本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用膜莢黃芪種子提取膜莢黃芪凝集素蛋白的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：膜莢黃芪（astragalusmembranaceus），中國的傳統(tǒng)中藥黃芪已有2000多年的用藥史，其廣泛的藥用價值及多種功效已被歷史所證實(shí)。黃芪單獨(dú)、組合用藥或者作為補(bǔ)充食品，有促進(jìn)人體健康和免疫平衡的作用?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)中藥黃芪具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗氧化、促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝等作用，通過抗脂質(zhì)過氧化，加強(qiáng)對氧自由基的清除，對缺氧復(fù)氧內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。近期的研究表明黃芪通過激活小鼠b細(xì)胞和巨噬細(xì)胞來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，恢復(fù)性抑制有絲分裂，抑制荷瘤小鼠白血病和淋巴瘤腫瘤細(xì)胞生長。黃芪的免疫調(diào)節(jié)活性，可能與一些功能性蛋白質(zhì)、多糖或類黃酮有關(guān)。然而，對黃芪蛋白類提取物免疫調(diào)節(jié)作用的報道尚未多見，其機(jī)制未被闡明。因此分離黃芪功能性蛋白質(zhì)，研究其對免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的作用，是黃芪免疫調(diào)節(jié)作用研究中非常有意義的一個方向。凝集素（lectin），凝集素具有多種生物學(xué)功能，其潛在的研究價值逐漸被挖掘。凝集素是一類非免疫性的蛋白或糖蛋白，能可逆地、特異地與碳水化合物相互作用，具有多變的氨基酸序列，廣泛的分布于微生物、病毒及植物中。凝集素有多種功能、結(jié)構(gòu)、組織定位及糖結(jié)合特異性。近年來的研究表明，植物凝集素具有多種多樣的生物活性：（1）殺蟲作用；（2）抗真菌作用；（3）抗腫瘤作用；（4）抗病毒作用。研究發(fā)現(xiàn)植物凝集素可應(yīng)用于機(jī)體防御、體外給藥，以及多種疾病的治療。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用膜莢黃芪種子提取膜莢黃芪凝集素蛋白的方法，另一目的是提供了該膜莢黃芪凝集素蛋白在抗菌、抗腫瘤方面的應(yīng)用。本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用膜莢黃芪種子提取膜莢黃芪凝集素蛋白的方法，以膜莢黃芪種子為原料，經(jīng)脫殼粉碎、提取、分離、純化得到膜莢黃芪凝集素蛋白，具體步驟如下：（1）膜莢黃芪種子處理：洗凈的膜莢黃芪種子105℃烘干4.5-5.5h，脫殼粉碎后獲得100目干粉，準(zhǔn)確稱取50g粉末，加入ph5.0的醋酸鹽緩沖液500ml，置于4℃冰箱中抽提24h，紗布過濾，12000r/min離心20min，收集上清液，磁力攪拌器上加入硫酸銨，使之飽和度達(dá)到80%，4℃攪拌過夜，12000r/min離心20min，棄上清，將沉淀加入20mmol/l、ph7.0的tris-hcl緩沖液30ml進(jìn)行溶解，置于透析袋中，用同樣的緩沖液透析，除去硫酸銨，24h后冷凍干燥，于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?；?）初分離：將步驟（1）制備的蛋白粗品200mg溶于20mmol/l、ph7.0的tris-hcl緩沖液2ml，用hitrapspxl柱離子交換層析，在aktatmexplore進(jìn)行初步分離，收集洗脫峰；（3）純化：將步驟（2）得到的蛋白樣品，進(jìn)行凝膠色譜superdexg25分離純化，再用10mmol/l、ph7.0tris-hcl緩沖液洗脫，調(diào)節(jié)流速在0.5ml/min，收集各個洗脫峰；經(jīng)superdex-g25分子篩層析后，得到一個主要的蛋白峰，進(jìn)行常規(guī)凝血實(shí)驗鑒定具有凝血活性，即為膜莢黃芪凝集素蛋白aml，對其凍干保存?zhèn)溆?；?）檢測：步驟（3）獲得的膜莢黃芪凝集素蛋白aml進(jìn)行12.5%，sds-page檢測，為單一條帶，分子量為70kd；所得膜莢黃芪凝集素蛋白aml含糖量為14.8%，含有15種氨基酸，其中帶電荷與極性氨基酸為70%，疏水性氨基酸為30%。所述的膜莢黃芪凝集素蛋白aml具有抑菌、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡活性。所得到的膜莢黃芪凝集素蛋白aml應(yīng)用于抗菌功能食品或抗腫瘤醫(yī)藥的制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果和優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明得到的膜莢黃芪凝集素aml分子量約為70kd；含糖量為14.8%，含有15種氨基酸，其中帶電荷與極性氨基酸為70%，疏水性氨基酸為30%。另外，與提高免疫相關(guān)的氨基酸asp/asn和arg含量較高，接近30%。更重要的是aml具有抑菌活性和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡活性，其中對痢疾桿菌抑制濃度(ic50)為85.4μg/ml，金黃色葡萄球菌抑制濃度(ic50)為80.2μg/ml，大腸桿菌抑制濃度(ic50)為65.3μg/ml，對人胃癌細(xì)胞sgc-7901抑制濃度(ic50)為20.3μg/ml，人肝癌細(xì)胞hepg2抑制濃度(ic50)為19.6μg/ml，小鼠肝癌細(xì)胞h22抑制濃度(ic50)為15.5μg/ml，人正常肝細(xì)胞hl-7702抑制濃度(ic50)為45.1μg/ml，與腫瘤細(xì)胞相比，aml對正常細(xì)胞毒性較小。aml具有較好的人類o型血和兔血凝集偏好，同時其凝集活性具有較好的溫度穩(wěn)定性、ph穩(wěn)定性和金屬離子穩(wěn)定性。因而本發(fā)明得到的膜莢黃芪凝集素aml有利于功能食品、醫(yī)藥和其它領(lǐng)域的開發(fā)利用。附圖說明圖1為本發(fā)明制備的膜莢黃芪凝集素蛋白的sds-page分析圖，圖中：mr：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道1：膜莢黃芪凝集素蛋白粗提物；泳道2：純化的膜莢黃芪凝集素蛋白；圖2為本發(fā)明制備的膜莢黃芪凝集素aml中含糖量圖；圖3為本發(fā)明制備的膜莢黃芪凝集素aml氨基酸含量圖；圖4為本發(fā)明制備的膜莢黃芪凝集素aml的抑菌活性圖；圖5為本發(fā)明制備的膜莢黃芪凝集素aml的抗腫瘤細(xì)胞活性圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：用膜莢黃芪種子提取膜莢黃芪凝集素蛋白的方法，以膜莢黃芪種子為原料，經(jīng)脫殼粉碎、提取、分離、純化得到膜莢黃芪凝集素蛋白，具體步驟如下：（1）膜莢黃芪種子處理：洗凈的膜莢黃芪種子105℃烘干4.5-5.5h，脫殼粉碎后過100目網(wǎng)，獲得100目干粉，準(zhǔn)確稱取50g粉末，加入500mlph5.0的醋酸鹽緩沖液，置于4℃冰箱中抽提24h，紗布過濾，12000r/min離心20min，收集上清液，置于磁力攪拌器上，緩慢加入硫酸銨，使之飽和度達(dá)到80%，4℃攪拌過夜，12000r/min離心20min，棄上清，將沉淀加入30ml20mmol/l、ph7.0的tris-hcl緩沖液進(jìn)行溶解，置于透析袋中，用同樣緩沖液透析，除去硫酸銨，24h后冷凍干燥，分裝于ep管中于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆茫唬?）初分離：將步驟（1）制備的蛋白粗品200mg溶于2ml20mmol/l、ph7.0的tris-hcl緩沖液，用hitrapspxl柱離子交換層析，在aktatmexplore進(jìn)行初步分離，收集洗脫峰；（3）純化：將步驟（2）得到的蛋白樣品，進(jìn)行凝膠色譜superdexg25分離純化，再用10mmol/l、ph7.0tris-hcl緩沖液洗脫，調(diào)節(jié)流速在0.5ml/min，收集各個洗脫峰；經(jīng)superdex-g25分子篩層析后，得到一個主要的蛋白峰，進(jìn)行常規(guī)凝血實(shí)驗鑒定具有凝血活性，表明此組分為膜莢黃芪凝集素蛋白aml，對其凍干保存，分裝于1.5mlep管中備用；（4）檢測：步驟（3）獲得的膜莢黃芪凝集素蛋白aml進(jìn)行12.5%，sds-page檢測，顯示只有單一條帶，分子量約為70kd（見圖1）。實(shí)施例2：膜莢黃芪凝集素含糖量測定及氨基酸含量測定：（1）苯酚-硫酸法測定aml含糖量：取0.5g純化后的aml加1ml15%tca溶液研磨，加入1ml5%tca溶液研磨，提取上清液于10ml離心管中，然后再加入1ml5%tca溶液研磨，提取上清液于10ml離心管中，重復(fù)3次。最后一次將殘渣一起置于離心管內(nèi)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心，共離心三次，第一次15分鐘，取上清液；后兩次各5分鐘取上清液，三次上清液置于25ml錐形比色管中，最后濾液保持在18ml左右，然后向比色管中加入6mol/l的鹽酸2ml之后搖勻，96℃水浴鍋中水浴2小時；定容取樣：水浴后，用流水冷卻，然后加入6mol/l的氫氧化鈉2ml搖勻，定容至25ml。吸取0.2ml的樣品液，以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻室溫放置20分鐘冷卻后待測。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取50μg/ml的己糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0ml，0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml于試管中，用水補(bǔ)足到0.5ml，加0.3ml5%苯酚溶液，混勻后快速加入1.8ml濃硫酸，振蕩混勻，室溫放置20min即可出現(xiàn)橙黃色，以第一管調(diào)零點(diǎn)，可于490nm處比色測定讀od值。以糖含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的od值為縱坐標(biāo)。樣品含量測定:取0.5ml內(nèi)含2～25μg糖量，同樣加入0.3ml5%酚溶液，混勻后立刻沿管壁加入濃硫酸1.8ml，振蕩混勻，達(dá)室溫后，可測490nm處的od值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查相應(yīng)糖含量（圖2）。公式aml含糖量=含糖量/aml總質(zhì)量，計算得到aml含糖量為14.8%，有報道的從膜莢黃芪根提取的凝集素的糖含量為10.7%，本發(fā)明從膜莢黃芪種子中獲得的凝集素較之前報道的從膜莢黃芪根提取的凝集素（朱利芬,閆巧娟等.一種膜莢黃芪凝集素的分離純化研究.中草藥.2010，41(56)：714-717）的糖含量高。（2）測定aml氨基酸含量：取aml溶于6mol/lhcl，100℃水解24h，用德國曼默博爾a300全自動氨基酸分析儀進(jìn)行檢測，測定結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，aml中含有15種氨基酸，其中多數(shù)為帶電荷與極性氨基酸，約占總量70%，30%為疏水性氨基酸。另外，與提高免疫相關(guān)的氨基酸asp/asn和arg含量較高，接近30%。實(shí)施例3：膜莢黃芪種子凝集素凝集活性及穩(wěn)定性鑒定（1）凝血活性分析，在微量滴定v孔板(25μl)中對植物凝集素溶液進(jìn)行凝血活性測定，用25μl2%的不同種類的生理鹽水紅細(xì)胞溶液混勻。室溫孵育，直至空白孔(未加蛋白樣品)中的紅細(xì)胞完全沉積在孔底，形成一個紅點(diǎn)。凝集活性決定于紅細(xì)胞凝集斑的形成。以各蛋白樣品發(fā)生凝集反應(yīng)的最高稀釋度的倒數(shù)為凝集效價，表示為2n(n是發(fā)生凝集反應(yīng)的孔數(shù))。由表1中可見膜莢黃芪種子凝集素對4種人紅細(xì)胞和3種動物紅細(xì)胞有凝集作用，凝集滴度為28～210，證明，本蛋白制品為一類血球凝集素。表1膜莢黃芪種子凝集素對紅細(xì)胞的凝集活性紅細(xì)胞凝集滴度人(a型)29人(b型)28人(ab型)28人(o型)210大鼠29小鼠28兔210初始濃度為1mg/ml,28=3.91μg/ml;29=1.95μg/ml;210=0.97μg/ml（2）aml的ph、熱及金屬離子穩(wěn)定性測定，方法如下：在測定ph對黃芪凝集素的凝集活性的影響的實(shí)驗中，將其溶解在下列不同ph值的溶液中：ph2.4～3.0的hcl；ph11.7～12.2的naoh。室溫孵育30min后，中和溶液，根據(jù)實(shí)施例3（1）中的凝血活性分析測定方法測定其凝集活性。在測定溫度對植物凝集素的凝集活性的影響的實(shí)驗中，植物凝集素溶液在不同的溫度(25℃～80℃)水浴處理30min，冰上冷卻后，根據(jù)實(shí)施例3（1）中的凝血活性分析測定方法測定其凝集活性。將黃芪凝集素溶液20mmol/ledta充分透析，檢測對人血紅細(xì)胞的凝血活性；透析后的溶液中分別加入10mmol/lcu2+、mg2+、zn2+，根據(jù)實(shí)施例3（1）凝血活性分析測定方法測定其凝集活性。aml對熱較穩(wěn)定，實(shí)驗結(jié)果見表2：在被加熱至64℃時，仍保持有全部的凝血活性；當(dāng)溫度從64℃上升到70℃時，活性急劇下降；80℃時活性消失。表2：膜莢黃芪種子凝集素的溫度穩(wěn)定性溫度(℃)凝集滴度2521040210502960277025800初始濃度為1mg/ml,28=3.91μg/ml;29=1.95μg/ml;210=0.97μg/ml另一方面，aml的ph穩(wěn)定性極高，結(jié)果見表3：ph2～13時，aml仍有凝血活性；ph0～1時，活性減半；ph14時活性消失。表3：膜莢黃芪種子凝集素的酸堿穩(wěn)定性酸堿濃度/mol/l-1ph值凝集活性naoh,0.0311.7210naoh,0.0611.929naoh,0.1212.028naoh,0.2412.227hcl,0.033.029hcl,0.062.828hcl,0.122.627hcl,0.242.426初始濃度為1mg/ml,28=3.91μg/ml;29=1.95μg/ml;210=0.97μg/ml金屬離子穩(wěn)定性結(jié)果見表4，結(jié)果顯示：20mmol/ledta對aml充分透析后，凝血活性沒有變化；在透析后的溶液中再分別加入20mmol/lcu2+、mg2+、zn2+等二價離子，aml的凝血活性同樣沒有影響，由此可知，aml凝血活性與供試的3種金屬離子無關(guān)。表4：膜莢黃芪種子凝集素的金屬離子穩(wěn)定性金屬離子凝集活性cu2+210mg2+210zn2+29初始濃度為1mg/ml,28=3.91μg/ml;29=1.95μg/ml;210=0.97μg/ml實(shí)施例3：膜莢黃芪種子凝集素的抑菌和抗腫瘤活性應(yīng)用（1）用液體培養(yǎng)基試管連續(xù)稀釋法檢測aml抑菌活性，根據(jù)前期摸索抑菌實(shí)驗結(jié)果，對aml對供試菌的半致死劑量進(jìn)行篩選。取4支無菌試管編號。于每管加入1ml肉湯培養(yǎng)基、1ml含aml溶液，混勻后取出1ml加于第2管，依次作倍比稀釋至第4管，aml終濃度為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，另設(shè)第5管加入1ml肉湯培養(yǎng)基、1ml無菌水，作對照管，然后每管加菌液50μl混勻，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另取第6個試管加入1ml肉湯培養(yǎng)基、1ml無菌水、50μl生理鹽水，用于od值調(diào)0；24h后，600nm處測定各管吸光度值，每個樣品測3次，取平均值。根據(jù)公式ic50=lg-1{xm-i[σp-（3-pm-pn）/4]}（xm：設(shè)計的最大濃度的對數(shù)值；i：最大劑量比相臨劑量的對數(shù)值；σp：各組生長抑制率之和；pm:最大陽性反應(yīng)率；pn最小陽性反應(yīng)率），計算aml對各供試菌的ic50。結(jié)果見圖4，結(jié)果表明，各濃度的膜莢黃芪凝集素對3種供試細(xì)菌的抑制率呈劑量依賴性效應(yīng)，半致死劑量（ic50）分別為：痢疾桿菌85.4μg/ml,金黃色葡萄球菌80.2μg/ml，大腸桿菌65.3μg/ml，證實(shí)aml對供試的三種菌有較好的抑制生長的效果。（2）（cck-8檢測法）對膜莢黃芪凝集素分別進(jìn)行抑菌活性和抗腫瘤活性檢測，取對數(shù)生長期的sgc-7901、hepg2、h22和hl-7702細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個/ml并計數(shù)，接種到96孔板中，每孔約100μl細(xì)胞懸液，每份樣本做3個重復(fù)，hl-7702細(xì)胞提前置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4小時，分別加入pbs及不同濃度(6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)的aml溶液，37°c，5%的co2培養(yǎng)，12h、20h、24h后每孔加入10μlcck8，輕輕敲擊培養(yǎng)板以混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，微孔板讀數(shù)儀570nm處測定吸光值。根據(jù)公式ic50=lg-1{xm-i[σp-（3-pm-pn）/4]}（xm：設(shè)計的最大濃度的對數(shù)值；i：最大劑量比相臨劑量的對數(shù)值；σp：各組生長抑制率之和；pm:最大陽性反應(yīng)率；pn最小陽性反應(yīng)率），計算aml對各細(xì)胞的ic50，實(shí)驗結(jié)果見表5，結(jié)果表明，各濃度的膜莢黃芪凝集素對3種腫瘤細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的抑制率同樣呈劑量依賴效應(yīng)，半致死劑量（ic50）分別為：人胃癌細(xì)胞sgc-790120.3μg/ml，人肝癌細(xì)胞hepg219.6μg/ml，小鼠肝癌細(xì)胞h2215.5μg/ml，人正常肝細(xì)胞hl-770245.1μg/ml，與腫瘤細(xì)胞相比，aml對正常細(xì)胞毒性較小，證實(shí)aml對供試的3種腫瘤細(xì)胞有較好的抑制作用。當(dāng)前第1頁12