本發(fā)明屬于食品病害微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)法。
背景技術(shù)：
：副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，vp)是革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，隸屬弧菌科中的弧菌屬。它是近海的魚類、蝦類、蟹類、貝類等海產(chǎn)品中的重要的食源性致病菌之一，屬人畜共患病菌，在水產(chǎn)品中的污染狀況非常嚴(yán)重，是沿海地區(qū)食物中毒和夏季腹瀉的重要病原菌。為確保食品安全，保護(hù)人民身體健康，歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌做出了明確的規(guī)定，如歐盟規(guī)定副溶血性弧菌不得檢出，而美國(guó)規(guī)定＜1×104/g。我國(guó)已將該菌列為主要的檢驗(yàn)或監(jiān)測(cè)對(duì)象。目前，該菌是多數(shù)進(jìn)出口水產(chǎn)品必檢的致病菌之一。自2001年以來(lái)，副溶血性弧菌性食物中毒爆發(fā)已經(jīng)成為中國(guó)最常見的食源性疾患，副溶血性弧菌性食物中毒的起數(shù)和人數(shù)一直處于第一位。使用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法即非選擇性和選擇性增菌、生長(zhǎng)法及血清學(xué)鑒定雖然比較準(zhǔn)確，但檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大，繁瑣費(fèi)時(shí)。不僅如此，低水平的病原菌污染，食品加工后導(dǎo)致菌體的“致傷”及食品其它成分的干擾等因素，使得傳統(tǒng)的檢測(cè)方法受到了一定的限制，因此，急需一些靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快捷的水產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)致病微生物，控制污染及其可能對(duì)人體健康產(chǎn)生的危害?？萍紕?chuàng)新產(chǎn)生了一系列新型的檢測(cè)方法，如核酸分子擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)、免疫檢測(cè)、生物傳感等技術(shù)，為微生物、病毒的檢測(cè)提供了新的手段，在食品安全檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。免疫熒光技術(shù)(fat)、酶聯(lián)免疫吸附(elisa)、分子檢測(cè)技術(shù)(pcr、rflp、aflp、rapd等)已經(jīng)被用來(lái)檢測(cè)各種水產(chǎn)病原。盡管目前已有多種微生物的檢測(cè)方法，但大多需要較高的實(shí)驗(yàn)室條件，且操作復(fù)雜、耗時(shí)，只有熟練掌握了其操作技巧的人員才能完成測(cè)試，不適合在基層推廣和使用，在發(fā)展中國(guó)家及我國(guó)臨床條件有限的地區(qū)應(yīng)用受到限制。因此，有必要建立水產(chǎn)品中副溶血性弧菌經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)診斷方法，提高醫(yī)學(xué)衛(wèi)生檢驗(yàn)、疾病防控、水產(chǎn)品加工和進(jìn)出口檢驗(yàn)等部門的檢測(cè)質(zhì)量和效率。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(isothermalnucleicacidamplificationtechnology)可在某一特定的溫度下擴(kuò)大特定dna或rna片段的拷貝數(shù)。與常規(guī)pcr技術(shù)相比，在遺傳相關(guān)疾病和微生物檢測(cè)中，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可通過(guò)加熱模塊、水浴槽等簡(jiǎn)單非專業(yè)設(shè)備完成，對(duì)儀器要求大大簡(jiǎn)化，反應(yīng)時(shí)間大幅縮短，因而更能滿足現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)“快速簡(jiǎn)便”的需求，具有非常大的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前利用納米金探針作為特異dna識(shí)別的研究層出不窮。納米金因其高的比表面積、穩(wěn)定的表面物理化學(xué)性質(zhì)，特別適合作為分子識(shí)別反應(yīng)的界面。將大量的識(shí)別分子固定在納米金表面，可實(shí)現(xiàn)一系列的反應(yīng)信號(hào)放大功能。此外，由于納米金具有獨(dú)特的等離子體共振光學(xué)性質(zhì)，并隨粒子形貌、表面修飾物、粒子間距、溶劑介電常數(shù)變化，表現(xiàn)為溶液顏色的顯著改變，為實(shí)現(xiàn)基于納米金探針的簡(jiǎn)便、靈敏、快速可視化分析提供了理論基礎(chǔ)，使得構(gòu)建一系列的溶液內(nèi)納米傳感過(guò)程成為可能。基于此，本發(fā)明將近年最新發(fā)展起來(lái)的新型的分子擴(kuò)增反應(yīng)(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法)與具有優(yōu)異的表面特性與光學(xué)性能的納米材料(納米金)結(jié)合起來(lái)，開發(fā)可現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)副溶血性弧菌的檢測(cè)方法。已有的等溫分子擴(kuò)增方法多依靠熒光比色檢測(cè)手段，擴(kuò)增時(shí)間較長(zhǎng)，且多為有毒化學(xué)探針，本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了直接的可視化檢測(cè)結(jié)果判定，并提高了對(duì)分子擴(kuò)增反應(yīng)的響應(yīng)靈敏度，縮短了檢測(cè)時(shí)間，擺脫了對(duì)熒光比色試劑以及熒光檢測(cè)儀器的依賴性，可大幅降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)操作的安全性能。服務(wù)于水產(chǎn)品質(zhì)量安全與疾病防控等領(lǐng)域，并為其他特定的病原微生物在食品質(zhì)量安全與疾病防控檢測(cè)手段提供技術(shù)參考。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)快速簡(jiǎn)便檢測(cè)副溶血性弧菌的需求，提供了一種基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)法。具體來(lái)說(shuō)，是提供一種基于納米金與等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)副溶血性弧菌tlh基因的試劑及其制備方法，并提供基于該試劑在快速可視化檢測(cè)中的應(yīng)用方法。建立了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)診斷方法，提高醫(yī)學(xué)衛(wèi)生檢驗(yàn)、疾病防控、水產(chǎn)品加工和進(jìn)出口檢驗(yàn)等部門的檢測(cè)質(zhì)量和效率。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明涉及一種基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：s1、制備鏈霉親和素標(biāo)記的納米金；s2、對(duì)樣品進(jìn)行采集、增菌后，提取dna；s3、以所述dna為擴(kuò)增模板進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；s4、取所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米金加入步驟s3擴(kuò)增完成的反應(yīng)溶液體系，反應(yīng)后觀察反應(yīng)體系溶液；如反應(yīng)體系溶液產(chǎn)生明顯的由紅向藍(lán)的變化過(guò)程，則代表樣品中檢測(cè)出了副溶血性弧菌，如反應(yīng)體系溶液未發(fā)生由紅向藍(lán)的變色過(guò)程，則代表樣品中無(wú)副溶血性弧菌。優(yōu)選的，步驟s1中，鏈霉親和素標(biāo)記的納米金的制備包括如下步驟：a1、調(diào)節(jié)納米金溶液在450nm處的吸光度值在1.5～2.0；a2、以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液將納米金溶液調(diào)節(jié)至ph＝7～8；a3、將鏈霉親和素稀釋成一系列5-40μg/ml溶液，每1ml的納米金溶液中分別加入0.1ml，混勻靜置后，加入0.1ml10％的nacl溶液，混勻靜置，隨著鏈霉親和素的用量的增加，納米金溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色；選擇由藍(lán)色變?yōu)榧t色的鏈霉親和素用量1.1倍作為最佳蛋白標(biāo)記比例；a4、每10ml的經(jīng)步驟a1和a2調(diào)節(jié)好的納米金溶液中，加入所述最佳蛋白標(biāo)記比例的鏈霉親和素溶液，混勻后加入0.1ml10％peg20000溶液再次混勻；a5、離心分離后，將底層懸浮液用0.5mg/mlpeg20000溶液重新離心沉淀，恢復(fù)后加入0.1mg/ml疊氮化鈉后冷藏保存待用。優(yōu)選的，步驟s2中，所述采集、增菌具體為：以無(wú)菌操作取樣品可食部分每25g，加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225ml，均質(zhì)處理，制備成1∶10的樣品勻液，于36℃±1℃培養(yǎng)，得增菌液。優(yōu)選的，步驟s2中，所述提取包括：將過(guò)夜培養(yǎng)的增菌液混勻后靜置，吸取菌懸液每5ml，加入無(wú)菌離心管中，以8000～12000r/min離心，棄去上清液，加入0.5～2mltz裂解液懸浮菌體。優(yōu)選的，所述tz裂解液的配制包括：2.0％tritonx-100，2.5mg/ml的疊氮化鈉，0.1mol/ltris-hc1緩沖液，ph8.0；沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min離心5min，冷凍保存待用。優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增中采用的針對(duì)副溶血性弧菌的tlh基因的特異性標(biāo)記引物的序列如seqidno.1～seqidno.4所示；采用的針對(duì)副溶血性弧菌的tlh基因的探針的序列如seqidno.5、seqidno.6所示.優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系總體積為40μl，除所述引物和探針序列外，還包括如下試劑：各2.0μmol/l的fip和bip、各0.3μmol/l的f3和b3、1μmol/llf和lb、1×恒溫緩沖液(tris-hcl，20mm，ph8.8)、1.2mol/l的甜菜堿、7mmol/l的mgso4、2.0mmol/l的dntp、5u/μl的bst大片斷dna聚合酶和2μldna模板。優(yōu)選的，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系于62℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，最后在85℃下5min使擴(kuò)增酶失活。優(yōu)選的，步驟s3還包括，以副溶血性弧菌的tlh基因標(biāo)準(zhǔn)dna模板作為陽(yáng)性模板對(duì)照，以無(wú)菌水作為陰性模板對(duì)照同時(shí)進(jìn)行所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。優(yōu)選的，步驟s4中，每20～100μl步驟s3擴(kuò)增完成的反應(yīng)溶液體系中加入的所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米金為10～50μl。第二方面，本發(fā)明涉及一種用于所述的基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)方法中的試劑，所述試劑為鏈霉親和素標(biāo)記的納米金；所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米金的制備包括如下步驟：a1、調(diào)節(jié)納米金溶液在450nm處的吸光度值在1.5～2.0；a2、以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液將納米金溶液調(diào)節(jié)至ph＝7～8：a3、將鏈霉親和素稀釋成一系列5-40μg/ml溶液，每1ml的納米金溶液中分別加入0.1ml，混勻靜置后，加入0.1ml10％的nacl溶液，混勻靜置，隨著鏈霉親和素的用量的增加，納米金溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色；選擇由藍(lán)色變?yōu)榧t色的鏈霉親和素用量1.1倍作為最佳蛋白標(biāo)記比例；a4、每10ml的經(jīng)步驟a1和a2調(diào)節(jié)好的納米金溶液中，加入所述最佳蛋白標(biāo)記比例的鏈霉親和素溶液，混勻后加入0.1ml10％peg20000溶液再次混勻；a5、離心分離后，將底層懸浮液用0.5mg/mlpeg20000溶液重新離心沉淀，恢復(fù)后加入0.1mg/ml疊氮化鈉后冷藏保存待用。第三方面，本發(fā)明涉及一種用于所述的基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)方法中的針對(duì)副溶血性弧菌的tlh基因的特異性標(biāo)記引物和探針，所述引物的序列如seqidno.1～seqidno.4所示；所述探針的序列如seqidno.5、seqidno.6所示。本發(fā)明以納米金表面構(gòu)建生物素-鏈霉親和素識(shí)別過(guò)程，結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)技術(shù)構(gòu)建副溶血性弧菌的tlh基因的檢測(cè)方法，進(jìn)一步建立可視化納米傳感比色檢測(cè)方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1)高靈敏度：對(duì)含tlh基因的副溶血性弧菌的檢測(cè)靈敏度達(dá)到10cfu/ul；2)檢測(cè)時(shí)間短：可在30min內(nèi)實(shí)現(xiàn)分子擴(kuò)增與檢測(cè)過(guò)程，大大提高了檢測(cè)效率；3)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單：僅需要恒溫水浴儀器。與傳統(tǒng)pcr方法相比，免除了對(duì)復(fù)雜的溫度循環(huán)與熒光檢測(cè)儀器的依賴；4)操作簡(jiǎn)便，安全。模板制備可通過(guò)簡(jiǎn)單的水煮法完成，不需純化，各反應(yīng)試劑可在混合后，通過(guò)簡(jiǎn)單的冷凍干燥后穩(wěn)定保存。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不需要較嚴(yán)格的技術(shù)培訓(xùn)即可實(shí)現(xiàn)。且檢測(cè)過(guò)程不需要接觸eb等有毒核酸檢測(cè)試劑，保證了操作人員的安全。附圖說(shuō)明圖1為納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增基因檢測(cè)過(guò)程示意圖；圖2為實(shí)際檢測(cè)結(jié)果陰性(a)與陽(yáng)性(b)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)生物素標(biāo)記的tlh基因的引物，以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速擴(kuò)增tlh基因，擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生的大量的具有生物素標(biāo)記重復(fù)序列，將鏈霉親和素修飾的納米金快速聚集，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色變化效應(yīng)，達(dá)到對(duì)特定基因檢測(cè)的目的(檢測(cè)原理見附圖1)。實(shí)施例本實(shí)施例涉及一種基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)法；具體包括如下步驟：1.納米金的制備在燒瓶中將50ml的254μm(0.01％wt)的氯金酸溶液加熱至劇烈沸騰并攪拌，將500μl的388mm的檸檬酸三鈉溶液加入正在沸騰攪拌的溶液中，2min內(nèi)溶液的顏色從黃色變?yōu)榧t色，繼續(xù)沸騰攪拌15min后，停止加熱，繼續(xù)攪拌直至反應(yīng)液回到室溫，將反應(yīng)液通過(guò)0.8μm的gelman濾膜過(guò)濾，得到酒紅色的納米金，通過(guò)紫外可見光譜測(cè)量其吸收峰在527nm。將制備好納米金存儲(chǔ)在棕色瓶中，于冰箱中在4℃條件下保存，通常在一個(gè)月內(nèi)用完。2.鏈霉親和素修飾的納米金(strepavidin-aunp)。2.1.調(diào)節(jié)納米金溶液在450nm處的吸光度值在1.5-2.0之間。2.2.調(diào)節(jié)納米金ph值。以0.1mol/l的k2co3或0.1mol/l的hcl溶液將納米金溶液調(diào)節(jié)至ph＝7-8。優(yōu)選7.4。2.3.確定鏈霉親和素與納米金的最佳使用量。將鏈霉親和素稀釋成一系列5-40μg/ml溶液，分別取0.1ml加到1ml的納米金溶液中，混勻靜置5min后，加入0.1ml10wt％的nacl溶液，混勻靜置2h，隨著鏈霉親和素的用量的增加，納米金溶液由藍(lán)色變?yōu)榧t色。選擇由藍(lán)色變?yōu)榧t色的鏈霉親和素用量1.1倍作為最佳蛋白標(biāo)記比例。2.4.標(biāo)記鏈霉親和素。于10ml的濃度與ph值調(diào)節(jié)好的納米金溶液中，加入最佳比例的鏈霉親和素溶液，混勻2-3min，加入0.1ml10wt％peg20000溶液混勻。2.5.分離。在10000×g離心力下離心30min，吸取上清液倒掉。將底層懸浮液中加入3ml含有0.5mg/mlpeg20000溶液中，重新離心沉淀，同一溶液恢復(fù)，加入0.1mg/ml疊氮化鈉后冷藏保存待用。3.樣品采集及增菌參考國(guó)標(biāo)gb4789.7-2013取樣及增菌方法。以無(wú)菌操作取樣品可食部分25g，加入3％氯化鈉堿性蛋白胨水225ml，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min均質(zhì)1min，制備成1∶10的樣品勻液，于36℃±1℃培養(yǎng)16h。4.dna的提取制備將過(guò)夜培養(yǎng)的增菌液混勻后靜置5min，吸取菌懸液5ml，加入10ml無(wú)菌離心管中，以8000r/min離心2min，棄去上清液，加入1mltz裂解液懸浮菌體。tz裂解液配制：2.0％tritonx-100，2.5mg/ml的疊氮化鈉，0.1mol/ltris-hc1緩沖液，ph8.0。沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min離心5min，上清即為擴(kuò)增模板，冷凍保存待用。5.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增針對(duì)副溶血性弧菌的tlh基因的特異性標(biāo)記引物，其序列(5’-3’)如下：引物片段1(tlh-f3)：gcgcaaggttacaacatcacseqidno.1引物片段2(tlh-b3)：gcgtgacattccagaacacaseqidno.2artificialsequence引物片段3(tlh-fip)：cgcgttcacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcgaseqidno.3引物片段4(tlh-bip)：ttggacatcaaccgctcatcgtgacgctgcacactcagagseqidno.4探針：5’修飾引物片段5(tlh-lf)：tcgggcgcagaagttagc-5’biotintegseqidno.5artificialsequence5’修飾引物片段6(tlh-lb)：ctgtcgattacatgtacacccac-5’biotintegseqidno.6上述引物和探針為用于；過(guò)程對(duì)tlh基因的擴(kuò)增的試劑。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增體系總體積為40μl，除上述引物和探針序列外，還包括如下試劑：各2.0μmol/l的fip和bip、各0.3μmol/l的f3和b3、1μmol/llf和lb、1×恒溫緩沖液(tris-hcl，20mm，ph8.8)、1.2mol/l的甜菜堿、7mmol/l的mgso4、2.0mmol/l的dntp、5u/μl的bst大片斷dna聚合酶和2μldna模板。進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增時(shí)，樣品進(jìn)行3份重復(fù)，以副溶血性弧菌的tlh基因標(biāo)準(zhǔn)dna模板以及無(wú)菌水作為陽(yáng)性和陰性模板對(duì)照同時(shí)進(jìn)行，以確定進(jìn)行擴(kuò)增方法的可靠性。上述反應(yīng)體系置于62℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，最后在85℃下5min使擴(kuò)增酶失活，結(jié)束反應(yīng)。并通過(guò)以超純水和已知tlh基因的dna模板代替由實(shí)際樣品中提取出dna模板，反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照反應(yīng)，防止擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)的可能的交叉污染。6.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)取20μl的鏈霉親和素標(biāo)記的納米金探針加入擴(kuò)增完成的反應(yīng)溶液體系，震搖反應(yīng)2min后，由于引物片段tlh-lf、tlh-lb在擴(kuò)增過(guò)程中同時(shí)插入了dna聚集體，其5’端修飾的biotin-teg對(duì)鏈霉親和素標(biāo)記的納米金探針具有強(qiáng)烈的親和性能，故反應(yīng)體系中存在大量的dna擴(kuò)增聚集體時(shí)，鏈霉親和素標(biāo)記的納米金探針將結(jié)合在該dna擴(kuò)增聚集體上，反應(yīng)體系溶液產(chǎn)生明顯的由紅向藍(lán)的變化過(guò)程，指示了反應(yīng)體系的擴(kuò)增過(guò)程，證明了樣品中tlh基因的存在，檢測(cè)了含有tlh基因的副溶血性弧菌。如混合溶液未發(fā)生由紅向藍(lán)的變色過(guò)程，則證明樣品中無(wú)副溶血性弧菌(圖2)。進(jìn)行結(jié)果判定的同時(shí)，需以檢測(cè)體系中陽(yáng)性以及陰性對(duì)照管分別發(fā)生和不發(fā)生變色過(guò)程為前提，以保證整個(gè)檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行了良好的質(zhì)控。7.檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)分別以過(guò)夜培養(yǎng)的純的副溶血弧菌(atcc17802)、大腸桿菌(atcc25922)、金黃色葡萄球菌(atcc29213)、單增李斯特菌(atcc15313)、創(chuàng)傷弧菌(atcc27562)的菌懸液進(jìn)行dna模板的提取。用所建立的副溶血弧菌擴(kuò)增以及檢測(cè)方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。以無(wú)菌水代替細(xì)菌dna模板作為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如下表1：表1菌種名稱編碼tlh基因檢測(cè)結(jié)果副溶血弧菌atcc17802+大腸桿菌atcc25922-金黃色葡萄球菌atcc29213-單增李斯特菌atcc15313-創(chuàng)傷弧菌atcc27562-8.方法靈敏度將過(guò)夜培養(yǎng)的副溶血弧菌atcc17802菌懸液以無(wú)菌水進(jìn)行10倍稀釋至10-1～10-8，取各稀釋度菌液100μl進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3份試驗(yàn)。同時(shí)，取各稀釋度菌液1ml提取dna作為模板進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。每個(gè)稀釋度進(jìn)行3份試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其穩(wěn)定性和檢測(cè)靈敏度。以無(wú)菌水代替細(xì)菌dna模板作為陰性對(duì)照，通過(guò)平板計(jì)數(shù)的結(jié)果來(lái)確定等溫?cái)U(kuò)增方法最低檢測(cè)限，當(dāng)3份平行樣品均呈陽(yáng)性時(shí)的最大稀釋倍數(shù)的細(xì)菌濃度作為其最低檢測(cè)限。其檢測(cè)結(jié)果如下表2：表2以上結(jié)果證明本方法對(duì)副溶血性弧菌的檢測(cè)限在100-1000cfu/ml之間，相當(dāng)于每2ul中2-20個(gè)dna模板，顯示了方法的優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度。9.水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)應(yīng)用驗(yàn)證隨機(jī)采集水產(chǎn)品市場(chǎng)的文蛤樣品3份，經(jīng)國(guó)標(biāo)gb4789.7-2013和本發(fā)明建立方法檢測(cè)驗(yàn)證均不含副溶血性弧菌作為空白樣品。將過(guò)夜接種培養(yǎng)的副溶血弧菌(atcc17802)的菌懸液100ul分別加入3份空白樣品的勻漿中，經(jīng)國(guó)標(biāo)gb4789.7-2013和本發(fā)明建立方法檢測(cè)驗(yàn)證副溶血性弧菌均為陽(yáng)性。從市場(chǎng)上采集扇貝、文蛤、牡蠣、對(duì)蝦樣品30個(gè)，采用本發(fā)明建立方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)參考國(guó)標(biāo)gb4789.7-2013方法對(duì)樣品進(jìn)行定性鑒定。采用本發(fā)明方法檢出陽(yáng)性樣品6個(gè)，與國(guó)標(biāo)gb4789.7-2013方法檢測(cè)結(jié)果一致。而且，本發(fā)明方法檢測(cè)時(shí)間可由12小時(shí)以上大幅縮短1小時(shí)內(nèi)，操作過(guò)程簡(jiǎn)化，耗費(fèi)試劑量很少，大大減少了人力物力的消耗。以上結(jié)果很好的驗(yàn)證了本發(fā)明方法的應(yīng)用可行性。綜上所述，本發(fā)明建立了新型比色檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物病原微生物的方法、提高環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。為快速檢測(cè)與鑒定水產(chǎn)品中病原微生物、有效及時(shí)控制和預(yù)防疾病傳播、預(yù)防食用水產(chǎn)品中毒提供技術(shù)支持，適合在邊境口岸、食品廠、基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)中進(jìn)行快速檢測(cè)，對(duì)有效控制水產(chǎn)品中病原微生物的傳播和早期診斷，保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全意義重大，具有廣闊的應(yīng)用前景。該發(fā)明可望應(yīng)用于水產(chǎn)品生產(chǎn)、流通和消費(fèi)領(lǐng)域的快速檢測(cè)微生物，并可望在食品質(zhì)量安全檢測(cè)部門用于大量樣品中污染樣品的快速篩選工作。sequencelisting<110>中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所<120>基于納米金變色響應(yīng)等溫核酸擴(kuò)增的副溶血性弧菌檢測(cè)法<130>2017<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-f3<400>1gcgcaaggttacaacatcac20<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-b3<400>2gcgtgacattccagaacaca20<210>3<211>40<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-fip<400>3cgcgttcacgaaaccgtgctgatactcacgccttgttcga40<210>4<211>40<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-bip<400>4ttggacatcaaccgctcatcgtgacgctgcacactcagag40<210>5<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-lf<400>5tcgggcgcagaagttagc18<210>6<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>tlh-lb<400>6ctgtcgattacatgtacacccac23當(dāng)前第1頁(yè)12