518：5-attaccgcggctgctgg-3。

步驟(5)擴增的條件為：93～95℃預變性3～7min；93～95℃變性25～35s，64～66℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，16～25個循環(huán)；93～95℃變性25～35s，54～56℃退火55s～1min，70～73℃延伸50s～1min，8～12個循環(huán)；72℃延伸8～15min。

優(yōu)選的，步驟(5)擴增條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20個循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10個循環(huán)；72℃延伸10min。

步驟(5)擴增后的產物與載體連接，并轉化感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆子進行測序。

步驟(6)中，對測序的結果利用ncbiblast程序進行相似性分析，確定從水產品樣品中篩出總菌和耐藥菌的特異性菌株；對照dgge圖譜可以看出條帶的數目、亮度、位置等特異型數據，從而獲得不同選擇條件下水產品中樣品的菌株及其多樣性。

本發(fā)明的一個具體實施方式中，水產品為南美白對蝦，用來篩選的抗生素為磺胺嘧啶、四環(huán)素、鏈霉素及其混合物。

本發(fā)明首先對水產品樣品中進行不同抗生素濃度的耐藥菌進行篩選，篩出不同程度的耐藥總菌，對于不同濃度篩出的耐藥菌其里面的菌株是多樣性的。為了探究所篩出的耐藥菌之間的差異性，通過pcr-dgge對其生物群落的多樣性和動力學變化具體分析，可以看出在不同選擇條件下水產品中樣品的菌株以及在不同抗生素濃度的選擇條件下菌株的多樣性。該方法具有成本低，易操作等優(yōu)點。

不同的水產品對抗生素的濃度的耐藥性不盡相同，而且不同的水產品中抗生素類型和用量不一樣，因而其菌種多樣性也不同；可以根據其機體對各類抗生素ec50值不同，調整選擇條件，篩選出不同的耐藥菌；因此本發(fā)明的方法可能被借鑒到其他水產品中，將其應用于耐藥菌多樣性的分析具有積極意義。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果：

1.能夠直觀的、快速的觀察到水產品中不同耐藥菌的種類和群落結構；

2.可實現(xiàn)對不同地方和不同來源的水產品中耐藥菌中生物群落的多樣性和動力學變化比較直觀的分析；

3.成本低、容易操作，可實現(xiàn)快速檢測水產品中耐藥菌多樣性。

附圖說明

圖1為南美白對蝦中細菌在不同濃度磺胺嘧啶、四環(huán)素、鏈霉素及多重耐藥情況下的耐藥率；

圖2為南美白對蝦在不同抗生素及其濃度下的總菌和耐藥菌dgge圖；

圖3為南美白對蝦在不同抗生素及其濃度下的總菌和耐藥菌香農-威納指數；

圖4為南美白對蝦在不同抗生素及其濃度下的總菌和耐藥菌主成分分析圖分析圖。

具體實施方式

實施例1

本實施例以南美白對蝦為實例，通過對南美白對蝦進行不同抗生素篩出耐藥菌，通過pcr-dgge對南美白對蝦中耐藥菌多樣性和動力學的研究，對其他水產品樣品中耐藥菌多樣性的研究提供一個參考。具體步驟為：

(1)樣品采集與處理：

從水產品市場采集南美白對蝦，每只大小10g左右。所采集的南美白對蝦置于已經準備好的冰盒上，于2小時內運輸到實驗室。

處理蝦之前，提前配制好含有不同濃度(分為低、中、高濃度)和不同抗生素的固體培養(yǎng)基(80ug/ml、160ug/ml、240ug/ml磺胺嘧啶；10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml四環(huán)素；3.5ug/ml，7ug/ml，10.5ug/ml鏈霉素；不同濃度多重抗生素(按低、中、高濃度混合上述抗生素)平板。其中中間濃度為水產品對抗生素的ec50值(ec50：藥物安全性指標，引起50％個體有效的劑量)。

在無菌的條件下，選取10g左右的南美白對蝦，與緩沖液(0.85％nacl)按1:9質量比混合，置于拍打機(bagmixer)拍打兩分鐘，把樣品盡量拍碎。將拍打好的組織勻漿液稀釋10倍，吸取100ul，分別涂布于不同抗生素濃度的胰蛋白胨大豆瓊脂(tsa，北京陸橋，中國)，37℃培養(yǎng)18-24h。

(2)總菌和耐藥菌dna收集與提?。?/p>

tsa平板和加不同濃度及類型抗生素的平板經過夜培養(yǎng)后，均生長有不同含量的單菌落(源自南美白對蝦)。分別用緩沖液(0.85％nacl)對這些平板進行洗板，盡量把所有菌洗掉，并于1.5ml離心管12000rpm、2min收集菌體，-20℃保存使用。

添加了抗生素的平板作為實驗組，以未添加抗生素的平板為對照組，兩組平板培養(yǎng)后進行對照，判斷菌株的耐藥率。

按照其說明書標準操作，用細菌基因組dna試劑盒(天根生物(北京)有限公司)，提取總菌和耐藥菌dna，提取的dna純度及含量用酶標儀(biotek，synergy2)檢測；a260/a280值在1.8～2.0之間，表明用該試劑盒提取的dna純度較高，-20℃保存使用。

(3)pcr擴增及純化：

根據細菌16srdnav3可變區(qū)設計一對通用引物，其中在上游引物5’末端添加一個30-40bp的gc發(fā)卡結構。上游引物為341f-gc：5-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3；下游引物為518r：5-attaccgcggctgctgg-3，即seqidno.1和seqidno.2。

用341f-gc和518r作為引物，對南美白對蝦中的總菌和耐藥菌dna進行pcr擴增。反應體系為：25μlpremixextap(takara,日本)，341f-gc(10μm)和518r(10μm)各2μl，模板dna2μl，去離子水補足50μl，pcr反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20個循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10個循環(huán)，72℃延伸10min，2％瓊脂糖電泳檢測pcr擴增產物。

(4)dgge成像：

pcr產物通過普通瓊脂糖跑膠確定條帶是否存在，之后pcr產物采用bio-raddcodetm突變檢測系統(tǒng)進行dgge凝膠電泳，其中凝膠梯度為35％～55％，通過脲-甲酰胺變性梯度[100％變性劑7m尿素和40％(vol/vol)去離子甲酰胺]的聚丙烯酰胺凝膠[8％(8g/100ml)丙烯酰胺-雙丙烯酰胺37.5:1]甲酰胺]，緩沖液為1×taebuffer。變性凝膠聚合30分鐘，然后16梳子從變性凝膠頂部間隙插入，并且注射5ml非變性膠。凝膠固化30分鐘后，將20ml的pcr產物加到每一個孔中，進行電泳，其中變性方向與電泳方向一致。

電泳條件：電泳溫度為60℃，100v電泳10h，sybrgreeni(1mlsybrgreeni加入10mlddh2o)染色20min，照膠儀紫外燈下凝膠成像，并用軟件bio-radquantityone4.6進行圖像分析，其中每條dgge泳道代表總菌和不同濃度抗生素篩出的耐藥菌樣品，不同位置條帶代表不同的細菌，而條帶亮度反映細菌的相對量。電泳圖譜如圖2所示，出現(xiàn)23個可鑒別條帶，分別用1～23標號。

(5)目的條帶割膠回收、克隆、測序：

將總菌和不同耐藥菌dgge圖譜中清晰的共性和特異條帶標記割膠回收(23個)，加20μl去離子水4℃過夜(盡量膠溶解)，隨后將溶解液作為模板進行擴增，所用引物為f341：5-cctacgggaggcagcag-3，r518：5-attaccgcggctgctgg-3，反應體系為25μlpremixextap(takara，日本)，341f(10μm)和518r(10μm)各2μl，模板dna2μl，去離子水補足50μl，pcr反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，65℃退火1min，72℃延伸1min，20個循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，10個循環(huán)，72℃延伸10min，將得到的pcr產物進行純化，與載體鏈接，轉化感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆子測序。

(6)陽性克隆子測序結果用ncbiblast程序進行相似性分析，確定從水產品樣品中篩出總菌和耐藥菌的特異性菌株；對獲得dgge圖譜可以看出條帶的數目、亮度、位置等特異型數據，可以看出在不同選擇條件下水產品中樣品的菌株以及在高濃度的選擇條件下菌株的多樣性。

使用quantityone分析軟件，分析樣品豐富度、均勻度、香農-威納指數，并進行pcoa分析。

添加了抗生素的平板作為實驗組，以未添加抗生素的平板為對照組，兩組平板培養(yǎng)后進行對照，判斷菌株的耐藥率。

分析結果如表1、表2和圖1～4所示：

圖1表示在不同抗生素及抗生素濃度下南美白對蝦中菌株耐藥率，從圖中可以看出，低抗生素濃度下，耐磺胺嘧啶和鏈霉素的菌株較多，耐四環(huán)素的菌株略少；同時在高抗生素濃度下，耐四環(huán)素的菌株較耐磺胺嘧啶和鏈霉素的菌株多；對于在多重耐藥的情況下，無論在哪種濃度下，耐藥菌株在多重抗生素的壓力下，其菌株數量是減少了。以上說明，在不同的選擇壓力下，耐藥菌的數量的不同。

圖2是在不同抗生素及抗生素濃度下南美白對蝦中耐藥菌dgge圖譜，每條dgge用到代表的是不同抗生素及不同濃度下耐藥菌的平均狀態(tài)，其中m:marker,本實驗所設置的一個標線，從上到下分別為單增李斯特菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌，a：樣品中總菌；s1：80mg/ml磺胺嘧啶，s2：160mg/ml磺胺嘧啶，s3：240mg/ml磺胺嘧啶；t1：10mg/ml四環(huán)素，t2：20mg/ml四環(huán)素，t3：30mg/ml四環(huán)素；l1：3.5mg/ml鏈霉素，l2：7mg/ml鏈霉素，l3：10.5mg/ml鏈霉素，d1，d2，d3代表三種抗生素在不同濃度下篩出的多重耐藥菌。不同位置的條帶代表不同的細菌，而條帶的亮度反映細菌的相對量。結果顯示：同一磺胺嘧啶抗生素篩選出的耐藥菌條帶的位置和亮度大致差不多，但是低濃度的抗生素細菌數量稍微多于高濃度的細菌數量。耐四環(huán)素細菌在10mg/ml，20mg/ml，30mg/ml濃度下，其耐藥菌dgge圖譜數量、位置和亮度一致；耐鏈霉素耐藥菌在7mg/ml和10.5mg/ml濃度下其dgge圖譜數量、位置和亮度一致。然而由四環(huán)素、鏈霉素、磺胺嘧啶篩出的多重耐藥菌株，其dgge圖譜數量、位置明顯和單一抗生素篩出的菌株不一樣。以上結果說明，不同抗生素篩出的菌株，其耐藥菌是多樣的。

圖3為南美白對蝦在不同抗生素及其濃度下的總菌和耐藥菌的香農-威納指數，從圖3中我們可以看出，未加抗生素篩出的細菌比加抗生素篩出的耐藥菌多樣性指數多，同時含有多種抗生素篩出的耐藥菌多樣性指數少?？梢哉f明，耐藥性強，其多樣性指數低，耐藥性弱，其多樣性指數高。

圖4是南美白對蝦在不同抗生素及其濃度下的總菌和耐藥菌dgge圖譜的pcoa分析結果。樣品之間的距離代表了他們的差異大小，1：南美白對蝦中總菌；2、3、4：分別代表80mg/m、160mg/ml、240mg/ml磺胺嘧啶篩出的耐藥菌；5、6、7：代表10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml四環(huán)素篩出的耐藥菌；8、9、10：代表3.5mg/ml、7mg/ml、10.5mg/ml鏈霉素篩出的耐藥菌；11、12、13：代表三種抗生素在低濃度、中等濃度、高濃度下篩出的多重耐藥菌。主成分因子1(pc1)的貢獻率37％，主成分因子2(pc2)的貢獻率23.7％。pcoa是分析樣品dgge圖譜的相對強度，可以發(fā)現(xiàn)同一類抗生素篩選的耐藥菌都出現(xiàn)聚類的情況，耐鏈霉素的耐藥菌除外，這種方法可以表明該方法可以準確的揭示蝦中耐藥菌的多樣性，從而能夠監(jiān)測和改善耐藥菌多樣性的準確性。

表1為南美白對蝦中耐藥菌dgge特征帶基因片段序列的比對結果。從圖2和表1均可以看出，dgge圖譜上產生23條可鑒別條帶，其中包括弧菌屬(6個)，乳球菌屬(2個)，氣單胞菌屬(10個)，假交替單胞菌(1個)，志賀式桿菌(1個)，阪崎桿菌屬(1個)，芽孢桿菌屬(1個)，埃希氏桿菌屬(1個)?；前粪奏ずY選的細菌為弧菌屬(3個)，乳球菌屬(1個)，氣單胞菌屬(5個)，芽孢桿菌屬(1個)，假交替單胞菌(1個)，志賀式桿菌(1個)、埃希氏桿菌屬(1個)、阪崎桿菌屬(1個)；四環(huán)素篩出的耐藥細菌為：弧菌屬(2個)、氣單胞菌屬(4個)、假交替單胞菌(1個)、志賀式桿菌(1個)、埃希氏桿菌屬(1個)、阪崎桿菌屬(1個)；鏈霉素篩出的耐藥細菌為：弧菌屬(1個)、乳球菌屬(1個)、氣單胞菌屬(4個)、志賀式桿菌(1個)、埃希氏桿菌屬(1個)、阪崎桿菌屬(1個)；多重耐藥：乳球菌素(1個)，氣單胞菌屬(4個)，芽孢桿菌屬(1個)。其中未加抗生素的樣品中，這些菌種都有。由于其每種耐藥菌所耐受的抗生素不同，所以其菌株是多樣性的，其中芽孢桿菌屬在四環(huán)素類耐藥菌沒有出現(xiàn)，說明在抗生素的選擇方面，其菌株變化是多樣性的。

表2為在不同抗生素及其濃度下，南美白對蝦中總菌和耐藥菌的豐富度。(豐富度代表dgge圖譜中，每個甬道的條帶數；條帶多，說明其物種在細菌水平上比較豐富)。表2顯示，通過抗生素篩出的細菌，其豐富度明顯比未通過抗生素篩選的要少；同時，同一抗生素篩出的細菌，豐富度差不多，濃度對于耐藥菌篩選沒有影響(除了鏈霉素篩選的細菌)；耐抗生素的種類越多，其豐富度越少。

表1南美白對蝦中耐藥菌dgge特征帶基因片段序列的比對結果

表2在不同抗生素及其濃度下，南美白對蝦中總菌和耐藥菌的豐富度

sequencelisting

<110>上海海洋大學

<120>一種快速檢測水產品中耐藥菌多樣性的方法

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