本發(fā)明涉及一種等溫快速擴(kuò)增檢測(cè)食品中致病菌的方法,屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
近年來(lái),在全球化背景下,伴隨著全球食品貿(mào)易迅速增長(zhǎng),人口的全球流動(dòng),以及耐藥型菌株的出現(xiàn),食源性疾病的發(fā)生率和致死率都在逐漸提升,并成為全世界食品安全與公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重要問(wèn)題。通過(guò)污染的食物或水進(jìn)行傳播并引發(fā)食源性疾病的微生物(包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲(chóng))被稱為食源性致病微生物。在國(guó)外,由致病微生物引起的食源性疾病案例中,主要的致病因素是致病性細(xì)菌(或稱食源性致病菌),最常見(jiàn)的食源性致病菌包括腸出血性大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌、蠟樣芽胞桿菌以及多種弧菌等等。在我國(guó),從2014年7月1日開(kāi)始實(shí)施的強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《gb29921-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》(《gb29921-2013》)中為肉制品、水產(chǎn)制品、糧食制品等十一大類食品設(shè)置了最常見(jiàn)五種致病菌的限量,包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、大腸埃希氏菌o157:h7和副溶血性弧菌。因此,建立快速有效的檢測(cè)食源性致病菌的方法變得尤為重要。
針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)技術(shù)具有局限性,還有繼續(xù)提升的空間。在國(guó)際上較為通用的傳統(tǒng)致病菌檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫檢測(cè)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(pcr法)三大類。目前,已有報(bào)道的致病菌快速檢測(cè)方法,主要有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫層析技術(shù)、雙功能抗體檢測(cè)技術(shù)、直接落射熒光濾膜技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)、拉曼光譜技術(shù)、電阻抗技術(shù)、微量量熱技術(shù)、atp生物發(fā)光技術(shù)、dna探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)]、核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等。在不同的前提條件下,不同的檢測(cè)技術(shù)有著各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性,但缺乏既符合耗時(shí)短、費(fèi)用低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)又能滿足基層檢測(cè)需求的檢測(cè)方法。
以金黃色葡萄球菌為例。金黃色葡萄球菌易污染的食品主要有乳制品、蛋及蛋制品、熟肉制品等。大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌株都能分泌一系列酶和細(xì)胞毒素,其腸毒素會(huì)刺激嘔吐中樞,引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀,食用每100g含18μg金黃色葡萄球菌腸毒素的食物即可引起食物中毒。目前已建立的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附分析法(elisa)、酶聯(lián)熒光分析法(elfa)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)等。相關(guān)的pcr方法從分子水平上檢測(cè)金黃色葡萄球菌,具有較高的特異性和靈敏度,特別是實(shí)時(shí)熒光定量pcr法,可以實(shí)時(shí)檢測(cè)體系的反應(yīng)過(guò)程,避免了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中eb等致癌物質(zhì)的污染,因此在檢測(cè)方法中具有一定的優(yōu)勢(shì),但是反應(yīng)過(guò)程需要昂貴且復(fù)雜的儀器,檢測(cè)成本高,很難實(shí)現(xiàn)基層化,在應(yīng)用范圍上受到限制。
此外,目前也缺乏能夠同時(shí)快速定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌、志賀氏菌等多種食源性致病菌的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了解決上述問(wèn)題,本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)食品中致病菌的方法,所述方法實(shí)時(shí)熒光循環(huán)鏈置換聚合酶反應(yīng)(csdpr)技術(shù)。本發(fā)明通過(guò)多重序列對(duì)比確定了針對(duì)各菌的檢測(cè)靶核酸,設(shè)計(jì)了特異性的分子信標(biāo)探針和引物,以各菌株基因組dna為模板,建立了實(shí)時(shí)熒光csdpr,進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增后的樣品熒光強(qiáng)度驗(yàn)證csdpr方法的特異性,根據(jù)擴(kuò)增曲線驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量csdpr方法的靈敏度和最低檢測(cè)限,還通過(guò)實(shí)際樣品的檢測(cè)確定了本發(fā)明建立的方法具有實(shí)際可行性。
本發(fā)明的快速檢測(cè)食品中致病菌的方法,是以含有致病菌目標(biāo)序列的dna為模板,配置csdpr反應(yīng)體系,置于熒光分光光度計(jì)中,在分子信標(biāo)探針和循環(huán)引物的作用下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增曲線及熒光增強(qiáng)速率實(shí)現(xiàn)食品中致病菌的定性或者定量檢測(cè);其中,分子信標(biāo)探針的核苷酸序列(5’-3’)由a、b、c三部分依次組成,a和c為逆序互補(bǔ)配對(duì),b為與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列。
在一種實(shí)施方式中,所述a為taagacat(seqidno:1)、b為與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列、c為atgtctta(seqidno:2)。
在一種實(shí)施方式中,所述分子信標(biāo)探針的序列兩端修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán),fam熒光素修飾于序列的5’端;dabcyl淬滅基團(tuán)修飾于序列的3’端。
在一種實(shí)施方式中,所述含有致病菌目標(biāo)序列的dna是指含有檢測(cè)靶核酸片段的核苷酸序列。
在一種實(shí)施方式中,所述含有致病菌目標(biāo)序列的dna為致病菌的基因組dna。
在一種實(shí)施方式中,所述食品中致病菌,是金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌、志賀氏菌。
在一種實(shí)施方式中,所述致病菌目標(biāo)序列是指金黃色葡萄球菌的高度保守的16srdna片段中的一段序列、腸出血性大腸埃希氏菌(ehec)高度保守的rfbe基因中的一段序列、沙門氏菌(salmonella)侵襲蛋白基因(invasionproteina,inva)中的一段序列或者志賀氏菌(shigella)侵襲性質(zhì)??乖環(huán)基因(invasionplasmidantigenh,ipah)中的一段序列。目標(biāo)序列不同,就可實(shí)現(xiàn)不同致病菌的檢測(cè)。
在一種實(shí)施方式中,所述與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列為(5’-3’)gaagcaagcttctcgtcc(seqidno:3),用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌。
在一種實(shí)施方式中,所述與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列為(5’-3’)ccgagtacattggcatcg(seqidno:4),用于檢測(cè)ehec。
在一種實(shí)施方式中,所述與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列為(5’-3’)tctggcagtaccttcctc(seqidno:5),用于檢測(cè)沙門氏菌。
在一種實(shí)施方式中,所述與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列為(5’-3’)tttccctgcccagggaga(seqidno:6),用于檢測(cè)志賀氏菌。
在一種實(shí)施方式中,所述循環(huán)引物為能維持csdpr循環(huán)反應(yīng)的循環(huán)引物。
在一種實(shí)施方式中,所述循環(huán)引物序列3’端的核苷酸為信標(biāo)探針的a部分的核苷酸。
在一種實(shí)施方式中,所述循環(huán)引物為taagacat(seqidno:7)、ttaagacat(seqidno:8)、tttaagacat(seqidno:9)、ttttaagacat(seqidno:10)中的任意一種,用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌。添加同一濃度不同長(zhǎng)度的引物沒(méi)有對(duì)反應(yīng)曲線產(chǎn)生明顯的影響。
在一種實(shí)施方式中,所述csdpr反應(yīng)體系中分子信標(biāo)探針和循環(huán)引物的終濃度均為200nmol/l。
在一種實(shí)施方式中,所述csdpr反應(yīng)體系中含有(體積比):ddh2o78%,10×nebbuffer210%,二甲亞砜(dmso)6%,dntpsolution1%,循環(huán)引物2%,分子信標(biāo)探針2%,klenow酶1%。
在一種實(shí)施方式中,所述熒光分光光度計(jì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光csdpr擴(kuò)增的激發(fā)波長(zhǎng)495nm,發(fā)射波長(zhǎng)520nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5nm,光電倍增管電壓700v。
在一種實(shí)施方式中,所述恒溫?cái)U(kuò)增的時(shí)間為15min,擴(kuò)增溫度37℃。
在一種實(shí)施方式中,所述方法,還包括先測(cè)得的熒光信號(hào)強(qiáng)度(a.u.)與反應(yīng)時(shí)間(s),從而建立致病菌菌濃度與熒光信號(hào)增強(qiáng)速率之間的回歸曲線關(guān)系;檢測(cè)待測(cè)樣品時(shí),提取基因組dna,進(jìn)行csdpr反應(yīng),得到熒光信號(hào)增強(qiáng)速率,代入回歸曲線即可獲知待測(cè)樣品中致病菌的菌濃度。
在一種實(shí)施方式中,所述基因組dna的提取方法可以是試劑盒法、傳統(tǒng)dna抽提法(酚-氯仿法)、離子螯合劑(chelex-100)抽提法、熱裂解法;優(yōu)選熱裂解法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于csdpr反應(yīng)的分子信標(biāo)探針;所述分子信標(biāo)探針的核苷酸序列(5’-3’)由a、b、c三部分依次組成,a為taagacat、b為與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列、c為atgtctta。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種致病菌的檢測(cè)試劑盒,所述試劑盒是基于csdpr反應(yīng);所述試劑盒中含有分子信標(biāo)探針;所述分子信標(biāo)探針的核苷酸序列(5’-3’)由a、b、c三部分依次組成,a為taagacat、b為與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列、c為atgtctta。
在一種實(shí)施方式中,所述試劑盒中還包括csdpr反應(yīng)所需的其他常規(guī)試劑,比如nebbuffer2、二甲亞砜、dntpsolution、循環(huán)引物、klenow酶等。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述分子信標(biāo)探針或者所述檢測(cè)試劑盒在食品中致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,其顯著優(yōu)點(diǎn)是:
1)本發(fā)明方法基于實(shí)時(shí)熒光csdpr反應(yīng),過(guò)程簡(jiǎn)單且可實(shí)時(shí)監(jiān)控,只需要一個(gè)恒溫的環(huán)境和熒光檢測(cè)體系即可,對(duì)反應(yīng)條件的要求不高。
2)分子信標(biāo)的選擇性提升了反應(yīng)方法對(duì)目標(biāo)物的特異識(shí)別能力。
3)參與擴(kuò)增的分子信標(biāo)長(zhǎng)度較短,相比于直接擴(kuò)增較長(zhǎng)序列的靶核酸,時(shí)間更短,更方便。同時(shí)本發(fā)明的反應(yīng)條件也克服了傳統(tǒng)pcr需要依靠?jī)x器反復(fù)升降溫來(lái)獲取單鏈模板的缺點(diǎn)。
4)本發(fā)明方法對(duì)于食品中的多種致病菌的檢測(cè)具有通用性,包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌、志賀氏菌等,僅需替換掉分子信標(biāo)探針中的b部分,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同致病菌的有效檢測(cè),而且檢測(cè)靈敏度、特異性高,原理與操作簡(jiǎn)單,樣品前處理簡(jiǎn)單。
附圖說(shuō)明
圖1為循環(huán)鏈置換聚合酶反應(yīng)(csdpr)檢測(cè)原理圖。
圖2為分子信標(biāo)莖部長(zhǎng)度對(duì)熱穩(wěn)定性的影響。
圖3為致病菌探針特異性驗(yàn)證圖;其中(a)金黃色葡萄球菌16srdna探針、(b)沙門氏菌inva基因探針、(c)ehecrfbe基因探針、(d)志賀氏菌ipah基因探針。
圖4為不同濃度的致病菌與熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)率的關(guān)系;其中(a)金黃色葡萄球菌(b)鼠傷寒沙門氏菌(c)ehec、(d)福氏志賀氏菌;內(nèi)嵌圖中為關(guān)系曲線以及定量計(jì)算公式。
具體實(shí)施方案
結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述:
實(shí)施例1:csdpr擴(kuò)增原理
如圖1所示,為csdpr擴(kuò)增原理示意圖。
csdpr反應(yīng)通過(guò)靶核酸片段與分子信標(biāo)環(huán)序列的雜交打開(kāi)分子信標(biāo)探針的莖結(jié)構(gòu),并在引物和dna聚合酶的作用下形成分子信標(biāo)-cdna結(jié)構(gòu),保留已打開(kāi)的分子信標(biāo)探針信號(hào),cdna形成過(guò)程中釋放靶核酸片段觸發(fā)下一個(gè)循環(huán),通過(guò)非目標(biāo)核酸的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)信號(hào)的擴(kuò)增。
實(shí)施例2:探針與引物的設(shè)計(jì)
(一)分子信標(biāo)探針中的致病菌探針環(huán)序列的設(shè)計(jì)
(1)金黃色葡萄球菌分子信標(biāo)探針環(huán)序列的設(shè)計(jì)
在ncbi的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)關(guān)鍵詞搜索金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureusatcc6538)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、山羊葡萄球菌(staphylococcuscaprae)、頭狀葡萄球菌(staphylococcuscapitis)、巴氏葡萄球菌(staphylococcuspasteuri)的16srdna序列,使用dnaman對(duì)以上5種序列進(jìn)行多重序列對(duì)比,選擇金黃色葡萄球菌16srdna序列中與其它四種序列差異3個(gè)核苷酸以上的片段(5’-ggacgagaagcttgcttc-3’,即seqidno:11)作為金黃色葡萄球菌檢測(cè)的目標(biāo)序列。設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的金黃色葡萄球菌探針環(huán)序列(5’-gaagcaagcttctcgtcc-3’,即seqidno:3)。
(2)大腸埃希氏菌分子信標(biāo)探針環(huán)序列的設(shè)計(jì)
發(fā)明人先選擇了嘗試找出16srdna中的特異性區(qū)間對(duì)大腸埃希氏菌進(jìn)行區(qū)分。在ncbi的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)關(guān)鍵詞搜索腸桿菌科埃希氏菌屬的大腸埃希氏菌(escherichiacoli)、腸出血性大腸埃希氏菌o157:h7(enterohemorrhageescherichiacolio157:h7atcc35150)、赫爾曼埃希氏菌(escherichiahermannii)以及其他常見(jiàn)的腸桿菌科細(xì)菌包括費(fèi)氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、普通變形桿菌(proteusvulgaris)、腸炎沙門氏菌(salmonellaenteritidisatcc14028)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimuriumcmcc50115)、宋氏志賀氏菌(shigellasonneicmcc51592)、福氏志賀氏菌(shigellaflexnericmcc51572)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)的16srdna序列,使用dnaman對(duì)以上11種序列進(jìn)行多重序列對(duì)比分析。
因16srdna對(duì)于腸桿菌科細(xì)菌鑒別能力的不足而采用eheco157:h7高度保守的rfbe基因序列(登錄號(hào):af061251.1)中的片段(5’-cgatgccaatgtactcgg-3’,即seqidno:12)作為大腸埃希氏菌o157:h7檢測(cè)的目標(biāo)序列。設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的探針環(huán)序列(5’-ccgagtacattggcatcg-3’,即seqidno:4)。
(3)沙門氏菌分子信標(biāo)探針環(huán)序列的設(shè)計(jì)
選取沙門氏菌侵襲蛋白基因(invasionproteina,inva)(登錄號(hào):m90846.1)中的片段(5’-gaggaaggtactgccaga-3’,即seqidno:13)作為沙門氏菌檢測(cè)的目標(biāo)序列,并設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的探針環(huán)序列(5’-tctggcagtaccttcctc-3’,即seqidno:5)。
(4)志賀氏菌分子信標(biāo)探針環(huán)序列的設(shè)計(jì)
選取侵襲性質(zhì)??乖環(huán)基因(invasionplasmidantigenh,ipah)(登錄號(hào):m32063.1)中的片段(5’-tctccctgggcagggaaa-3’,即seqidno:14)作為志賀氏菌檢測(cè)的目標(biāo)序列,并設(shè)計(jì)得到與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的探針環(huán)序列(5’-tttccctgcccagggaga-3’,即seqidno:6)。
(二)分子信標(biāo)探針莖部長(zhǎng)度的優(yōu)化
發(fā)明人設(shè)計(jì)了三種具有相同環(huán)序列和不同莖部長(zhǎng)度(7nt、8nt、9nt)的分子信標(biāo)探針mb7、mb8、mb9。首先分別配置100μl的雜交底液體系,再分別加入終濃度為100nmol/l的三種探針,升高與f-7000熒光儀中恒溫槽的水浴溫度,采用波長(zhǎng)為495nm的激發(fā)光,入射狹縫與發(fā)射狹縫設(shè)置為5nm,pmt電壓設(shè)置為700v,每隔2℃記錄一次波長(zhǎng)520nm處的熒光強(qiáng)度,以監(jiān)測(cè)樣品從30℃-90℃的熒光強(qiáng)度變化。
其中,莖長(zhǎng)7nt的s.aureus分子信標(biāo)探針(mb7):5’-fam-aagacatgaagcaagcttctcgtccatgtctt-dabcyl-3’;序列如seqidno:15;
莖長(zhǎng)8nt的s.aureus分子信標(biāo)探針(mb8):5’-fam-taagacatgaagcaagcttctcgtccatgtctta-dabcyl-3’;序列如seqidno:16;
莖長(zhǎng)9nt的s.aureus分子信標(biāo)探針(mb9):5’-fam-ctaagacatgaagcaagcttctcgtccatgtcttag-dabcyl-3’;序列如seqidno:17。
分子信標(biāo)探針的莖部長(zhǎng)度,即莖部的互補(bǔ)堿基數(shù)目決定了分子信標(biāo)構(gòu)象變化的有效性。維持環(huán)部結(jié)構(gòu)不變的前提下,莖部互補(bǔ)堿基序列過(guò)短會(huì)導(dǎo)致分子信標(biāo)穩(wěn)定性不足,在無(wú)目標(biāo)dna存在時(shí)也會(huì)因?yàn)闇囟鹊淖兓鵁o(wú)法維持穩(wěn)定的閉合狀態(tài),進(jìn)而出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象;莖部互補(bǔ)堿基序列過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致分子信標(biāo)對(duì)目標(biāo)dna的敏感性不足,在目標(biāo)dna存在時(shí)莖部不容易打開(kāi)而出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。因此為了獲得兼具良好敏感性和穩(wěn)定性的分子信標(biāo)探針進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè),本部分優(yōu)化了探針的莖部長(zhǎng)度。
如圖2所示,莖長(zhǎng)7nt的探針mb7的熒光強(qiáng)度從36℃開(kāi)始明顯增強(qiáng),而mb8探針和mb9探針的熒光強(qiáng)度在40℃和45℃還能維持穩(wěn)定的閉合本底信號(hào)。根據(jù)klenow酶最佳反應(yīng)溫度37℃確定本發(fā)明的反應(yīng)溫度為37℃。因?yàn)閙b7探針在37℃時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)莖環(huán)結(jié)構(gòu)自動(dòng)打開(kāi)的熒光增強(qiáng),而mb8和mb9的莖環(huán)結(jié)構(gòu)在37℃下都可以維持穩(wěn)定閉合狀態(tài),加上相對(duì)更短的莖部長(zhǎng)度能提升分子信標(biāo)和目標(biāo)dna的結(jié)合率,同時(shí)提升分子信標(biāo)探針檢測(cè)的效率,所以選擇莖部長(zhǎng)度為8nt的mb8序列作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的分子信標(biāo)序列。
(三)分子信標(biāo)探針序列的確定
發(fā)明人設(shè)計(jì)了多條不同莖部序列,并研究了不同莖部序列帶來(lái)的探針二級(jí)結(jié)構(gòu)變化,最終得到了不會(huì)與四種細(xì)菌探針環(huán)序列產(chǎn)生穩(wěn)固發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部序列,再經(jīng)過(guò)莖部長(zhǎng)度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌檢測(cè)分子信標(biāo)探針序列。
最終確定的分子信標(biāo)探針的核苷酸序列(5’-3’)由a、b、c三部分依次組成,a為taagacat(序列如seqidno:1)、b為與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對(duì)的致病菌探針環(huán)序列、c為atgtctta(序列如seqidno:2)。
實(shí)施例3:基于實(shí)時(shí)熒光csdpr的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法
(1)金黃色葡萄球菌活化及增菌培養(yǎng)
在活化金黃色葡萄球菌前配置好營(yíng)養(yǎng)瓊脂(1l):蛋白胨10g,牛肉膏粉3g,氯化鈉5g,瓊脂15g,最終ph7.3±0.2。經(jīng)121℃高壓滅菌15min,冷卻至45℃左右以備傾注平板或者倒入滅菌平板待凝固后備用。將配套的金黃色葡萄球菌復(fù)蘇液滴加0.3ml到凍干菌種中,用無(wú)菌滴管反復(fù)吹吸,至凍干菌種溶解成菌懸液為止;用接種環(huán)將金黃色葡萄球菌菌懸液接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h;配制腦-心浸出液肉湯(bhi)培養(yǎng)基(1l):胰蛋白胨10g,氯化鈉5g,磷酸氫二鉀2.5g,葡萄糖2g,牛心浸出液500ml,最終ph7.4±0.2。121℃高壓滅菌15min,冷卻至46℃左右備用;將生長(zhǎng)良好的金黃色葡萄球菌菌落接種到bhi培養(yǎng)基,搖瓶過(guò)夜培養(yǎng),生長(zhǎng)良好的菌懸液用于菌種dna提取?;罨敖臃N過(guò)程在超凈工作臺(tái)無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。
(2)菌株基因組dna提取
熱裂解法提取菌株dna步驟:取1ml菌懸液于ep管中,12000rpm離心1min,棄上清液;取500μl滅菌水吹打沉淀,12000rpm離心1min,棄上清液;重復(fù)上一步驟;取100μl滅菌水吹打沉淀,沸水浴10min,12000rpm離心;取上清液至另一ep管,-20℃保存?zhèn)溆?。提取到的dna用酶標(biāo)儀檢測(cè)其od值,判斷dna的質(zhì)量。
(3)實(shí)時(shí)熒光csdpr法檢測(cè)金黃色葡萄球菌
配制反應(yīng)混合液(不含dna模板),短暫離心后分裝至ep管中,分別向每個(gè)ep管中添加dna模板,完整的實(shí)時(shí)熒光csdpr反應(yīng)體系為100μl(其中實(shí)時(shí)熒光csdpr反應(yīng)體系為:10mmol/ltris-hcl(ph7.9),50mmol/lnacl,10mmol/lmgcl2,1mmol/ldtt,100μmol/ldntp,6%dmso,15uklenow聚合酶,200nmol/l循環(huán)引物,200nmol/l分子信標(biāo)探針:探針為:fam-taagacatgaagcaagcttctcgtccatgtctta-dabcyl(序列如seqidno:16);循環(huán)引物為:ttttaagacat(序列如seqidno:10)),置于熒光分光光度計(jì)中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光csdpr擴(kuò)增,擴(kuò)增溫度37℃,擴(kuò)增時(shí)間15min,激發(fā)波長(zhǎng)495nm,發(fā)射波長(zhǎng)520nm,光電倍增管電壓700v。根據(jù)擴(kuò)增曲線及熒光增強(qiáng)速率分析檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)混合液的配制和體系的分裝都在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
目標(biāo)dna濃度可以用單位時(shí)間內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加量(熒光增強(qiáng)速率)來(lái)表示。
實(shí)施例4:基于實(shí)時(shí)熒光csdpr的檢測(cè)致病菌的方法特異性的確認(rèn)
本實(shí)施例比較了csdpr擴(kuò)增方法的特異性:
(1)標(biāo)準(zhǔn)菌株分別購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心(atcc)和中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(cmcc)。腸出血大腸埃希氏菌o157:h7(ehec)、大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(e.coli)、表皮葡萄球菌(s.epidermids)、白色葡萄球菌(s.albus)、金黃色葡萄球菌(s.aureus)、鼠傷寒沙門氏菌(s.typhimirium)、腸炎沙門氏菌(s.enteritidis)、宋氏志賀氏菌(s.sonnei)、福氏志賀氏菌(s.flexneri)、副溶血性弧菌(vp)、單增李斯特菌(lm)和蠟樣芽胞桿菌(b.cereus)。
(2)將上述菌株過(guò)夜培養(yǎng),提取dna模板。
(3)分別取10μl上述各種細(xì)菌的dna模板,使用實(shí)施例1的4種分子信標(biāo)探針對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),以驗(yàn)證四種探針在csdpr反應(yīng)中的特異性。使用優(yōu)化所得的探針濃度(200nmol/l)、引物濃度(200nmol/l)條件進(jìn)行csdpr擴(kuò)增(10mmol/ltris-hcl(ph7.9),50mmol/lnacl,10mmol/lmgcl2,1mmol/ldtt,100μmol/ldntp,6%dmso,15uklenow聚合酶,200nmol/l循環(huán)引物,200nmol/l分子信標(biāo)探針),檢測(cè)反應(yīng)60min時(shí)各組樣品的熒光強(qiáng)度,以10μl的te緩沖液代替細(xì)菌模板作為空白對(duì)照。
結(jié)果如圖3所示,四種探針在檢測(cè)對(duì)應(yīng)細(xì)菌模板時(shí)熒光信號(hào)遠(yuǎn)高于對(duì)照組和空白組,說(shuō)明四種探針對(duì)目標(biāo)細(xì)菌都表現(xiàn)出很高的特異性。金黃色葡萄球菌16srdna分子信標(biāo)探針能從高同源性的白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌中特異性識(shí)別出金黃色葡萄球菌;沙門氏菌inva基因分子信標(biāo)探針可以檢測(cè)到鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的模板中均存在inva基因,但可以區(qū)分沙門氏菌和不同屬的細(xì)菌;ehecrfbe基因分子信標(biāo)探針能特異性識(shí)別含有rfbe毒力基因的ehec細(xì)菌;志賀氏菌ipah基因探針可以檢測(cè)到福氏志賀氏菌和宋氏志賀氏菌中均含有ipah基因。
實(shí)施例5:csdpr反應(yīng)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果
csdpr反應(yīng)全過(guò)程可根據(jù)反應(yīng)速度變化分三個(gè)階段(0min-15min的勻速上升期,15min-40min的減速上升期和40min后的恒定期)。目標(biāo)dna濃度可以用單位時(shí)間內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加量(熒光增強(qiáng)速率)來(lái)表示,使用熒光增強(qiáng)速率表示目標(biāo)dna濃度的優(yōu)點(diǎn)在于可以將反應(yīng)時(shí)間縮短至15min。
將過(guò)夜培養(yǎng)所得的金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、ehec和福氏志賀氏菌分別進(jìn)行平板計(jì)數(shù)并提取細(xì)菌基因組dna模板。根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)四種細(xì)菌的基因組dna模板按比例進(jìn)行稀釋,稀釋成相當(dāng)于1.0×104cfu/ml-1.0×107cfu/ml菌濃度的dna模板稀釋液,這是為了避免先稀釋菌液再提取dna帶來(lái)的巨大的組間系統(tǒng)誤差,便于后續(xù)的定量分析。
根據(jù)對(duì)四種細(xì)菌csdpr擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行的定量分析,繪制四種探針在針對(duì)性檢測(cè)時(shí)的菌濃度對(duì)應(yīng)熒光增強(qiáng)速率的關(guān)系曲線。
如圖4所示,在2×105cfu/ml-2.5×106cfu/ml范圍內(nèi),s.aureus濃度與熒光增強(qiáng)速率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,根據(jù)美國(guó)食品與藥物管理局(fda)參與制定的標(biāo)準(zhǔn)《工業(yè)指南:驗(yàn)證分析方法學(xué)》中對(duì)檢測(cè)限(dl)建議的表達(dá)公式(公式中σ表示空白樣品標(biāo)準(zhǔn)差,s表示回歸方程斜率)計(jì)算得到理論檢測(cè)限為9.5×104cfu/ml;在1.0×104cfu/ml-1.0×106cfu/ml范圍內(nèi),鼠傷寒沙門氏菌、ehec和福氏志賀氏菌濃度與熒光增強(qiáng)速率均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,根據(jù)dl公式計(jì)算得到理論檢測(cè)限分別為4.8×104cfu/ml、3.4×104cfu/ml、3.0×104cfu/ml。
實(shí)施例6:本發(fā)明方法應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)
人工污染牛排中金黃色葡萄球菌檢測(cè):
對(duì)試驗(yàn)中用到的牛排用國(guó)標(biāo)(gb4789.30-2010)的方法進(jìn)行檢測(cè),證明不含金黃色葡萄球菌。將增菌培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌懸液進(jìn)行梯度稀釋,并污染到牛肉中,具體操作:將市售牛排進(jìn)行攪拌,加少量生理鹽水進(jìn)行均質(zhì),取45ml到滅菌的100ml錐形瓶中;將過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌稀釋為9.2×104cfu/ml、9.2×103cfu/ml、9.2×102cfu/ml的菌液,取5ml分別加入裝有45ml含有牛排基質(zhì)的培養(yǎng)基中,使?jié)舛冗_(dá)到9.2×103cfu/ml、9.2×102cfu/ml、9.2×101cfu/ml;在37℃下震蕩培養(yǎng),分別于4h、6h、8h、10h、12h的時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)液2ml,2ml培養(yǎng)液中的1ml用于平板計(jì)數(shù),另外1ml培養(yǎng)液提取dna模板用于csdpr法檢測(cè)。
結(jié)果顯示:金黃色葡萄球菌純培養(yǎng)csdpr方法的最低檢測(cè)限是9.5×104cfu/ml。經(jīng)最短6h的增菌培養(yǎng)后可以檢測(cè)到103cfu/ml的金黃色葡萄球菌。在線性范圍內(nèi),平板計(jì)數(shù)結(jié)果和csdpr定量分析結(jié)果無(wú)顯著差異。
序列表
<110>江南大學(xué)
<120>一種等溫快速擴(kuò)增檢測(cè)食品中致病菌的方法
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<170>patentinversion3.3
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