本申請是2014年5月29日提交的、題為“一種用于篩選肽類和非肽類glp-1類似物的細胞株及其制備方法與應用”的中國申請201410234121.2的分案申請。

本發(fā)明屬于藥物高通量篩選檢測技術領域，具體地，涉及一種表達熒光標記人胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)蛋白細胞株glp-1r/u2os細胞株及其建立方法，以及基于此細胞株受到胰高血糖素樣肽-1類似物刺激后細胞內產生熒光斑點的形態(tài)變化來測定胰高血糖素樣肽-1類似物生物活性及其受體激動劑、拮抗劑和調節(jié)劑的檢測方法。

背景技術：

腸促胰島素是在養(yǎng)分吸收以增加胰島素分泌時胃腸道釋放的激素。占腸促胰島素大多數(shù)效應的兩種腸道肽是：1)glp-1(glucagon-likepeptide,胰高血糖素樣肽1)：是由胰高血糖素原基因編碼、在營養(yǎng)物質刺激下由小腸l細胞(langerhanscell)分泌的含30或31個氨基酸的激素，glp-1通過作用于胰腺β細胞而發(fā)揮促進胰島素的分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，glp-1及其受體廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)、胰腺和胃腸道系統(tǒng)。2)gip(gastricinhibitionpolypeptideorglucose-dependentinsulinotropicpeptide，葡萄糖依賴性促胰島素多肽)：被十二指腸和近端空腸k細胞分泌。從小腸部位釋放的幾分鐘內，glp-1和gip被二肽基肽酶-iv(dpp-iv)進行迅速代謝(蛋白水解裂解)成無活性代謝物。小量活性激素到達胰腺作用于在beta-細胞上的受體位點以葡萄糖依賴方式刺激胰島素分泌；而且glp-1作用在alpha細胞和抑制胰高血糖素的分泌。目前基于腸促胰島素的治療主要分為兩大類即dpp-iv抑制劑(如西格列汀、利拉利汀等)和glp-1受體激動劑(基于exendin-4治療，如艾塞那肽；人glp-1類似物，如利拉魯肽)。

glp-1目前被認為是最重要的腸促胰島素，其發(fā)揮著大約70-80％的腸促胰島素活性，所有這些生理特征均顯示glp-1將在2型糖尿病的治療中發(fā)揮重要作用。新型降糖藥物glp-1受體激動劑可顯著、持久降低糖化血紅蛋白水平，并具有迅速、高效降低血糖，改善胰島β細胞功能，降低體重等功效。無論是動物水平還是細胞水平，glp-1受體激動劑均表現(xiàn)出抗高血糖的生理作用；促進胰島素的釋放，抑制胰高血糖素的分泌，延遲胃排空，促進β細胞的增殖和再生，抑制β細胞的凋亡。

glp-1及其類似物的相關研究雖然已經取得了不錯的進展，多種類似物也進入了臨床試驗階段，然而由于多肽類藥物具有一個共同的弊端，即不能口服給藥，只能通過皮下注射，因此對于長期用藥的二型糖尿病(t2dm)患者來說其依從性仍舊不高。由于多肽類藥物的特性，其穩(wěn)定性依賴于時間、溫度及ph值，保藏條件要求較高。另外，由于這些激動劑都給人體引入了外源蛋白，可能會引發(fā)機體的免疫反應。目前上市的glp-1類似物價格昂貴，會加重患者的經濟負擔。目前篩選小分子glp-1類似物已成為研究熱點。

建立有效的glp-1類似物生物活性的測定方法，是評價新藥藥效的關鍵措施之一。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新的體外篩選胰高血糖素樣肽-1受體的肽類和非肽類激動劑、調節(jié)劑和拮抗劑的方法，提供一種表達熒光標記人胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)蛋白細胞株glp-1r/u2os細胞株及其建立方法，xfp直接標記glp-1r的c末端，以及基于此細胞株受到胰高血糖素樣肽-1類似物刺激后細胞內產生熒光斑點的形態(tài)變化來測定胰高血糖素樣肽-1類似物生物活性的檢測方法。

本發(fā)明以下述的技術方案來得以實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的的：

一株glp-1r/u2os細胞株，由下述方法獲得：構建人胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)熒光蛋白(xfp)真核表達載體glp-1r/pcmv6，并穩(wěn)定轉染人骨肉瘤u2os細胞，獲得一株glp-1r/u2os細胞株。

所述的glp-1r/u2os細胞株含有的熒光蛋白(xfp)，是gfp(greenfluorescenceprotein)、yfp(yelowfluorescenceprotein)、rfp(redfluorescenceprotein)或任何具有熒光性質的蛋白。

所述的glp-1r/u2os細胞株或其它適用的細胞如hek293(humanembroynickidney293)細胞，由下述方法獲得：先構建人胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)綠色熒光蛋白(gfp)真核表達載體glp-1r/pcmv6，再按lipofectamine2000操作說明書進行轉染u2os細胞。g418(400μg/ml)加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達人glp-1r的u2os細胞系，命名為glp-1r/u2os細胞株。

用所述的glp-1r/u2os細胞株測定glp-1類似物生物活性的方法，轉染了xfp標記的glp-1r基因的條件下，在受體激動劑刺激下誘導glp-1r/u2os細胞內產生熒光斑點，轉染的glp-1r能穩(wěn)定表達。

如所述的方法，其中所述的受體激動劑為glp-1類似物，glp-1受體與配體結合后細胞內產生熒光斑點強度與受體激動劑的活性呈正相關，用高內涵系統(tǒng)觀察分析測定glp-1r/u2os細胞內熒光斑點強度，測定受體激動劑的生物活性。

如所述的方法，其中所述的glp-1類似物為促胰島素分泌肽exendin-4。

如所述的方法，用高內涵系統(tǒng)觀察glp-1r的表達情況結果，用glp-1r/u2os細胞內熒光斑點平均強度變化測定glp-1類似物和glp-1r生物活性物包括glp-1受體激動劑、拮抗劑和調節(jié)劑等。

本發(fā)明提供了穩(wěn)定表達熒光標記人胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)蛋白細胞株glp-1r/u2os的建立，以及基于glp-1r/u2os細胞株受到glp-1類似物exendin-4刺激后細胞內形成熒光斑點，用高內涵系統(tǒng)觀察分析形態(tài)變化來測定glp-1類似物生物活性的檢測方法。該檢測方法易標準化，重復性好，具有glp-1受體特異性、成本低、準確和方便的特點，具有良好的應用前景。

目前國內篩選glp-1受體激動劑的方法是將glp-1受體的基因和報告基因共轉染到細胞內，并將glp-1受體表達在細胞表面，通過刺激后細胞內camp水平變化對激動劑進行篩選。本發(fā)明提供了熒光標記人胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)蛋白細胞株glp-1r/u2os，相比國內的篩選方法具有快速、靈敏、專一性高等優(yōu)點，而且會大大降低假陽性的發(fā)生，并且可以針對混合物進行篩選，同時也會降低檢測成本。

更具體地，本申請涉及：

1、一株glp-1r/u2os細胞株，其特征在于由下述方法獲得：構建人胰高血糖素樣肽-1受體熒光蛋白真核表達載體glp-1r/pcmv6，并穩(wěn)定轉染人骨肉瘤u2os細胞，獲得一株glp-1r/u2os細胞株。

2、根據(jù)項1所述的glp-1r/u2os細胞株含有的熒光蛋白xfp是gfp、yfp、rfp或任何具有熒光性質的蛋白。

3、根據(jù)項1所述的glp-1r/u2os細胞株或其它適用的細胞如hek293細胞，其特征在于由下述方法獲得：先構建人胰高血糖素樣肽-1受體glp-1r綠色熒光蛋白gfp真核表達載體glp-1r/pcmv6，再按lipofectamine2000操作說明書進行轉染u2os細胞，g418加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達人glp-1r的u2os細胞系，命名為glp-1r/u2os細胞株。

4、用項1所述的glp-1r/u2os細胞株測定glp-1類似物生物活性的方法，其特征在于：轉染了xfp標記的glp-1r基因條件下，在受體激動劑刺激下誘導glp-1r/u2os細胞內產生熒光斑點，轉染的glp-1r穩(wěn)定表達。

5、如項4所述的方法，其特征在于所述的受體激動劑為glp-1類似物，glp-1受體與配體結合后細胞內產生熒光斑點強度與受體激動劑的活性呈正相關，用高內涵系統(tǒng)觀察分析測定glp-1r/u2os細胞內熒光斑點強度，測定受體激動劑的生物活性。

6、如項4所述的方法，其特征在于所述的glp-1類似物為促胰島素分泌肽exendin-4。

7、如項4所述的方法，其特征在于用高內涵系統(tǒng)觀察glp-1r的表達情況結果，用glp-1r/u2os細胞內熒光斑點平均強度變化測定glp-1類似物和glp-1r生物活性物包括glp-1受體激動劑、拮抗劑和調節(jié)劑等。

附圖說明

圖1xfp標記glp-1r示意圖；

圖2重組真核表達載體glp-1r/pcmv6示意圖；

圖3高內涵系統(tǒng)觀察分析細胞表面glp-1r的表達情況結果；

圖4高內涵系統(tǒng)觀察分析刺激后細胞內形成熒光斑點；

圖5glp-1r/u2os細胞經exendin-4激活后活性反應曲線結果。

具體實施方式

下面結合附圖，用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實施例1gfp熒光標記人glp-1r真核表達載體glp-1r/pcmv6的構建，glp-1r/u2os細胞株的建立，以及glp-1r/u2os細胞內熒光斑點平均強度變化測定glp-1類似物生物活性。

一、gfp熒光標記人glp-1r真核表達載體glp-1r/pcmv6的構建：

人glp-1rcdna擴增：以人glp-1rcdna為模板，采用pcr的方式擴增全長人glp-1rcdna編碼區(qū)，全長1392bp。

其上游引物:5’-gaggcgatcgccatggccggcgcccccggc-3’；

下游引物:5’-gcgacgcgtgctgcaggaggcctggcaag-3’。

2.回收、純化pcr產物，連接到pmd18-tvector上，獲得重組質粒glp-1r/pmd18-t，利用限制性內切酶sgfi和mlui對質粒進行酶切。

3.用限制性內切酶sgfi和mlui酶切質粒g-d(pcmv6-ac-gfp-dr5)。

4.回收酶切產物，在16℃連接8小時，獲得重組質粒glp-1r/pcmv6，按照omega去內毒素質粒大量提取試劑盒說明書提取glp-1r/pcmv6質粒。

基因序列的克隆pcr反應體系為50μl，由5μl10×ex-taqbuffer、1μlex-taqdna聚合酶5u/μl、3μl2.5mmdntp、1μl上游引物10pmol/μl、1μl下游引物10pmol/μl、1μl質粒(bc113493)100ng/μl和38μl無菌水組成；pcr反應條件：95℃預變性5min，95℃變性1min，65℃退火0.5min，72℃延伸1min，共30個循環(huán)，72℃延伸10min；所用的10×ex-taqbuffer中含有mg²⁺。

回收pcr產物連接到pmd18-tvector反應體系為10μl，由5μl回收pcr產物、4.5μlsolutioni、0.5μlpmd18-tvector組成；反應條件：在16℃連接4小時。

雙酶切質粒glp-1r/pmd18-t反應體系為50μl，由2μlsgfi(5u/μl)、2μlmlui(5u/μl)、5μl10×tangobuffer、25μlglp-1r/pmd18-t和16μl無菌水組成；反應條件：37℃溫育2小時。

雙酶切質粒g-d(pcmv6-ac-gfp-dr5)反應體系為50μl，由2μlsgfi(5u/μl)、2μlmlui(5u/μl)、5μl10×tangobuffer、10μlg-d和31μl無菌水組成；反應條件：37℃溫育2小時。

構建重組質粒glp-1r/pcmv6是用步驟(2)和(3)中的限制性酶切產物，在16℃的條件下連接8小時；反應體系為11μl，由5μlsolutioni、步驟(4)中限制性酶切后的質粒pcmv6片段和glp-1r基因序列片段分別為1μl和5μl組成；反應條件：在16℃連接8小時。

步驟(4)中獲得的質?？蛇M一步轉化e.colidh5α進行保存擴增。

二、穩(wěn)定轉染人glp-1r的u2os細胞系的建立：

u2os細胞在含10％(體積分數(shù))小牛血清的dmem培養(yǎng)基中,于37℃、5％(體積分數(shù))co2的飽和濕度下培養(yǎng)。待細胞融合至70％-80％時按lipofectamine2000操作說明書進行重組表達載體glp-1r/pcmv6的轉染。轉染48h后，用胰蛋白酶消化細胞，在含有g418(400μg/ml)的選擇培養(yǎng)基中加壓篩選2周，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)即為穩(wěn)定表達人glp-1r的u2os細胞系，命名為glp-1r/u2os細胞株。用高內涵系統(tǒng)觀察glp-1r的表達情況結果。

三、glp-1r/u2os細胞內熒光斑點平均強度變化測定glp-1類似物生物活性：

將上述獲得的glp-1r/u2os細胞按100μl/孔(1000細胞/孔)培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，用含10％(體積分數(shù))小牛血清的dmem培養(yǎng)基，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24小時。第二天撤去完全培養(yǎng)基，用pbs緩沖液清洗，加入不同濃度待測樣本exendin-4，并在20分鐘后移去孔中溶液，用4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，用pbs緩沖液洗3遍，加入dapi染料避光染色15分鐘，用pbs緩沖液洗5遍，在孔中留100μlpbs緩沖液，用高內涵系統(tǒng)觀察分析熒光斑點，并用transfluor模塊分析計算斑點平均強度，用excel作出標準曲線。

實施例2glp-1r/u2os細胞膜上glp-1r的表達

glp-1r/u2os細胞按100μl/孔(1000細胞/孔)培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，用含10％(體積分數(shù))小牛血清的dmem培養(yǎng)基，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24小時。第二天撤去完全培養(yǎng)基，用pbs緩沖液清洗，用4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，用pbs緩沖液洗3遍，加入dapi染料避光染色15分鐘，用pbs緩沖液洗5遍，在孔中留100μlpbs緩沖液，用高內涵系統(tǒng)觀察熒光。

實施例3glp-1r/u2os細胞表達glp-1受體活性分析

glp-1r/u2os細胞按100μl/孔(1000細胞/孔)培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，用含10％(體積分數(shù))小牛血清的dmem培養(yǎng)基，37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24小時。第二天撤去完全培養(yǎng)基，用pbs緩沖液清洗，加入待測樣本exendin-4，室溫放置20分鐘，移去孔中溶液，用4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，用pbs緩沖液洗3遍，加入dapi染料避光染色15分鐘，用pbs緩沖液洗5遍，在孔中留100μlpbs緩沖液，用高內涵系統(tǒng)觀察熒光變化。結果表明細胞內產生熒光斑點，而未轉染glp-1r基因的u2os細胞未有任何變化。以上實驗結果證實重組glp-1r/u2os細胞表達的glp-1r蛋白具有天然glp-1r蛋白相似的生理活性，具有特異性。

實施例4促胰島素分泌肽生物學活性測定

取不同濃度的促胰島素分泌肽exendin-4，用實施例3方法刺激生長中的glp-1r/u2os細胞，高內涵系統(tǒng)觀察分析各樣本刺激glp-1r/u2os細胞后的熒光斑點平均強度。以樣本濃度為橫坐標，以斑點平均強度為縱坐標，作曲線。結果表示，經exendin-4刺激后斑點平均強度曲線呈典型的反s型，不同濃度的exendin-4刺激glp-1r/u2os細胞后形成斑點的平均強度存在劑量效應相關性。