本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年11月19日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980154477.2、名稱為“羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞”的發(fā)明申請(qǐng)的分案。

本申請(qǐng)要求提交于2009年11月19日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/116,248的權(quán)益，其公開(kāi)的內(nèi)容全文引入作為參考。

1.技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了來(lái)自羊膜的新型血管生成細(xì)胞，及其細(xì)胞群，在此稱為“羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞”(amdac)。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞不同于以前描述的胎盤干細(xì)胞，包括組織培養(yǎng)塑料貼壁胎盤干細(xì)胞。

2.

背景技術(shù)：

細(xì)胞組合物，例如，干細(xì)胞組合物，已成為針對(duì)多種生理缺陷的有吸引力的治療手段，例如，用于骨髓替代治療。存在對(duì)于其它細(xì)胞群的需求，例如，具有血管生成的潛能和/或性質(zhì)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。

3.發(fā)明概述

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，在此也稱為amdac，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞是oct-4^–(oct-4陰性，oct-4也稱為pou5f1或八聚體結(jié)合蛋白4)，或經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)測(cè)定，例如，按照30個(gè)循環(huán)的rt-pcr的測(cè)定，與合適的對(duì)照細(xì)胞系進(jìn)行對(duì)比，例如胚胎癌衍生的干細(xì)胞系(例如，ntera-2，例如，來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，atcc編號(hào)crl-1973)，所述細(xì)胞是oct-4^–。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr1/flt-1⁺(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1)和/或vegfr2/kdr⁺(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2，也稱為激酶插入域受體)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd49f⁺(整聯(lián)蛋白-α6⁺)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)rt-pcr測(cè)定為hla-g^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd90⁺、cd105⁺、或cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞是cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，且不表達(dá)sox2。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd29⁺、cd73⁺、abc-p⁺、和cd38^–中的一種或多種。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺(血管生成素受體)、tem-7⁺(腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物7)、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–(血管緊張素ⅰ轉(zhuǎn)換酶，ace)、cd146^–(黑色素瘤細(xì)胞粘附分子)、cxcr4^–(趨化因子(c-x-c基序)受體4)中的一種或多種。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、和cxcr4^–。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–；經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺；以及經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、和/或tie-2^–中的一種或多種或全部。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群在例如>20個(gè)循環(huán)的pcr擴(kuò)增下，比具有等價(jià)細(xì)胞數(shù)量的ntera-2細(xì)胞或ntera-2細(xì)胞群少表達(dá)至少2log的oct-4mrna。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還是ve-鈣粘蛋白^–(cd144^–)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞還經(jīng)免疫定位測(cè)定cd105⁺和cd200⁺呈陽(yáng)性。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞在暴露于1-100ng/mlvegf(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–和sox-2^–；以及經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定是cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，oct-4^–，sox-2^–細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定還是hla-g^–或cd271^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–和sox-2^–；以及經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定為cd90⁺、cd105⁺、cd117^–、cd271^–和hla-g^–。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞對(duì)于cd309(也稱為vegfr2/kdr⁺)呈陽(yáng)性。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–、和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、或ve-鈣粘蛋白^–中的一種或多種的。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)例如>20個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定為oct-4^-，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、和ve-鈣粘蛋白^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞在暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞是oct-4^–、cd49f⁺、hla-g^–、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–(黑色素瘤細(xì)胞粘附分子)、或cxcr4^–中的一種或多種。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、和cxcr4^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還為vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺；以及經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、和/或tie-2^–中的一種或多種。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還為vegfr1/flt-1⁺、vegfr2/kdr⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、和tie-2^–。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定不表達(dá)fgf4、ifng、cxcl10、angpt4、angptl3、fga、lep、prl、prok1、tnmd、flt3、xlkd1、cdh5、lect1、plg、tert、sox2、nanog、mmp-13、dlx5、或bglap的mrna。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定不能組成性地表達(dá)不變鏈、hla-dr-dp-dq、cd6、cd271中的一種或多種。

本發(fā)明在此進(jìn)一步提供了一種分離的細(xì)胞群，其包含一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–和hla-g^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr1/flt-1⁺或vegfr2/kdr⁺；且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺和vegfr2/kdr⁺，其中所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、或cxcr4^–中的一種或多種，或經(jīng)例如>20個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定是hla-g^–，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺，其中所述細(xì)胞在暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)上述任何含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、上皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)等血管生成因子存在下培養(yǎng)于底物，例如matrigel^tm上的時(shí)候，形成芽或管狀結(jié)構(gòu)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，且對(duì)于vegfr2/kdr、cd9、cd54、cd105、或cd200呈陽(yáng)性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、和cd200⁺。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，當(dāng)所述細(xì)胞群在諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、上皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)等血管生成因子存在下培養(yǎng)于底物，例如matrigel^tm上的時(shí)候，形成芽或管狀結(jié)構(gòu)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，人細(xì)胞，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)acta2、adamts1、amot、ang、angpt1、angpt2、angptl1、angptl2、angptl4、bai1、cd44、cd200、ceacam1、chga、col15a1、col18a1、col4a1、col4a2、col4a3、csf3、ctgf、cxcl12、cxcl2、dnmt3b、ecgf1、edg1、edil3、enpp2、ephb2、fbln5、f2、fgf1、fgf2、figf、flt4、fn1、fst、foxc2、grn、hgf、hey1、hspg2、ifnb1、il8、il12a、itga4、itgav、itgb3、mdk、mmp2、myoz2、nrp1、nrp2、pdgfb、pdgfra、pdgfrb、pecam1、pf4、pgk1、prox1、ptn、sema3f、serpinb5、serpinc1、serpinf1、timp2、timp3、tgfa、tgfb1、thbs1、thbs2、tie1、tie2/tek、tnf、tnni1、tnfsf15、vash1、vegf、vegfb、vegfc、vegfr1/flt1、或vegfr2/kdr的rna中的一種或多種或全部。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)cd49d、連接蛋白-43、hla-abc、β2-微球蛋白、cd349、cd318、pdl1、cd106、半乳凝素-1、adam17前體(脫整聯(lián)蛋白及金屬蛋白酶域17)(tnf-α轉(zhuǎn)化酶)、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白a(α-細(xì)絲蛋白)(細(xì)絲蛋白1)(內(nèi)皮肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)(abp-280)(非肌肉細(xì)絲蛋白)、α-輔肌動(dòng)蛋白1(α-輔肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架亞型)(非肌肉α-輔肌動(dòng)蛋白1)(f-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白)、低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白2前體(巨蛋白(megalin))(糖蛋白330)(gp330)、i和ii型巨噬細(xì)胞消除受體(巨噬細(xì)胞乙酰化的ldl受體i和ii)、活化素受體ii型b前體(actr-iib)、wnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞(gfap)、肌漿球蛋白-結(jié)合蛋白c、心-型(心mybp-c)(c-蛋白、心肌亞型)、或肌球蛋白重鏈，非肌a型(細(xì)胞肌球蛋白重鏈、a型)(非肌肉肌球蛋白重鏈-a)(nmmhc-a)中的一種或更多或全部。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其在例如細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分泌vegf、hgf、il-8、mcp-3、fgf2、卵泡抑素、g-csf、egf、ena-78、gro、il-6、mcp-1、pdgf-bb、timp-2、upar、或半乳凝素-1中的一種或多種或全部。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)血管生成的微rna(mirna)的水平高于骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述mirna包括mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、和/或mir-296中的一種或更多或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)的血管生成微rna(mirna)的水平低于骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述mirna包括mir-20a、mir-20b、mir-221、mir-222、mir-15b、和/或mir-16中的一種或更多或全部。在某些實(shí)施方式中，amdac，或amdac群體，表達(dá)一種或更多或全部的血管生成mirna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、mir-20a、mir-20b、mir-296、mir-221、mir-222、mir-15b、和/或mir-16。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞，或羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞群，其在缺氧條件(例如，低于約5％o2)下以相對(duì)常氧條件(例如，約20％或約21％o2)下增加的水平表達(dá)cd202b、il-8和/或vegf。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群另外包含第二種細(xì)胞類型。在具體的實(shí)施方式中，amdac包含所述群體中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少98％的細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型包含于或分離自胎盤血、臍帶血、粗骨髓或其它組織。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中、所述第二種細(xì)胞類型是胚胎干細(xì)胞、血細(xì)胞、分離自外周血的干細(xì)胞、分離自胎盤血的干細(xì)胞、分離自胎盤灌流液的干細(xì)胞、分離自胎盤組織的干細(xì)胞、分離自臍帶血的干細(xì)胞、臍帶干細(xì)胞、骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、體干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、周細(xì)胞、肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成血管細(xì)胞、或心成肌細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第二種細(xì)胞類型是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，cd34⁺細(xì)胞。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述第二種細(xì)胞類型包含所述群體中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少98％的細(xì)胞。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，任何上述細(xì)胞正在被或已經(jīng)被培養(yǎng)增殖。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，任何上述細(xì)胞都來(lái)自所述細(xì)胞培養(yǎng)物，其已被傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20次、或更多。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，任何上述細(xì)胞都來(lái)自培養(yǎng)物，其在培養(yǎng)物中倍增至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次，或更多。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種組合物，例如，藥物組合物，其包含在此提供的任何一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，或含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物是基質(zhì)或支架，例如，天然組織基質(zhì)或支架，例如，永久或可降解的去細(xì)胞化的組織基質(zhì)或支架；或合成的基質(zhì)或支架。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)或支架的形狀為管狀或其它器官狀的三維形式。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)為去細(xì)胞化的組織基質(zhì)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含一種或多種在此提供的分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，或含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，其置于生理可接受的溶液中，例如，鹽溶液、培養(yǎng)基等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個(gè)體的方法，包括對(duì)所述個(gè)體以足以明顯改善所述疾病或紊亂的一種或更多癥狀的量和時(shí)間施用一種或多種在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個(gè)體的方法，包括對(duì)所述個(gè)體施用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其用藥量和時(shí)間與羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞施用前的該個(gè)體相比足以明顯改善一種或更多心功能指標(biāo)，其中所述心功能指標(biāo)為胸腔心輸出量(co)、心指數(shù)(ci)、肺動(dòng)脈楔壓(pawp)、心指數(shù)(ci)、％縮短分?jǐn)?shù)(％fs)、射血分?jǐn)?shù)(ef)、左心室射血分?jǐn)?shù)(lvef)、左心室舒張末內(nèi)徑(lvedd)、左心室收縮末內(nèi)徑(lvesd)、收縮性(dp/dt)、心房或心室功能降低、泵效率增加、泵效率損失速率降低、血液動(dòng)力學(xué)功能損失降低、或與心肌病相關(guān)的并發(fā)癥減少。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是心肌梗塞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是心肌病。在其它具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是動(dòng)脈瘤、心絞痛、主動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈炎、心率不齊、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈炎、非對(duì)稱性心室間隔肥厚(ash)、動(dòng)脈粥樣硬化、心房纖顫和撲動(dòng)、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、barlow綜合征(二尖瓣脫垂)、心動(dòng)過(guò)緩、脈管炎病(血栓閉塞性脈管炎)、心肌肥厚、心臟炎、頸動(dòng)脈疾病、主動(dòng)脈縮窄、先天性心臟缺損、充血性心力衰竭、冠狀動(dòng)脈疾病、eisenmenger綜合征、栓塞、心內(nèi)膜炎、紅斑性肢痛病、肌纖維震顫、纖維肌肉發(fā)育不良、心傳導(dǎo)阻滯、心臟雜音、高血壓、低血壓、特發(fā)性嬰兒動(dòng)脈鈣化、川崎氏病(皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征、皮膚粘膜淋巴結(jié)病、小兒多動(dòng)脈炎)、代謝綜合征、微血管心絞痛、心肌炎、陣發(fā)性房性心動(dòng)過(guò)速(pat)、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎(多動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、心包炎、周圍血管疾病、嚴(yán)重肢體缺血、靜脈炎、肺動(dòng)脈瓣狹窄(肺動(dòng)脈狹窄)、雷諾氏病、腎動(dòng)脈狹窄、腎性高血壓、風(fēng)濕性心臟病、糖尿病血管病變、間隔缺損、無(wú)癥狀心肌缺血、綜合征x、心動(dòng)過(guò)速、高安氏動(dòng)脈炎、fallot四聯(lián)癥、大血管轉(zhuǎn)位、三尖瓣閉鎖、動(dòng)脈干、心臟瓣膜病、曲張潰瘍、靜脈曲張、脈管炎、室間隔缺損、wolff-parkinson-white綜合征、心內(nèi)膜墊缺損、急性風(fēng)濕熱、急性風(fēng)濕性心包炎、急性風(fēng)濕性心內(nèi)膜炎、急性風(fēng)濕性心肌炎、慢性風(fēng)濕性心臟病、二尖瓣疾病、二尖瓣狹窄、風(fēng)濕性二尖瓣關(guān)閉不全、主動(dòng)脈瓣疾病、其他心內(nèi)膜結(jié)構(gòu)疾病、缺血性心臟病(急性、亞急性)、心絞痛、急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病、脊柱后側(cè)凸性心臟病、心肌炎、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、心內(nèi)膜纖維彈性組織增生癥、房室傳導(dǎo)阻滯、心律失常、心肌變性、腦血管疾病、動(dòng)脈、小動(dòng)脈和毛細(xì)血管疾病、或靜脈和淋巴管疾病。

在其它具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是腦前動(dòng)脈閉塞和狹窄，或腦動(dòng)脈閉塞。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療腦內(nèi)和腦部周邊血流破壞的個(gè)體的方法，例如，由于該個(gè)體的腦或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)內(nèi)部或周邊血流破壞引發(fā)的癥狀或神經(jīng)功能障礙，其包括對(duì)該個(gè)體施用治療有效量的amdac。在某些實(shí)施方式中，血流破壞導(dǎo)致該個(gè)體的腦或cns缺氧損傷或低氧損傷。

在其它具體的實(shí)施方式中，所述疾病或紊亂是周圍動(dòng)脈閉塞和狹窄。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療肢體內(nèi)部和周邊血流破壞的個(gè)體的方法，例如，由于該個(gè)體的周圍血管系統(tǒng)的內(nèi)部或周邊血流破壞引發(fā)的癥狀或血管缺陷，其包括對(duì)該個(gè)體施用治療有效量的amdac。在某些實(shí)施方式中，血流破壞導(dǎo)致該個(gè)體的肢體和或手足缺氧損傷或低氧損傷。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療患有創(chuàng)傷或精神損傷的個(gè)體的方法，其包括對(duì)所述個(gè)體施用一種或多種在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其用藥量和時(shí)間足以明顯改善所述創(chuàng)傷或精神損傷。

在另一個(gè)具體的治療方法實(shí)施方式中，所述細(xì)胞注射施用至所述個(gè)體。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述注射為注射入個(gè)體心臟的缺血性區(qū)域。在另一個(gè)特別的治療方法實(shí)施方式中，所述細(xì)胞靜脈輸液施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)特別的治療方法實(shí)施方式中，通過(guò)在所述個(gè)體中植入如上所述的含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的基質(zhì)或支架，將所述細(xì)胞、或所述細(xì)胞的群體、或包含所述細(xì)胞的細(xì)胞群施用至所述個(gè)體。

在此提供的分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和細(xì)胞群不是諸如描述于美國(guó)專利號(hào)7,255,879或美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的分離的胎盤干細(xì)胞或細(xì)胞群。在此提供的分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞也不是內(nèi)皮祖細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞、滋養(yǎng)層、滋養(yǎng)層細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、從胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)獲得的細(xì)胞、或從胚胎性腺嵴獲得的細(xì)胞。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“約”表示，例如，在所述數(shù)字或數(shù)值10％的范圍以內(nèi)。

在此使用的關(guān)于在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“血管生成的(angiogenic)”，意為該細(xì)胞能夠形成血管或血管樣芽，或細(xì)胞能夠促進(jìn)在另一個(gè)細(xì)胞群中的血管生成(例如，形成血管或血管樣結(jié)構(gòu))，例如，內(nèi)皮細(xì)胞。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“血管生成(angiogenesis)”表示血管形成的過(guò)程，其包括但不限于，內(nèi)皮細(xì)胞的激活、遷移、增殖，基質(zhì)重構(gòu)和細(xì)胞穩(wěn)定化。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”定義了任何給定細(xì)胞群的功能屬性，其能夠廣泛增殖但不一定無(wú)限增殖，且有助于在胚胎發(fā)育或是出生后的組織替代和修復(fù)中形成多種組織。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“祖細(xì)胞”定義了任何給定細(xì)胞群的功能屬性，其能夠廣泛增殖但不一定無(wú)限增殖，且有助于在胚胎發(fā)育或是出生后的組織替代和修復(fù)中形成相對(duì)于干細(xì)胞數(shù)量有限的多種組織。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“來(lái)源的(derived)”表示分離的或用其它方式純化的。例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分離自羊膜。術(shù)語(yǔ)“來(lái)源的”涵蓋了培養(yǎng)于直接從諸如羊膜的組織中分離的細(xì)胞，以及培養(yǎng)或擴(kuò)增自初級(jí)分離物的細(xì)胞。

在此使用的“免疫定位”表示在例如流式細(xì)胞術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、磁性細(xì)胞分選、原位雜交、免疫組織化學(xué)等中對(duì)諸如細(xì)胞標(biāo)記的化合物進(jìn)行檢測(cè)，其中使用免疫蛋白，例如，抗體或其片段。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“分離的細(xì)胞”表示一種細(xì)胞，其基本上分離自例如細(xì)胞從中來(lái)源的羊膜或胎盤的其它細(xì)胞或組織。如果在例如收集和/或培養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)程中，至少約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的干細(xì)胞天然關(guān)聯(lián)的細(xì)胞被從該細(xì)胞中去除，則認(rèn)為該細(xì)胞是“分離的”。

在此使用的術(shù)語(yǔ)“分離的細(xì)胞群”表示一種細(xì)胞群，其基本上分離自例如細(xì)胞群從中來(lái)源的羊膜或胎盤的其它細(xì)胞或組織。如果在例如收集和/或培養(yǎng)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的過(guò)程中，至少約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或至少99％的所述細(xì)胞群天然關(guān)聯(lián)的細(xì)胞或該細(xì)胞群從中來(lái)源的細(xì)胞被從該細(xì)胞群中去除，則認(rèn)為該細(xì)胞群是“分離的”。

當(dāng)一種特殊標(biāo)記可以通過(guò)例如免疫定位或通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或通過(guò)rt-pcr被從背景中檢出的時(shí)候，認(rèn)為在此使用的細(xì)胞對(duì)于該特殊標(biāo)記是“陽(yáng)性的”。例如，如果可在細(xì)胞上檢測(cè)出cd105明顯高于背景的量(相對(duì)于，例如，同型對(duì)照)，則細(xì)胞被描述為對(duì)于cd105是陽(yáng)性的。在例如抗體-介導(dǎo)檢測(cè)的背景下，“陽(yáng)性的”作為細(xì)胞的特定表面標(biāo)記存在的一種暗示，意為該標(biāo)記可用抗體檢測(cè)，例如，標(biāo)記特異性的熒光標(biāo)記抗體；“陽(yáng)性的”還表示細(xì)胞攜帶該標(biāo)記，其含量可以在例如細(xì)胞計(jì)數(shù)器中產(chǎn)生信號(hào)，其能夠在背景中檢測(cè)到。例如，細(xì)胞是“cd105⁺”，則其中細(xì)胞被可檢測(cè)地標(biāo)記了cd105特異性抗體，且來(lái)自抗體的信號(hào)可檢測(cè)得出高于對(duì)照(例如，背景)。相反，在相同語(yǔ)境下，“陰性的”意為相對(duì)于背景而言細(xì)胞表面標(biāo)記使用其特異性抗體無(wú)法檢測(cè)。例如，細(xì)胞是“cd34^–”，則其中細(xì)胞不能用cd34特異性抗體標(biāo)記檢測(cè)。除非在此另有說(shuō)明，否則分化抗原(“cd”)標(biāo)記均使用抗體進(jìn)行檢測(cè)。例如，如果oct-4的mrna可使用例如30個(gè)循環(huán)的rt-pcr進(jìn)行檢測(cè)，則可以確定存在oct-4，且細(xì)胞是oct-4⁺。

4.附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和ntera-2細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)。

圖2顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞(amdac)的細(xì)胞表面的tem-7表達(dá)。

圖3顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分泌選定的血管生成蛋白。

圖4顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)管腔形成的血管生成效果。

圖5顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞遷移的血管生成效果。

圖6顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果。

圖7顯示了huvec和羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞對(duì)乙?；痩dl的吸收。

圖8顯示了huvec和羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的管腔形成。

圖9顯示了在低氧和常氧條件下羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞vegf和il-8的分泌。

圖10顯示了在常氧(約21％o2)和低氧(低于約5％o2)條件下細(xì)胞標(biāo)記tie2的表達(dá)。y軸：經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的tie2陽(yáng)性的細(xì)胞百分比。

圖11顯示了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的成心肌細(xì)胞分化潛能，其中am表示羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞(amdac)，hd表示未處理的懸滴，hdind表示暴露于誘導(dǎo)條件的懸滴，以及hdind+5-aza表示在5-氮雜胞苷存在或缺失的情況下的誘導(dǎo)。ctrl表示未處理的懸滴對(duì)照。

圖12顯示了在雞胚絨膜尿囊血管生成模型中amdac對(duì)血管生成的正向效果。lot1、lot2、lot3：來(lái)自三種不同的細(xì)胞制備物的amdac。bfgf：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(陽(yáng)性對(duì)照)。mdamb231：血管生成性乳腺癌細(xì)胞系(陽(yáng)性對(duì)照)。y軸：血管形成度。

圖13顯示了在雞胚絨膜尿囊血管生成模型中amdac-條件化培養(yǎng)基對(duì)血管生成的正向效果。lot1、lot2、lot3：來(lái)自三種不同的細(xì)胞制備物的amdac。bfgf：堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(陽(yáng)性對(duì)照)。mdamb231：血管生成性乳腺癌細(xì)胞系(陽(yáng)性對(duì)照)。y軸：血管形成度。

圖14a、14b：存在于星形細(xì)胞培養(yǎng)物、星形細(xì)胞和骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞(bm-msc)共培養(yǎng)物、或星形細(xì)胞和amdac共培養(yǎng)物的過(guò)氧化氫產(chǎn)生的活性氧。14a：amdac，lot1；14b：amdac，lot2。單獨(dú)的ha(人星形細(xì)胞)、星形細(xì)胞+h2o2、和星形細(xì)胞+bm-msc+h2o2的條件對(duì)于圖14a和14b而言是相同的。rfuros活性：活性氧的相對(duì)熒光單位。

5.發(fā)明詳述

5.1羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的特性

本發(fā)明提供了獨(dú)特的貼壁血管生成細(xì)胞及該細(xì)胞的群體，其分離自羊膜，在此稱為“羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞”或amdac。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在表觀上與間質(zhì)細(xì)胞有些相似，其具有大致為成纖維樣的形狀。該細(xì)胞附著于細(xì)胞培養(yǎng)物表面，例如，組織培養(yǎng)塑料。

amdac能展示將其區(qū)別于其它羊膜來(lái)源或胎盤來(lái)源的細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)記。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–(八聚體結(jié)合蛋白4)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，oct-4^–羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定是cd49f⁺。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是hla-g^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，oct-4^–細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1)和/或vegfr2/kdr⁺(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，oct-4^–羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或oct-4^–羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群，在例如>20個(gè)循環(huán)的pcr-擴(kuò)增下，比具有等價(jià)細(xì)胞數(shù)量和rna擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的ntera-2細(xì)胞或ntera-2細(xì)胞群少表達(dá)至少2log的pcr擴(kuò)增的oct-4mrna。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞是cd90⁺、cd105⁺、或cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞是cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是oct-4^–或hla-g^–，并且還是cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞是oct-4^–，hla-g^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，oct-4^–細(xì)胞例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定不表達(dá)sox2。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定是oct-4^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–，和經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的的rt-pcr測(cè)定是sox2^–。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述oct-4^–細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定是cd29⁺、cd73⁺，abc-p⁺、和cd38^–中的一種或多種。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，例如，oct-4^–amdac經(jīng)免疫定位測(cè)定可以還是cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tem-7⁺(腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物7)、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–(血管緊張素ⅰ轉(zhuǎn)換酶，ace)、cd146^–(黑色素瘤細(xì)胞粘附分子)、或cxcr4^–(趨化因子(c-x-c基序)受體4)中的一種或多種，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定是hla-g^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、和cxcr4^–，和經(jīng)rt-pcr測(cè)定為hla-g^–。在一個(gè)實(shí)施方式中，在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞為cd31^–、cd34^–、cd45^–、和/或cd133^–中的一種或多種。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–；經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺；以及cd31^–、cd34^–、cd45^–、和/或cd133^–中的一種或多種或全部。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還為ve-鈣粘蛋白^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還另外對(duì)cd105⁺和cd200⁺呈陽(yáng)性。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。在更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于25-75ng/ml的vegf下4-21天、或50ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。在更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于1、2.5、5、10、25、50、75或100ng/mlvegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。在更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在暴露于1-100ng/ml的vegf下7-14天，例如，7天后，經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。

在具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是ve-鈣粘蛋白^–、vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、和/或cd200⁺中的一種或多種。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是ve-鈣粘蛋白^–、vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、和cd200⁺。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞在例如暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞是oct-4^–、cd49f⁺、hla-g^–、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、或cxcr4^–中的一種或多種。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、和cxcr4^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還為vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺；以及經(jīng)免疫定位測(cè)定為cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、和/或tie-2^–中的一種或多種。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還為vegfr1/flt-1⁺、vegfr2/kdr⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、和tie-2^–。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，oct-4^–羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd49f⁺、cd54⁺、cd90⁺、cd98⁺、cd105⁺、cd200⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、vegfr1/flt-1⁺、和/或vegfr2/kdr⁺(cd309⁺)中的一種或多種或全部；或經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd31^–、cd34^–、cd38^–、cd45^–、cd117^–、cd133^–、cd143^–、cd144^–、cd146^–、cd271^–、cxcr4^–、hla-g^–、和/或ve-鈣粘蛋白^–中的一種或多種或全部，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定為sox2^–。

在某些實(shí)施方式中，附著于組織培養(yǎng)塑料的分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞是cd49f⁺。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述cd49f⁺細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd90⁺、cd98⁺、cd105⁺、cd200⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、vegfr1/flt-1⁺、和/或vegfr2/kdr⁺(cd309⁺)中的一種或多種或全部；或經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd31^–、cd34^–、cd38^–、cd45^–、cd117^–、cd133^–、cd143^–、cd144^–、cd146^–、cd271^–、cxcr4^–、hla-g^–、oct-4^–和/或ve-鈣粘蛋白^–中的一種或多種或全部，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定為sox2^–。

在某些其它的實(shí)施方式中，分離的組織培養(yǎng)塑料附著的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞是hla-g^–、cd90⁺和cd117^–。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述hla-g^–、cd90⁺和cd117^–細(xì)胞經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd49f⁺、cd54⁺、cd98⁺、cd105⁺、cd200⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、vegfr1/flt-1⁺、和/或vegfr2/kdr⁺(cd309⁺)中的一種或多種或全部；或經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd31^–、cd34^–、cd38^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd144^–、cd146^–、cd271^–、cxcr4^–、oct-4^–和/或ve-鈣粘蛋白^–中的一種或多種或全部，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定為sox2^–。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞群不能組成型地表達(dá)以下的mrna：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(fgf4)、干擾素γ(ifng)、趨化因子(c-x-c基序)配體10(cxcl10)、血管生成素4(angpt4)、血管生成素樣3(angptl3)、纖維蛋白原α鏈(fga)、瘦素(lep)、催乳素(prl)、前動(dòng)力蛋白1(prok1)、腱調(diào)蛋白(tnmd)、fms樣酪氨酸激酶3(flt3基因)、胞外連接域容納1(xlkd1)、鈣粘蛋白5、2型(cdh5)、白細(xì)胞衍生的趨化因子1(lect1)、纖溶酶原(plg)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(tert)、(性別決定區(qū)y)-盒2(sox2)、nanog、基質(zhì)金屬蛋白酶13(mmp-13)、無(wú)遠(yuǎn)端同源(distal-lesshomeobox)5(dlx5)、和/或骨γ-羧基谷氨酸(gla)蛋白(bglap)。在其它實(shí)施方式中，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞群表達(dá)以下的mrna：(arnt2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(gdnf)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(nt-3)、nt-5、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hif1a)、缺氧誘導(dǎo)蛋白2(hig2)、血紅素氧化酶(脫環(huán))1(hmox1)、胞外超氧化物歧化酶[cu-zn](sod3)、過(guò)氧化氫酶(cat)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(tgfb1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1受體(tgfb1r)、和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(hgfr/c-met)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的分離的細(xì)胞群。細(xì)胞群可以是同類群體，例如，細(xì)胞群中至少約90％、95％、98％或99％為羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。細(xì)胞群可以是混合的，例如，細(xì)胞群中最多約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。然而，分離的細(xì)胞群不是組織，即，不是羊膜。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種含amdac的分離的細(xì)胞群，例如，基本上均勻的amdac細(xì)胞群，其中所述amdac附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述amdac經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，amdac例如經(jīng)免疫定位或rt-pcr測(cè)定是cd49f⁺或hla-g⁺。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述amdac群體經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺，其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜(amnion/amnioticmembrane)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，amdac經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–和/或hla-g^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述amdac是cd90⁺、cd105⁺、或cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述amdac是cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，amdac是oct-4^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，amdac例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定不表達(dá)sox2。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，該群體含有amdac，且其中所述amdac經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定是oct-4^–、hla-g^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺和cd117^–，以及例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定是sox2^–。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中的所述amdac經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定是cd90⁺、cd105⁺、或cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，amdac經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定是cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，amdac例如經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–或hla-g^–，且經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定還是cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中的amdac是oct-4^–、hla-g^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，amdac例如經(jīng)30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定不表達(dá)sox2。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞經(jīng)免疫定位或流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定是oct-4^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–，和經(jīng)例如30個(gè)循環(huán)的rt-pcr測(cè)定是sox2^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，amdac是oct-4^–或hla-g^–，和另外是cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，amdac是oct-4^–、hla-g^–、cd49f⁺、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和免疫定位測(cè)定經(jīng)vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺，且經(jīng)免疫定位測(cè)定還為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、或cxcr4^–中的一種或多種，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定為hla-g^–，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的細(xì)胞群，包含一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr1/flt-1⁺和/或vegfr2/kdr⁺，其中所述細(xì)胞在暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34，且其中所述分離的細(xì)胞群不是羊膜。在任一上述實(shí)施方式的具體的實(shí)施方式中，所述群體中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在胞外基質(zhì)蛋白或血管生成因子存在的條件下培養(yǎng)時(shí)都形成芽或管狀結(jié)構(gòu)，胞外基質(zhì)蛋白為例如i和iv型膠原蛋白，血管生成因子為例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、上皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)，細(xì)胞群在例如胎盤膠原蛋白或例如matrigel^tm的基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上培養(yǎng)至少4天到多至14天。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群顯示能夠表達(dá)涉及血管生成相關(guān)或心肌生成相關(guān)基因的蛋白的特性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)以下的rna中的一種或更多或全部：acta2(肌動(dòng)蛋白、α2、平滑肌、主動(dòng)脈)、adamts1(具有凝血酶致敏蛋白1型基序的adam金屬肽酶)、amot(血管抑素結(jié)合蛋白)、ang(血管生成素)、angpt1(促血管新生蛋白因子1)、angpt2、angptl1(促血管新生蛋白因子樣1)、angptl2、angptl4、bai1(腦特異性血管生成抑制劑1)、cd44、cd200、ceacam1(癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞粘附分子1)、chga(嗜鉻粒蛋白a)、col15a1(膠原蛋白，xv型，α1)、col18a1(膠原蛋白，xviii型，α1)、col4a1(膠原蛋白，iv型，α1)、col4a2(膠原蛋白，iv型，α2)、col4a3(膠原蛋白，iv型，α3)、csf3(菌落刺激因子3(粒細(xì)胞)、ctgf(結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)、cxcl12(趨化因子(cxc基序)配體12(基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1))、cxcl2、dnmt3b(dna(胞嘧啶-5-)-甲基轉(zhuǎn)移酶3β)、ecgf1(胸腺嘧啶磷酸化酶)、edg1(內(nèi)皮細(xì)胞分化基因1)、edil3(egf樣重復(fù)和盤菌素i樣域3)、enpp2(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶2)、ephb2(eph受體b2)、fbln5(fibulin5)、f2鍵(凝血因子ii(凝血酶))、fgf1(酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、fgf2(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、figf(c-fos誘導(dǎo)的生長(zhǎng)因子(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子d))、flt4(fms-相關(guān)的酪氨酸激酶4)、fn1(纖維連接蛋白1)、fst(卵泡抑素)、foxc2(叉頭框c2(mfh-1、間質(zhì)細(xì)胞叉頭1))、grn(顆粒體蛋白)、hgf(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、hey1(yrpw相關(guān)發(fā)狀/分裂增強(qiáng)子基序1)、hspg2(硫酸乙酰肝素蛋白多糖2)、ifnb1(干擾素，β1，成纖維細(xì)胞)、il8(白細(xì)胞介素8)、il12a、itga4(整聯(lián)蛋白，α4；cd49d)、itgav(整聯(lián)蛋白，αv)、itgb3(整聯(lián)蛋白，β3)、mdk(肝素結(jié)合細(xì)胞因子)、mmp2(基質(zhì)金屬蛋白酶2)、myoz2(myozenin2)、nrp1(神經(jīng)氈蛋白1)、nrp2、pdgfb(血小板衍生的生長(zhǎng)因子β)、pdgfra基因(血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體α)、pdgfrb、pecam1(血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子)、pf4(血小板因子4)、pgk1(磷酸甘油酸激酶1)、prox1(prospero同源異形盒1)、ptn(多效蛋白)、sema3f(semophorin3f)、serpinb5(絲氨酸蛋白酶抑制蛋白肽酶抑制劑，分支乙(卵清蛋白)，成員5)、serpinc1、serpinf1、timp2(組織金屬蛋白酶2組織抑制劑)、timp3、tgfa(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，α)、tgfb1、thbs1(凝血酶致敏蛋白1)、thbs2、tie1(免疫球蛋白樣酪氨酸激酶和egf樣域1)、tie2/tek、tnf(腫瘤壞死因子)、tnni1(肌鈣蛋白i，1型)、tnfsf15(腫瘤壞死因子(配體)超家族，成員15)、vash1(血管抑制蛋白1)、vegf(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、vegfb、vegfc、vegfr1/flt1(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1)、和/或vegfr2/kdr。

當(dāng)使用人細(xì)胞時(shí)，全部的指定基因均表示人源序列，且如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，代表性的序列可以在文獻(xiàn)或在genbank中找到。這些序列的探針可以通過(guò)公共可獲得的序列進(jìn)行決定，或通過(guò)商業(yè)來(lái)源，例如，特異性探針或血管生成陣列(appliedbiosystems，商品號(hào)4378710)。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群顯示能夠表達(dá)血管生成相關(guān)蛋白的特性。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)cd49d、連接蛋白-43、hla-abc、β2-微球蛋白、cd349、cd318、pdl1、cd106、半乳凝素-1、adam17前體(a脫整聯(lián)蛋白及金屬蛋白酶域17)(tnf-α轉(zhuǎn)化酶)(tnf-α轉(zhuǎn)化酶)、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白a(α-細(xì)絲蛋白)(細(xì)絲蛋白1)(內(nèi)皮肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)(abp-280)(非肌肉細(xì)絲蛋白)、α-輔肌動(dòng)蛋白1(α-輔肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架亞型)(非肌肉α-輔肌動(dòng)蛋白1)(f-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白)、低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白2前體(巨蛋白)(糖蛋白330)(gp330)、i和ii型巨噬細(xì)胞清道夫受體(巨噬細(xì)胞乙酰化的ldl受體i和ii)、活化素受體iib型前體(actr-iib)、wnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞(gfap)、肌凝蛋白結(jié)合的蛋白c、心-型(心mybp-c)(c-蛋白、心肌亞型)、和/或肌球蛋白重鏈、非肌肉a型(細(xì)胞肌球蛋白重鏈，a型)(非肌肉肌球蛋白重鏈-a)(nmmhc-a)。

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞進(jìn)一步在例如內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)分泌促進(jìn)血管生成的蛋白。在某些實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞、羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群、或含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，例如，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，向例如細(xì)胞或細(xì)胞群生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中分泌vegf、hgf、il-8、mcp-3、fgf2、卵泡抑素、g-csf、egf、ena-78、gro、il-6、mcp-1、pdgf-bb、timp-2、upar、半乳凝素-1中的一種或多種或全部。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群能夠?qū)е略谂c所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞接觸的內(nèi)皮細(xì)胞群中形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，例如在諸如i和iv型的膠原蛋白，和/或諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、上皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)胞外基質(zhì)蛋白等血管生成因子的存在下，例如，在例如胎盤膠原蛋白的基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上或matrigel^tm中培養(yǎng)至少4天和/或多至14天后，羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞與人內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)形成芽或管樣結(jié)構(gòu)或支撐內(nèi)皮細(xì)胞出芽。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在諸如膠原蛋白i和iv型的胞外基質(zhì)蛋白存在下，在例如胎盤膠原蛋白的基質(zhì)內(nèi)或基質(zhì)上或matrigel^tm中培養(yǎng)時(shí)，分泌諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、上皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)、或白細(xì)胞介素-8(il-8)等血管生成因子，并從而能夠誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)血管生成的微rna(mirna)的水平高于骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述mirna包括mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、和/或mir-296中的一種或更多或全部。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞群，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群；或一種細(xì)胞群，其中所述分離的細(xì)胞群中至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)一種或更多或全部血管生成微rna(mirna)的水平低于骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞，其中所述mirna包括mir-20a、mir-20b、mir-221、mir-222、mir-15b、和/或mir-16中的一種或更多或全部。在某些實(shí)施方式中，amdac或amdac群體表達(dá)一種或多種或全部的血管生成mirna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、mir-20a、mir-20b、(血管生成mirna簇17-92的成員)、mir-296、mir-221、mir-222、mir-15b、和/或mir-16。

在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是cd49f⁺、hla-g^–、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–，且其中所述細(xì)胞：(a)經(jīng)免疫定位測(cè)定表達(dá)cd9、cd10、cd44、cd54、cd98、cd200、tie-2、tem-7、vegfr1/flt-1、或vegfr2/kdr(cd309)中的一種或多種；(b)經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd31、cd34、cd38、cd45、cd133、cd143、cd144、cd146、cd271、cxcr4、hla-g、或ve-鈣粘蛋白，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定不表達(dá)sox2；(c)表達(dá)以下的mrna：acta2、adamts1、amot、ang、angpt1、angpt2、angptl1、angptl2、angptl4、bai1、cd44、cd200、ceacam1、chga、col15a1、col18a1、col4a1、col4a2、col4a3、csf3、ctgf、cxcl12、cxcl2、dnmt3b、ecgf1、edg1、edil3、enpp2、ephb2、fbln5、f2、fgf1、fgf2、figf、flt4、fn1、fst、foxc2、grn、hgf、hey1、hspg2、ifnb1、il8、il12a、itga4、itgav、itgb3、mdk、mmp2、myoz2、nrp1、nrp2、pdgfb、pdgfra、pdgfrb、pecam1、pf4、pgk1、prox1、ptn、sema3f、serpinb5、serpinc1、serpinf1、timp2、timp3、tgfa、tgfb1、thbs1、thbs2、tie1、tie2/tek、tnf、tnni1、tnfsf15、vash1、vegf、vegfb、vegfc、vegfr1/flt1、或vegfr2/kdr；(d)表達(dá)蛋白質(zhì)cd49d、連接蛋白-43、hla-abc、β2-微球蛋白、cd349、cd318、pdl1、cd106、半乳凝素-1、adam17、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白a、α-輔肌動(dòng)蛋白1、巨蛋白、巨噬細(xì)胞乙?；膌dl受體i和ii、活化素受體iib型前體、wnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞、肌凝蛋白結(jié)合的蛋白c、或肌球蛋白重鏈，非肌肉a型中的一種或多種；(e)分泌vegf、hgf、il-8、mcp-3、fgf2、卵泡抑素、g-csf、egf、ena-78、gro、il-6、mcp-1、pdgf-bb、timp-2、upar、或半乳凝素-1至細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；(f)表達(dá)微rna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、或mir-296的水平高于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱?lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞；(g)表達(dá)微rna：mir-20a、mir-20b、mir-221、mir-222、mir-15b、或mir-16的水平低于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱?lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞；(h)表達(dá)mirna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、mir-20a、mir-20b、mir-296、mir-221、mir-222、mir-15b、或mir-16；和/或(i)較之在21％o2下表達(dá)cd202b、il-8或vegf而言，當(dāng)培養(yǎng)于低于約5％o2時(shí)表達(dá)增加水平的cd202b、il-8或vegf。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是cd49f⁺、hla-g^–、cd90⁺、cd105⁺、和cd117^–，和(a)經(jīng)免疫定位測(cè)定表達(dá)cd9、cd10、cd44、cd54、cd90、cd98、cd200、tie-2、tem-7、vegfr1/flt-1、和/或vegfr2/kdr(cd309)；(b)經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd31、cd34、cd38、cd45、cd133、cd143、cd144、cd146、cd271、cxcr4、hla-g、和/或ve-鈣粘蛋白，或經(jīng)rt-pcr測(cè)定不表達(dá)sox2；(c)表達(dá)以下的mrna：acta2、adamts1、amot、ang、angpt1、angpt2、angptl1、angptl2、angptl4、bai1、cd44、cd200、ceacam1、chga、col15a1、col18a1、col4a1、col4a2、col4a3、csf3、ctgf、cxcl12、cxcl2、dnmt3b、ecgf1、edg1、edil3、enpp2、ephb2、fbln5、f2、fgf1、fgf2、figf、flt4、fn1、fst、foxc2、grn、hgf、hey1、hspg2、ifnb1、il8、il12a、itga4、itgav、itgb3、mdk、mmp2、myoz2、nrp1、nrp2、pdgfb、pdgfra、pdgfrb、pecam1、pf4、pgk1、prox1、ptn、sema3f、serpinb5、serpinc1、serpinf1、timp2、timp3、tgfa、tgfb1、thbs1、thbs2、tie1、tie2/tek、tnf、tnni1、tnfsf15、vash1、vegf、vegfb、vegfc、vegfr1/flt1、和/或vegfr2/kdr；(d)表達(dá)cd49d、連接蛋白-43、hla-abc、β2-微球蛋白、cd349、cd318、pdl1、cd106、半乳凝素-1、adam17、血管緊張肽原前體、細(xì)絲蛋白a、α-輔肌動(dòng)蛋白1、巨蛋白、巨噬細(xì)胞乙酰化的ldl受體i和ii、活化素受體iib型前體、wnt-9蛋白、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、星形細(xì)胞、肌凝蛋白結(jié)合的蛋白c、和/或肌球蛋白重鏈，非肌肉a型中的一種或多種；(e)分泌vegf、hgf、il-8、mcp-3、fgf2、卵泡抑素、g-csf、egf、ena-78、gro、il-6、mcp-1、pdgf-bb、timp-2、upar、和/或半乳凝素-1，例如至細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中；(f)表達(dá)微rna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、和/或mir-296的水平高于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱?lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞；(g)表達(dá)微rna：mir-20a、mir-20b、mir-221、mir-222、mir-15b、和/或mir-16的水平低于數(shù)量相當(dāng)?shù)墓撬鑱?lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞；(h)表達(dá)mirna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、mir-20a、mir-20b、mir-296、mir-221、mir-222、mir-15b、和/或mir-16；和/或(i)較之在21％o2下表達(dá)cd202b、il-8或vegf而言，當(dāng)培養(yǎng)于低于約5％o2時(shí)表達(dá)增加水平的cd202b、il-8或vegf。進(jìn)一步本發(fā)明提供了包含amdac的細(xì)胞群，例如amdac群體，其具有一種或多種的上述特性。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群分泌血管生成因子。在具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、上皮生長(zhǎng)因子(egf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)、和/或白細(xì)胞介素-8(il-8)。在其它具體的實(shí)施方式中，含有羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞的細(xì)胞群分泌一種或更多血管生成因子，從而誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞在體外創(chuàng)傷愈合分析中進(jìn)行遷移。在其它具體的實(shí)施方式中，含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、肌細(xì)胞或成肌細(xì)胞的成熟、分化或增殖。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，任何上述含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在諸如膠原蛋白i和iv型的胞外基質(zhì)蛋白和/或一種或更多諸如vegf、egf、pdgf或bfgf等血管生成因子存在下，在例如胎盤膠原蛋白或matrigel^tm的基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)，吸收乙?；兔苤鞍?ldl)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞附著于組織培養(yǎng)塑料，且其中所述細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、或ve-鈣粘蛋白^–。在具體的實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞群中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞是羊膜來(lái)源的細(xì)胞，其經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、或ve-鈣粘蛋白^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體中的細(xì)胞中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％是羊膜來(lái)源的細(xì)胞，其經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、和ve-鈣粘蛋白^–。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述經(jīng)rt-pcr測(cè)定是oct-4^–和經(jīng)免疫定位測(cè)定是vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、或ve-鈣粘蛋白^–的細(xì)胞，在暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞還為ve-鈣粘蛋白^–。

在此提供的細(xì)胞群，包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，能夠形成芽或管樣結(jié)構(gòu)，類似于血管或脈管。在一個(gè)實(shí)施方式中，在諸如vegf，egf，pdgf或bfgf的血管生成部分(moiety)存在下培養(yǎng)時(shí)，含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述經(jīng)rt-pcr測(cè)定oct-4^–和經(jīng)免疫定位測(cè)定vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺、或ve-鈣粘蛋白^–的羊膜來(lái)源的細(xì)胞，當(dāng)所述細(xì)胞群在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)存在下培養(yǎng)時(shí)形成芽或管樣結(jié)構(gòu)。

在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在原代培養(yǎng)或在適合干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中增殖的過(guò)程中表現(xiàn)出上述特性，例如，細(xì)胞表面標(biāo)記和/或基因表達(dá)譜，和/或血管生成能力和功能的組合。所述培養(yǎng)基包括，例如，含有1-100％dmem-lg(gibco)、1-100％mcdb-201(sigma)、1-10％胎牛血清(fcs)(hyclonelaboratories)、0.1-5×胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(its,sigma)、0.1-5×亞油酸-牛血清白蛋白(la-bsa,sigma)、10^-5-10^-15m地塞米松(sigma)、10^-2-10^-10m抗壞血酸2-磷酸鹽(sigma)、1-50ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(egf)(r&dsystems)、1-50ng/ml血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)(r&dsystems)、和100u青霉素/1000u鏈霉素的培養(yǎng)基。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，培養(yǎng)基含有60％dmem-lg(gibco)、40％mcdb-201(sigma)、2％胎牛血清(fcs)(hyclonelaboratories)、1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(its)、1×亞油酸牛血清白蛋白(la-bsa)、10^-9m地塞米松(sigma)、10^-4m抗壞血酸2-磷酸鹽(sigma)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)10ng/ml(r&dsystems)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)10ng/ml(r&dsystems)、和100u青霉素/1000u鏈霉素。其它合適的培養(yǎng)基如下詳述。

在此提供的分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群可以例如在一個(gè)容器中包含約、至少約、或不多于約1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在不同的實(shí)施方式中，在此提供的分離的細(xì)胞群中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％的細(xì)胞為羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。即，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群可以包括，例如，多達(dá)1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的非干細(xì)胞。

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可在基質(zhì)上培養(yǎng)。在不同的實(shí)施方式中，該基質(zhì)可以是任何表面，其上可以進(jìn)行羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)和/或篩選。一般，該基質(zhì)是塑料，例如，組織培養(yǎng)皿或多孔板塑料?？墒褂蒙锓肿踊蚝铣赡M試劑對(duì)組織培養(yǎng)塑料進(jìn)行處理、包被或印跡，例如，celltart^tm、mesencult^tmacf-底物、鳥(niǎo)氨酸、或聚賴氨酸，或胞外基質(zhì)蛋白，例如，膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、玻璃體粘連蛋白等。

羊膜來(lái)源的細(xì)胞，例如，在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞及該細(xì)胞群，可以分離自一種或更多的胎盤。例如，在此提供的分離的羊膜來(lái)源的細(xì)胞群可以是胎盤細(xì)胞群，包含那些來(lái)自于或包含于破碎的羊膜組織的細(xì)胞，例如，組織消化物(即，通過(guò)酶促消化羊膜收集細(xì)胞)，其中所述細(xì)胞群富集了羊膜來(lái)源的細(xì)胞，且其中組織來(lái)自于單一胎盤或來(lái)自兩個(gè)或更多胎盤。分離的羊膜來(lái)源的細(xì)胞可被培養(yǎng)和擴(kuò)增以產(chǎn)生所述細(xì)胞群。含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群也可被培養(yǎng)和擴(kuò)增以產(chǎn)生羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群。

在某些實(shí)施方式中，展示任何上述標(biāo)記和/或基因表達(dá)特性的amdac已被傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多。在某些其它的實(shí)施方式中，展示任何上述標(biāo)記和/或基因表達(dá)特性的amdac已在培養(yǎng)物中傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50次，或更多。

5.2含有其它細(xì)胞類型的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群

含有在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的分離的細(xì)胞群可以包含第二種細(xì)胞類型，例如，不是羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的胎盤細(xì)胞，或者，例如，不是胎盤細(xì)胞的細(xì)胞。例如，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群可以包含，例如，可以與第二種細(xì)胞類型的群體組合，其中所述第二種細(xì)胞類型為，例如，胚胎干細(xì)胞；血細(xì)胞(例如，胎盤血、胎盤血細(xì)胞、臍帶血、臍帶血細(xì)胞、周邊血、周邊血細(xì)胞，來(lái)自胎盤血、臍帶血、或周邊血的有核細(xì)胞、等等)；分離自血液的干細(xì)胞(例如，分離自胎盤血、臍帶血或周邊血的干細(xì)胞)；胎盤干細(xì)胞(例如，描述于美國(guó)專利號(hào)7,468,276和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的胎盤干細(xì)胞，其公開(kāi)內(nèi)容全文引入作為參考)；來(lái)自胎盤灌流液的有核細(xì)胞，例如，來(lái)自胎盤灌流液的總有核細(xì)胞；臍帶血干細(xì)胞；血液來(lái)源的有核細(xì)胞群；骨髓來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞；骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞；骨髓來(lái)源的造血干細(xì)胞；粗骨髓；成體(體)干細(xì)胞；組織中包含的干細(xì)胞群；培養(yǎng)的細(xì)胞，例如，培養(yǎng)的干細(xì)胞；全分化細(xì)胞群(例如，軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、格根包爾氏細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞，等)；周邊細(xì)胞，等等。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群包含胎盤干細(xì)胞或來(lái)自臍帶血的干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型是血液或血細(xì)胞，其中紅細(xì)胞已經(jīng)從細(xì)胞群中移除。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型是造血干細(xì)胞。該造血干細(xì)胞可以是存在于，例如，未加工的胎盤、臍帶血或周邊血中；來(lái)自胎盤血、臍帶血或周邊血的總有核細(xì)胞中；分離自胎盤血、臍帶血或周邊血的cd34⁺細(xì)胞群中；未加工的骨髓中；來(lái)自骨髓的總有核細(xì)胞中；分離自骨髓cd34⁺細(xì)胞群中，等。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群與來(lái)自血管系統(tǒng)的多個(gè)成體細(xì)胞或祖細(xì)胞組合。在不同的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、周邊細(xì)胞、成血管細(xì)胞、成肌細(xì)胞或心成肌細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，第二種細(xì)胞類型為培養(yǎng)中經(jīng)處理的非胚胎細(xì)胞類型，以表達(dá)與胚胎干細(xì)胞相關(guān)的多能性和功能標(biāo)記。

在上述分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群的具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和第二種類型的細(xì)胞的其一或全部對(duì)于細(xì)胞的預(yù)定接受者而言為自體同源的或?yàn)楫愒吹摹?/p>

在此進(jìn)一步提供了一種組合物，其包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和除羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞外的多種干細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述組合物包含一種干細(xì)胞，其來(lái)自胎盤，即，胎盤干細(xì)胞，例如，描述于美國(guó)專利號(hào)7,045,148、7,255,879、和7,311,905；和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的胎盤干細(xì)胞，任何上述文獻(xiàn)公開(kāi)的內(nèi)容在此全文引入作為參考。在具體的實(shí)施方式中，所述胎盤干細(xì)胞是cd200⁺和hla-g⁺；cd73⁺、cd105⁺和cd200⁺；cd200⁺和oct-4⁺；cd73⁺、cd105⁺和hla-g⁺；cd73⁺和cd105⁺，并且，當(dāng)所述群體在允許形成擬胚體的條件下培養(yǎng)時(shí)有利于在含有所述干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一種或更多擬胚體；或oct-4⁺，并且，當(dāng)所述群體在允許形成擬胚體的條件下培養(yǎng)時(shí)有利于在含有所述干細(xì)胞的胎盤細(xì)胞群中形成一種或更多擬胚體；或其任意組合。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述cd200⁺、hla-g⁺干細(xì)胞是cd34^–、cd38^–、cd45^–、cd73⁺和cd105⁺。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述cd73⁺、cd105⁺和cd200⁺干細(xì)胞是cd34^–、cd38^–、cd45^–和hla-g⁺。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述cd200⁺、oct-4⁺干細(xì)胞是cd34^–、cd38^–、cd45^–、cd73⁺、cd105⁺和hla-g⁺。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述cd73⁺、cd105⁺和hla-g⁺干細(xì)胞是cd34^–、cd45^–、oct-4⁺和cd200⁺。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述cd73⁺和cd105⁺干細(xì)胞是oct-4⁺、cd34^–、cd38^–和cd45^–。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述oct-4⁺干細(xì)胞是cd73⁺、cd105⁺、cd200⁺、cd34^–、cd38^–、和cd45^–。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，胎盤干細(xì)胞是來(lái)源于母親的(即，具有母親的基因型)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，胎盤干細(xì)胞是來(lái)源于父親的(即，具有父親的基因型)。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述組合物包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞，例如，骨髓來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含骨髓來(lái)源的造血干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和造血祖細(xì)胞，例如，來(lái)自骨髓、胎血、臍帶血、胎盤血、和/或周邊血的造血祖細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，組合物包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和體干細(xì)胞。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述體干細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、胰干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、心干細(xì)胞、或肌肉干細(xì)胞。

在其它具體的實(shí)施方式中，所述第二種細(xì)胞類型包括約、至少、或不多于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％的所述群體中的細(xì)胞。在其它具體的實(shí)施方式中，在所述組合物中的amdac包括至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的在所述組合物中的細(xì)胞。在其它具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞包括約、至少、或不多于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、或45％的所述群體中的細(xì)胞。

分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群中的細(xì)胞可以與另一種類型的多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組合，例如，與干細(xì)胞群組合，其與每個(gè)群體中的總有核細(xì)胞數(shù)量的比例為約100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:500、1:1,000、1:2,000、1:5,000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000、或約1:100,000,000。分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群中的細(xì)胞也可以與多種類型的多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組合。

5.3生長(zhǎng)培養(yǎng)

對(duì)于任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)取決于選定用于生長(zhǎng)的特殊培養(yǎng)基。在最優(yōu)選條件下，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞一般約24小時(shí)后數(shù)量倍增。在培養(yǎng)過(guò)程中，在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞附著于培養(yǎng)基質(zhì)，例如組織培養(yǎng)容器的表面(例如，組織培養(yǎng)皿塑料，纖維粘連蛋白-包被的塑料，等等)并形成單層。一般，細(xì)胞在羊膜消化后2-7天內(nèi)在培養(yǎng)中穩(wěn)定建立。其以每天約0.4-1.2個(gè)群體倍增的速度進(jìn)行增殖，并可以經(jīng)歷至少30-50次群體倍增。細(xì)胞在半滿(subconfluence)和擴(kuò)增狀態(tài)中表現(xiàn)為間質(zhì)/成纖維細(xì)胞樣表型，并在全滿(confluence)狀態(tài)表現(xiàn)為立方形/鵝卵石樣外觀，且培養(yǎng)增殖是強(qiáng)接觸抑制的。在培養(yǎng)擴(kuò)增中羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞群可以形成胚狀體。

5.4獲得羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞的方法

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群可通過(guò)以下方式制備，例如，分離自其它細(xì)胞或細(xì)胞群，例如，通過(guò)特殊的方法消化羊膜組織，并且可選地對(duì)得到的細(xì)胞或細(xì)胞群進(jìn)行檢測(cè)判斷其是否存在標(biāo)記或標(biāo)記組合，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的特性，或通過(guò)獲得羊膜細(xì)胞并基于標(biāo)記選擇羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的特性。

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和分離的含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，可以通過(guò)例如消化羊膜組織并進(jìn)而選擇貼壁細(xì)胞來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或分離的含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，可通過(guò)以下步驟制備：(1)用第一種酶消化羊膜組織，從羊膜間質(zhì)層細(xì)胞上的羊膜表皮層解離細(xì)胞；(2)然后用第二種酶消化羊膜間質(zhì)層形成單細(xì)胞懸液；(3)在例如組織培養(yǎng)塑料的組織培養(yǎng)表面上的所述單細(xì)胞懸液中培養(yǎng)細(xì)胞；以及(4)篩選在更換培養(yǎng)基后附著于所述表面的細(xì)胞，從而制備分離的含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一種酶是胰蛋白酶。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述胰蛋白酶使用濃度為0.25％胰蛋白酶(w/v)，用于5-20毫升，例如，10毫升溶液每克要消化的羊膜組織中。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述胰蛋白酶消化在37℃下進(jìn)行約15分鐘并重復(fù)多達(dá)3次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第二種酶為膠原蛋白酶。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述膠原蛋白酶的使用濃度為50-500u/l，用于5ml每克要消化的羊膜組織。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述用膠原蛋白酶消化在37℃下進(jìn)行約45-60分鐘。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶消化后形成的單細(xì)胞懸液在步驟(2)和步驟(3)之間使用例如75μm–150μm濾器進(jìn)行過(guò)濾。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一種酶是胰蛋白酶，且所述第二種酶是膠原蛋白酶。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離的含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群能夠通過(guò)從羊膜選擇細(xì)胞獲得，例如，通過(guò)本文其它部分描述的消化羊膜組織獲得細(xì)胞，其表現(xiàn)出一種或更多的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞特性。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備，包括選擇下述羊膜細(xì)胞：(a)經(jīng)rt-pcr測(cè)定oct-4呈陰性，和(b)經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr2/kdr、cd9、cd54、cd105、cd200中的一種或多種呈陽(yáng)性；以及從其它細(xì)胞中分離所述細(xì)胞形成細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜細(xì)胞還是ve-鈣粘蛋白^–。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群通過(guò)選擇以下胎盤細(xì)胞制備：(a)經(jīng)rt-pcr測(cè)定oct-4呈陰性和經(jīng)免疫定位測(cè)定ve-鈣粘蛋白呈陰性，和(b)經(jīng)免疫定位測(cè)定vegfr2/kdr、cd9、cd54、cd105、cd200中的一種或多種呈陽(yáng)性；以及從其它細(xì)胞中分離所述細(xì)胞形成細(xì)胞群。在某些實(shí)施方式中，在通過(guò)rt-pcr進(jìn)行選擇之前通過(guò)免疫定位進(jìn)行選擇。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述選擇包括選擇在1-100ng/mlvegf存在下培養(yǎng)4-21天后不表達(dá)細(xì)胞標(biāo)記cd34的細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，例如，細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備，包括選擇附著于組織培養(yǎng)塑料并經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–、和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr1/flt-1⁺和vegfr2/kdr⁺的羊膜細(xì)胞，以及從其它細(xì)胞中分離所述細(xì)胞形成的細(xì)胞群。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備，其包括選擇經(jīng)rt-pcr測(cè)定為oct-4^–，和經(jīng)免疫定位測(cè)定為vegfr1/flt-1⁺、vegfr2/kdr⁺和hla-g^–的羊膜細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群通過(guò)以下方法制備，其中選擇經(jīng)免疫定位測(cè)定還為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–、和/或cxcr4^–(趨化因子(c-x-c基序)受體4)中的一種或多種或全部的羊膜細(xì)胞，并從沒(méi)有表現(xiàn)出一種或多種的這些特性的細(xì)胞中分離所述細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群通過(guò)選擇經(jīng)免疫定位測(cè)定還是ve-鈣粘蛋白^–的羊膜細(xì)胞，并從ve-鈣粘蛋白⁺的細(xì)胞中分離所述細(xì)胞進(jìn)行制備。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群通過(guò)選擇經(jīng)免疫定位測(cè)定還是cd105⁺和cd200⁺的羊膜細(xì)胞，并從cd105^–或cd200^–的細(xì)胞中分離所述細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞暴露于1-100ng/ml的vegf下4-21天后經(jīng)免疫定位測(cè)定不表達(dá)cd34。

在細(xì)胞選擇中，沒(méi)有必要檢測(cè)整個(gè)細(xì)胞群的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞特性。相反，可以檢測(cè)細(xì)胞群的一種或更多的部分細(xì)胞(例如，約0.5％-2％)的這些特性，并將結(jié)果用于計(jì)算群體中剩下的細(xì)胞。

選擇的細(xì)胞可以通過(guò)下述方式被確認(rèn)為在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞：在vegf(例如，約50ng/ml)存在下，在基質(zhì)例如matrigel^tm上將細(xì)胞樣品(例如，約10⁴至約10⁵細(xì)胞)培養(yǎng)4-14天，例如，7天，并肉眼觀察細(xì)胞出芽和/或細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的出現(xiàn)。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可使用細(xì)胞篩選領(lǐng)域已知的任何方法通過(guò)上述標(biāo)記進(jìn)行選擇。例如，貼壁細(xì)胞可以在例如流式細(xì)胞術(shù)或facs免疫定位中使用針對(duì)一種或更多細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體或多種抗體進(jìn)行篩選?？梢酝ㄟ^(guò)使用結(jié)合磁珠的抗體來(lái)進(jìn)行選擇。特異性針對(duì)某種標(biāo)記的抗體是本領(lǐng)域已知的并可通過(guò)商購(gòu)獲得，例如，抗cd9(abcam)、cd54(abcam)、cd105(abcam；biodesigninternational，saco，me，等)、cd200(abcam)細(xì)胞角蛋白(sigmaaldrich)抗體?？蛊渌鼧?biāo)記的抗體也是可通過(guò)商購(gòu)獲得的，例如，cd34、cd38和cd45可購(gòu)自，例如，stemcelltechnologies或biodesigninternational。適于rt-pcr的oct-4序列的引物可購(gòu)自，例如，millipore或invitrogen，或可以容易地衍生自genbank登錄號(hào)dq486513的人序列。

獲得胎盤和羊膜組織的方法以及為獲得羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞而對(duì)該組織進(jìn)行處理的詳細(xì)方法提供如下。

5.4.1細(xì)胞收集組合物

一般地，可以從哺乳動(dòng)物胎盤的羊膜中獲得細(xì)胞，例如，人胎盤，其中使用生理可接受的溶液，例如，細(xì)胞收集組合物。優(yōu)選的，細(xì)胞收集組合物預(yù)防或抑制凋亡，預(yù)防或抑制細(xì)胞死亡、裂解、分解等等。細(xì)胞收集組合物詳細(xì)描述于相關(guān)的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0190042，標(biāo)題為“improvedmediumforcollectingplacentalstemcellsandpreservingorgans,”其公開(kāi)內(nèi)容在此全文引入作為參考。

細(xì)胞收集組合物可以包括任何適于收集和/或培養(yǎng)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的生理可接受的溶液，例如，鹽溶液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水、kreb溶液、修飾的kreb溶液、eagle溶液、0.9％nacl等)、培養(yǎng)基(例如，dmem、h.dmem等)，等等，其中添加或不添加緩沖成分，例如，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)。

細(xì)胞收集組合物可以包含一種或更多保護(hù)細(xì)胞(例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞)的組分，即，從收集開(kāi)始到培養(yǎng)的時(shí)間內(nèi)防止細(xì)胞死亡，或延遲細(xì)胞死亡，減少死亡的細(xì)胞群中的細(xì)胞數(shù)量，等。該組分可以是，例如，凋亡抑制劑(例如，半胱天冬酶抑制劑或jnk抑制劑)；血管擴(kuò)張劑(例如，硫酸鎂、抗高血壓藥、心房利鈉肽(anp)、促腎上腺皮質(zhì)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、硝普鈉、肼苯噠嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷酸二酯酶抑制劑等)；壞死抑制劑(例如，2-(1h-吲哚-3-基)-3-戊胺-馬來(lái)酰亞胺、二硫代氨基甲酸吡咯烷或氯硝西泮)；tnf-α抑制劑；和/或攜氧全氟化碳(例如，全氟溴辛烷、全氟溴癸烷等)。

細(xì)胞收集組合物可以包含一種或更多組織降解酶，例如，金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、rna酶、或dna酶等。這些酶包括但不限于膠原蛋白酶(例如，膠原蛋白酶i、ii、iii或iv，來(lái)自溶組織梭菌(clostridiumhistolyticum)的膠原蛋白酶等)；分散酶，嗜熱菌蛋白酶，彈性蛋白酶，胰蛋白酶，liberase^tm，透明質(zhì)酸酶，等等。含有組織消化酶的細(xì)胞收集組合物的用途如下詳述。

細(xì)胞收集組合物可以包含殺菌或抑菌有效量的抗生素。在一些非限制性的實(shí)施方式中，抗生素為大環(huán)內(nèi)酯類(例如，妥布霉素)、頭孢菌素(例如，頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐)、克拉霉素、紅霉素、青霉素(例如，青霉素v)或喹諾酮(例如，氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星)、四環(huán)素、鏈霉素等。在一個(gè)特殊的實(shí)施方式中，抗生素活性針對(duì)gram(+)和/或gram(–)細(xì)菌，例如，綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、金黃色釀膿葡萄球菌(staphylococcusaureus)，等等。

細(xì)胞收集組合物還可以包含一種或多種的下述化合物：腺苷(約1mm至約50mm)；d-葡萄糖(約20mm至約100mm)；鎂離子(約1mm至約50mm)；分子量大于20,000道爾頓的大分子，在一個(gè)實(shí)施方式中，其含量足以維持內(nèi)皮完整性和細(xì)胞生存(例如，合成的或天然產(chǎn)生的膠體、多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，含量約25g/l至約100g/l，或約40g/l至約60g/l)；抗氧化劑(例如，丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素c或維生素e，含量為約25m至約100m)；還原劑(例如，n-乙酰半胱氨酸，含量為約0.1mm至約5mm)；防止鈣進(jìn)入細(xì)胞的試劑(例如，異搏定，含量為約2m至約25m)；硝化甘油(例如，約0.05g/l至約0.2g/l)；抗凝血?jiǎng)?，在一個(gè)實(shí)施方式中，其含量足以幫助防止殘血凝塊(例如，肝磷脂或水蛭素，含量為濃度約1000單位/l至約100,000單位/l)；或含氨氯吡脒化合物(例如，氨氯吡脒、乙基異丙基氨氯吡脒、六甲撐氨氯吡脒、二甲基氨氯吡脒或異丁基氨氯吡脒，含量為約1.0m至約5m)。

在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞也可以在例如下述消化過(guò)程中以及消化后被收集到簡(jiǎn)單的生理可接受緩沖液中，例如，磷酸鹽緩沖鹽水、0.9％nacl溶液、細(xì)胞培養(yǎng)基，等。

5.4.2收集和處理胎盤

一般地，人胎盤在其出生后排出體內(nèi)的短時(shí)間內(nèi)或在例如剖腹產(chǎn)之后進(jìn)行收集。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在對(duì)患者進(jìn)行知會(huì)同意并獲得該患者的完整病歷且與胎盤關(guān)聯(lián)后回收胎盤。優(yōu)選的，在分娩后繼續(xù)跟蹤病歷。該病歷可用于調(diào)整從中獲得的胎盤或細(xì)胞的后續(xù)應(yīng)用。例如，人胎盤細(xì)胞，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，可以按照病歷被用于嬰兒、或與胎盤有關(guān)的近親屬、或父母、兄弟姐妹或嬰兒的其它親屬的個(gè)體化用藥。

在回收羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞前移除臍帶血和胎盤血。在某些實(shí)施方式中，分娩后回收胎盤中的臍帶血。胎盤可被用于臍帶血常規(guī)回收過(guò)程。一般使用針或套管，在重力作用下給胎盤抽血(參見(jiàn)，例如，anderson，美國(guó)專利號(hào)5,372,581；hessel等人，美國(guó)專利號(hào)5,415,665)。針或套管通常置于臍帶靜脈，胎盤可以被輕柔的擠壓以幫助排空胎盤中的臍帶血。該臍帶血回收可以商業(yè)化地進(jìn)行，例如，lifebankusa，cedarknolls，n.j.，viacord，cordbloodregistryandcryocell。優(yōu)選的，用重力排空胎盤而不進(jìn)行進(jìn)一步操作，從而使得臍帶血回收中的組織破壞得以最小化。

一般地，將胎盤從分娩室或產(chǎn)房轉(zhuǎn)移到另一位置，例如，實(shí)驗(yàn)室中，用于通過(guò)例如灌注或組織解離來(lái)回收臍帶血并收集細(xì)胞。優(yōu)選的將胎盤轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的、隔熱的轉(zhuǎn)移設(shè)備(保持胎盤溫度20-28℃)中，例如，將胎盤與近端夾緊的臍帶血置于無(wú)菌拉鏈塑料袋中，后者接著被置于隔熱容器中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，胎盤使用基本上按照描述于美國(guó)專利號(hào)7,147,626的臍帶血收集試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的，胎盤在分娩后4-24小時(shí)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。在某些實(shí)施方式中，優(yōu)選的在臍帶血回收前，在)臍帶插入胎盤的4-5cm厘米處夾緊近端臍帶。在其它實(shí)施方式中，在臍帶血回收后和進(jìn)一步處理胎盤之前，夾緊近端臍帶。

在細(xì)胞收集之前可以將胎盤儲(chǔ)藏在無(wú)菌條件以及例如4-25℃(攝氏度)的溫度下，例如，室溫下。在灌注胎盤除去任何殘留的臍帶血之前，可以儲(chǔ)藏胎盤例如0-24小時(shí)、高達(dá)48小時(shí)、或多于48小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，在排出后約0小時(shí)至約2小時(shí)收獲胎盤。胎盤可以在例如4-25℃(攝氏度)的溫度下儲(chǔ)藏于抗凝血?jiǎng)┤芤褐?。合適的抗凝血?jiǎng)┤芤菏潜绢I(lǐng)域熟知的。例如，可以使用檸檬酸鈉、肝磷脂或華法令鈉溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗凝血?jiǎng)┤芤喊ǜ瘟字芤?例如，在1:1000溶液中1％w/w)。優(yōu)選的抽血胎盤在收集細(xì)胞前儲(chǔ)藏不多于36小時(shí)。

5.4.3羊膜組織的物理破碎和酶促消化

在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜分離自剩余的胎盤，例如，通過(guò)鈍器解剖，例如，使用手指。在酶促消化和貼壁細(xì)胞回收之前可以將羊膜切成例如小塊或組織片段。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以獲得自完整羊膜，或來(lái)自羊膜的小塊部分，例如，面積為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或約1000平方毫米的羊膜的部分。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞一般可以收集自胎盤羊膜或其部分，其可以在排出后約前3天內(nèi)的任何時(shí)間進(jìn)行，但優(yōu)選排出后約0小時(shí)至48小時(shí)，或排出后約8小時(shí)至約18小時(shí)進(jìn)行。

在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)使用一種或更多組織消化酶進(jìn)行酶促消化將羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞自羊膜組織分離。羊膜或其部分可以使用例如一種或更多酶進(jìn)行消化，所述酶溶解或混合入如上所述的細(xì)胞收集組合物中。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞收集組合物包含一種或更多組織破壞性酶。酶促消化優(yōu)選使用酶的組合，例如，基質(zhì)金屬蛋白酶和中性蛋白酶的組合，例如，分散酶和膠原蛋白酶的組合，例如，相繼使用。當(dāng)使用多于一種蛋白酶時(shí)，所述蛋白酶可以同時(shí)使用或連續(xù)使用以消化羊膜組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，羊膜組織用胰蛋白酶消化3次，然后用膠原蛋白酶消化一次。

在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜組織使用一種或多種的基質(zhì)金屬蛋白酶、中性蛋白酶和粘液分解酶進(jìn)行酶促消化。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜組織使用膠原蛋白酶、分散酶和透明質(zhì)酸酶的組合進(jìn)行消化。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜組織使用liberase^tm(boehringermannheimcorp.，indianapolis，ind.)和透明質(zhì)酸酶的組合進(jìn)行消化。其它可用于破壞羊膜組織的酶包括木瓜蛋白酶，脫氧核糖核酸酶，絲氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶或彈性蛋白酶。絲氨酸蛋白酶在血清中能夠被α2微球蛋白抑制，從而用于消化的培養(yǎng)基在某些實(shí)施方式中可以是無(wú)血清的。在某些其它的實(shí)施方式中，edta和dna酶被用于消化羊膜組織，例如，為了增加細(xì)胞回收效率。在某些其它的實(shí)施方式中，對(duì)消化物進(jìn)行稀釋從而避免細(xì)胞陷入粘性消化物中。

一般組織消化酶的濃度包括，例如，50-200u/ml的膠原蛋白酶i和膠原蛋白酶iv、1-10u/ml的分散酶、和10-100u/ml的彈性蛋白酶。蛋白酶可以組合使用，即，在相同消化反應(yīng)中使用兩種或更多蛋白酶，或可以相繼使用以分離羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜組織或其部分首先使用合適量的胰蛋白酶在濃度約0.25％、37℃下消化例如15分鐘，然后使用約1至約2mg/ml的膠原蛋白酶i消化例如45分鐘。

在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以按照如下方式獲得。將羊膜切成0.1”×0.1”至約5”×5”，例如2”×2”大小的碎片。通過(guò)三次如下胰蛋白酶消化將上皮單層從羊膜的胚胎側(cè)去除。將羊膜碎片置于裝有溫?zé)岬?例如，約20℃至約37℃)胰蛋白酶-edta溶液(0.25％)的容器中。胰蛋白酶的體積可以是從約5ml每克羊膜至約50ml每克羊膜。將容器振蕩約5分鐘至約30分鐘，例如，15分鐘，并保持溫度恒定。然后將羊膜碎片從胰蛋白酶溶液中分離，其中可以采用任何合適的方法，例如手工去除羊膜碎片，或通過(guò)過(guò)濾去除羊膜碎片。胰蛋白酶消化步驟可以重復(fù)至少一次以上。

在胰蛋白酶消化最終結(jié)束后，將羊膜碎片放回裝有諸如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)/10％fbs、pbs/5％fbs或pbs/3％fbs的溫?zé)岬囊鹊鞍酌钢泻腿芤旱娜萜髦?。將容器振蕩約5秒至約30分鐘，例如，5分鐘。然后將羊膜碎片從如上所述的胰蛋白酶中和溶液中進(jìn)行分離，并將羊膜碎片置于裝有溫?zé)岬膒h7.2pbs的容器中。將容器振蕩約5秒至約30分鐘，將羊膜碎片從如上所述pbs中進(jìn)行分離。

然后將羊膜碎片置于裝有溫?zé)岬?例如，約20℃至約37℃)消化溶液的容器中。消化溶液的體積可以是從約5ml每克羊膜至約50ml每克羊膜。消化溶液包含在諸如dmem的合適培養(yǎng)基中的消化酶。典型的消化溶液包括i型膠原蛋白酶(約50u/ml至約500u/ml)；i型膠原蛋白酶(約50u/ml至約500u/ml)加分散酶(約5u/ml至約100u/ml)；以及i型膠原蛋白酶(約50u/ml至約500u/ml)、分散酶(約2u/ml至約50u/ml)和透明質(zhì)酸酶(約3u/ml至約10u/ml)。將容器在37℃下振蕩，直至羊膜消化基本上完成(大約10分鐘至約90分鐘)。然后在容器中加入溫?zé)岬膒bs/5％fbs，比例為約1ml每克羊膜組織至約50ml每克羊膜組織。將容器振蕩約2分鐘至約5分鐘。然后用40μm-100μm濾器過(guò)濾細(xì)胞懸液去除任何未消化的組織。將細(xì)胞懸浮于溫?zé)岬膒bs(約1ml至約500ml)，然后在200×g至約400×g下離心約5分鐘至約30分鐘，例如20℃下300×g離心約15分鐘。離心后，去除上清液并將細(xì)胞重懸于合適的培養(yǎng)基。細(xì)胞懸液可以過(guò)濾(40μm-70μm濾器)去除任何剩余的未消化組織，產(chǎn)生單一細(xì)胞懸液。

在本實(shí)施方式中，將收集懸液中的細(xì)胞并按照本文其它部分所描述的方式培養(yǎng)，以產(chǎn)生分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞及其細(xì)胞群。在本實(shí)施方式中，可以丟棄剩余的未消化羊膜?？梢酝ㄟ^(guò)例如離心進(jìn)行收集從羊膜組織釋放的細(xì)胞，并培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基中。

在本文任一消化流程中，可以將消化獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行過(guò)濾，例如，通過(guò)含有從約50μm至約150μm，例如，從約75μm至約125μm的孔的濾器進(jìn)行過(guò)濾。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞懸液可以通過(guò)兩個(gè)或更多濾器進(jìn)行過(guò)濾，例如，一個(gè)125μm濾器和一個(gè)75μm濾器。

與在此描述的任何方法一起，可以在消化過(guò)程中通過(guò)選擇能夠表達(dá)一種或更多amdac特性的細(xì)胞從釋放的細(xì)胞中分離amdac，如上述5.1部分的描述。

amdac也可以使用例如特別的兩步分離法進(jìn)行分離，其包括胰蛋白酶消化然后膠原蛋白酶消化。從而，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的方法，包括胰蛋白酶消化羊膜或其部分，從而從所述羊膜中釋放上皮細(xì)胞；從所述上皮細(xì)胞去除羊膜或其部分；進(jìn)一步用膠原蛋白酶消化羊膜或其部分，從而從所述羊膜或其部分中釋放羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞；以及從所述羊膜中分離所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜或其部分的消化重復(fù)至少一次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，羊膜或其部分的膠原蛋白酶消化重復(fù)至少一次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，胰蛋白酶為約0.1％-1.0％(終濃度)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，胰蛋白酶為約0.25％(終濃度)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶為約50u/ml至約1000u/ml(終濃度)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，膠原蛋白酶為約125u/ml(終濃度)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，分離方法還包括在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，并將所述培養(yǎng)物中的非貼壁細(xì)胞與所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞進(jìn)行分離以產(chǎn)生富集羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的群體。在更加具體的實(shí)施方式中，所述富集羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的細(xì)胞為所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。

在上述方法的一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞經(jīng)rt-pcr測(cè)定oct-4呈陰性和經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定為hla-g⁺、cd90⁺、cd105⁺和cd117^–中的一種或多種。

5.4.4羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的分離、分類和表征

可以將細(xì)胞沉淀重懸于如上所述的新鮮細(xì)胞收集組合物中，或適于維持細(xì)胞的培養(yǎng)基中，例如，dulbecco的改良eagle培養(yǎng)基(dmem)；iscove的改良dulbecco培養(yǎng)基(imdm)，例如含有2u/ml肝磷脂和2mmedta(gibcobrl，ny)的imdm無(wú)血清培養(yǎng)基；緩沖液(例如pbs，hbss)與fbs(例如2％v/v)混合物；等。

在例如組織培養(yǎng)塑料表面培養(yǎng)的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，無(wú)論其是否有額外的胞外基質(zhì)包被，例如纖維粘連蛋白，都可以通過(guò)差速貼壁法傳代或分離。例如，獲得按照上述5.4.3節(jié)的描述用膠原蛋白酶消化的羊膜組織的細(xì)胞懸液，可以在組織培養(yǎng)塑料上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)例如3-7天。培養(yǎng)過(guò)程中，懸液中的多個(gè)細(xì)胞附著于培養(yǎng)表面，且在連續(xù)培養(yǎng)后，形成了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。不形成羊膜來(lái)源貼壁細(xì)胞的非貼壁細(xì)胞在更換培養(yǎng)基時(shí)被去除。

可以進(jìn)行監(jiān)控從羊膜中收集的細(xì)胞數(shù)量和類型，例如，通過(guò)使用諸如免疫定位的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)記的變化來(lái)進(jìn)行監(jiān)控，其中檢測(cè)技術(shù)例如流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞分選、免疫細(xì)胞化學(xué)(例如、組織特異性或細(xì)胞標(biāo)記特異性抗體染色)熒光激活細(xì)胞分選(facs)、磁性激活細(xì)胞分選(macs)、通過(guò)使用光學(xué)或共聚焦顯微鏡檢查細(xì)胞形態(tài)、和/或通過(guò)使用諸如pcr和基因表達(dá)譜等本領(lǐng)域熟知的技術(shù)檢測(cè)基因表達(dá)變化。這些技術(shù)也可以用于鑒定對(duì)于一種或更多特殊標(biāo)記呈陽(yáng)性的細(xì)胞。例如，使用一種或更多cd34抗體，人們可以使用上述技術(shù)以確定一種細(xì)胞是否包含可檢測(cè)量的cd34；如果是這樣的話，那么細(xì)胞是cd34⁺。

羊膜來(lái)源的細(xì)胞，例如，通過(guò)ficoll分離、差速貼壁法或二者的組合分離的細(xì)胞可以使用熒光激活細(xì)胞分選儀(facs)進(jìn)行分選。熒光激活細(xì)胞分選(facs)是一種公知的分離顆粒的方法，包括分離細(xì)胞，其基于顆粒的熒光特性(參見(jiàn)，例如，kamarch，1987，methodsenzymol，151:150-165)。每個(gè)顆粒熒光部分的激光激發(fā)會(huì)導(dǎo)致微小的電荷，使得可以從混合物中進(jìn)行電磁分離陽(yáng)性和陰性的顆粒。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞表面標(biāo)記特異性抗體或配體被標(biāo)記了不同的熒光標(biāo)簽。通過(guò)細(xì)胞分選儀處理細(xì)胞，從而允許基于細(xì)胞結(jié)合所用抗體的能力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。facs分選的顆?？梢灾苯觾?chǔ)存至96-孔或384-孔板的各個(gè)孔內(nèi)，方便分離和克隆。

在一個(gè)分選方案中，來(lái)自胎盤的細(xì)胞，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，可以基于標(biāo)記cd49f、vegfr2/kdr和/或flt-1/vegfr1的表達(dá)進(jìn)行分選。優(yōu)選的細(xì)胞鑒定為oct-4^–，例如，通過(guò)rt-pcr檢測(cè)oct-4在細(xì)胞樣品中的表達(dá)進(jìn)行鑒定，其中如果樣品中的細(xì)胞在30個(gè)循環(huán)后不能表現(xiàn)出可檢測(cè)的oct-4的mrna合成，則細(xì)胞是oct-4^–。例如，來(lái)自羊膜的vegfr2/kdr⁺和vegfr1/flt-1⁺細(xì)胞可以從具有vegfr2/kdr^–和vegfr1/flt-1⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺和/或ve-鈣粘蛋白^–中的一種或多種的細(xì)胞中進(jìn)行分選。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，將羊膜來(lái)源的具有cd49f⁺、vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺和/或ve-鈣粘蛋白^–中的一種或多種的組織培養(yǎng)塑料貼壁細(xì)胞，或?qū)egfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺和ve-鈣粘蛋白^–細(xì)胞，從不表達(dá)一種或多種這些標(biāo)記的細(xì)胞中進(jìn)行分選并選擇。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，將另外為cd31⁺、cd34⁺、cd45⁺、cd133^–和/或tie-2⁺的cd49f⁺、vegfr2/kdr⁺、vegfr1/flt-1⁺中的一種或多種或全部的細(xì)胞，從未表現(xiàn)出一種或更多或任何這些性質(zhì)的細(xì)胞中進(jìn)行分選。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，將另外為cd9⁺、cd10⁺、cd44⁺、cd54⁺、cd98⁺、tie-2⁺、tem-7⁺、cd31^–、cd34^–、cd45^–、cd133^–、cd143^–、cd146^–和/或cxcr4^–的一種或多種或全部的vegfr2/kdr⁺、vegfr1/flt-1⁺細(xì)胞，從未表現(xiàn)出一種或更多或任何這些性質(zhì)的細(xì)胞中進(jìn)行分選。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的篩選可以針對(duì)消化產(chǎn)生的細(xì)胞懸液或從消化物收集的分離細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，例如，通過(guò)離心或使用流式細(xì)胞儀分離。通過(guò)表達(dá)標(biāo)記的篩選可以單獨(dú)完成，或者，例如，與基于細(xì)胞培養(yǎng)中的貼壁性質(zhì)的細(xì)胞篩選流程聯(lián)用。例如，可以在基于標(biāo)記表達(dá)的分選之前或之后進(jìn)行貼壁篩選。

對(duì)于抗體-介導(dǎo)的胎盤細(xì)胞檢測(cè)和分選，可以使用任何特殊標(biāo)記特異性的抗體，其結(jié)合任何熒光基團(tuán)或適于細(xì)胞檢測(cè)和分選(例如，熒光激活細(xì)胞分選)的其它標(biāo)簽。結(jié)合特異性標(biāo)記的抗體/熒光基團(tuán)包括但不限于，異硫氰酸熒光素(fitc)偶聯(lián)的抗cd105單克隆抗體(可購(gòu)自r&dsystemsinc.，minneapolis，minnesota)；藻紅蛋白(pe)偶聯(lián)的抗cd200單克隆抗體(bdbiosciencespharmingen)；vegfr2/kdr-生物素(cd309，abcam)，等等。針對(duì)在此公開(kāi)的任何標(biāo)記的抗體都可以使用任何用于抗體的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，后者有利于檢測(cè)抗體，包括，例如，辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶鏈霉親和素/生物素、抗生物素蛋白/生物素、傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素(fitc)、羅丹明、二氯三吖胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白(pe)、魯米諾、熒光素酶、熒光素和水母蛋白，和合適的放射性材料的例子，包括¹²⁵i、¹³¹i、³⁵s或³h。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以標(biāo)記有單一標(biāo)記的抗體，并基于該單一標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)和分選；或者可以同時(shí)標(biāo)記有多個(gè)不同標(biāo)記的多個(gè)抗體，并基于多種標(biāo)記進(jìn)行分選。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用磁珠分離細(xì)胞，例如，從其它羊膜細(xì)胞中分離在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。細(xì)胞可以使用磁性激活細(xì)胞分選(macs)技術(shù)進(jìn)行分選，其為一種基于顆粒結(jié)合磁珠(0.5-100μm直徑)的能力來(lái)分離顆粒的方法。可以對(duì)磁性微球進(jìn)行多種有用的修飾，包括共價(jià)添加特異性識(shí)別特殊細(xì)胞表面分子或半抗原的抗體。然后將磁珠與細(xì)胞混合進(jìn)行結(jié)合。然后將細(xì)胞通過(guò)磁場(chǎng)，分離具有特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，隨后可以將這些細(xì)胞進(jìn)行分離并重新混合偶聯(lián)有抗其它細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體的磁珠。再次將細(xì)胞通過(guò)磁場(chǎng)，分離結(jié)合有該兩種抗體的細(xì)胞。然后可以將該細(xì)胞在諸如微滴盤的不同盤內(nèi)進(jìn)行稀釋，用于克隆分離。

可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的活力、增殖潛力和壽命，例如臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)、熒光素二乙酸酯吸收分析、碘化丙錠吸收分析(評(píng)價(jià)活力)；以及胸腺嘧啶吸收分析或mtt細(xì)胞增殖分析(評(píng)價(jià)增殖)。細(xì)胞壽命可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行測(cè)定，例如通過(guò)檢測(cè)延伸培養(yǎng)中的最大群體倍增數(shù)測(cè)定。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞還可以使用其它本領(lǐng)域已知的技術(shù)從胎盤細(xì)胞中進(jìn)行分離，例如，所需細(xì)胞的選擇性生長(zhǎng)(陽(yáng)性篩選)，選擇性破壞不需要的細(xì)胞(陰性篩選)；基于分化細(xì)胞在混合例如大豆凝集素的群體中的凝集作用進(jìn)行分離；凍融過(guò)程；過(guò)濾；常規(guī)和區(qū)帶離心；離心淘析(逆流離心)；單位重力分離；逆流分配；電泳；等等。

5.5羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)

5.5.1培養(yǎng)基

分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或該細(xì)胞的群體，可用于啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)或接種細(xì)胞培養(yǎng)物。一般將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無(wú)菌組織培養(yǎng)容器中，后者或者不包被、或者包被胞外基質(zhì)或生物分子，例如層粘連蛋白、膠原蛋白(例如，天然或變性的)、明膠、纖維粘連蛋白、鳥(niǎo)氨酸、玻璃體粘連蛋白、和胞外膜蛋白(例如，matrigel^tm(bddiscoverylabware，bedford，mass.))。

amdac可以，例如，在適合干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培植。培植培養(yǎng)基可以，例如，含有egm-2培養(yǎng)基(lonza)、dmem+10％fbs，或含有60％dmem-lg(gibco)、40％mcdb-201(sigma)、2％胎牛血清(fcs)(hyclonelaboratories)、1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(its)、1×亞油酸-牛血清白蛋白(la-bsa)、10^-9m地塞米松(sigma)、10^-4m抗壞血酸2-磷酸鹽(sigma)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)10ng/ml(r&dsystems)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)10ng/ml(r&dsystems)、和100u青霉素/1000u鏈霉素的培養(yǎng)基(在此稱為“標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基”)。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可被培養(yǎng)于本領(lǐng)域認(rèn)可的可用于例如貼壁胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的任何培養(yǎng)基，以及任何條件下。優(yōu)選的，培養(yǎng)基含有血清。在不同的實(shí)施方式中，amdac的培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括(invitrogen)、mscm-sf(sciencell、carlsbad、ca)、-acf培養(yǎng)基(stemcelltechnologies、vancouver、canada)、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、缺少egf的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、缺少pdgf的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、dmem+10％fbs、egm-2(lonza)、egm-2mv(lonza)、2％、10％和20％的es培養(yǎng)基、es-ssr培養(yǎng)基或α-mem-20％fbs?？捎糜谂囵B(yǎng)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基包括，例如，dmem、imdm、dmem(高或低葡萄糖)、eagle基本培養(yǎng)基、ham的f10培養(yǎng)基(f10)、ham的f-12培養(yǎng)基(f12)、iscove的改良dulbecco培養(yǎng)基、間質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(mscgmlonza)、advancestem^tm培養(yǎng)基(hyclone)、knockout^tmdmem(invitrogen)、leibovitz的l-15培養(yǎng)基、mcdb、dmem/f12、rpmi1640、改良dmem(gibco)、dmem/mcdb201(sigma)和cell-grofree等等。在不同的實(shí)施方式中，例如，dmem-lg(dulbecco的改良必需培養(yǎng)基，低葡萄糖)/mcdb201(雞成纖維細(xì)胞基本培養(yǎng)基)含有its(胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑)、la+bsa(亞油酸-牛血清白蛋白)、葡萄糖、l-抗壞血酸、pdgf、egf、igf-1、和青霉素/鏈霉素；dmem-hg(高葡萄糖)包含約2至約20％胎牛血清，例如，約10％的胎牛血清(fbs；例如確定的胎牛血清，hyclone，loganutah)；dmem-hg包含約2至約20％fbs，例如，約15％的fbs；imdm(iscove的改良dulbecco培養(yǎng)基)包含約2至約20％fbs，例如，約10％的fbs，約2至約20％馬血清，例如，約10％的馬血清，和氫化可的松；m199包含約2至約20％，例如，約10％的fbs、egf和肝磷脂；α-mem(最小必需培養(yǎng)基)包含約2至約20％，例如，約10％的fbs、glutamax^tm和慶大霉素；dmem包含10％fbs、glutamax^tm和慶大霉素；dmem-lg包含約2至約20％，例如，約15％(v/v)的胎牛血清(例如，確定的胎牛血清，hyclone，loganutah)、抗生素/抗真菌藥(例如，青霉素約100單位/微升、鏈霉素100微克/微升、和/或兩性霉素b0.25微克/微升(invitrogen，carlsbad，calif.))，和0.001％(v/v)β-巰基乙醇(sigma，st.louismo.)；補(bǔ)充2-20％fbs、非必需氨基酸(invitrogen)、β-巰基乙醇的knockout^tm-dmem基本培養(yǎng)基，補(bǔ)充knockout^tm的血清替代品、含有2-20％fbs的α-mem的knockout^tm基本培養(yǎng)基，補(bǔ)充egf、vegf、bfgf、r3-igf-1、氫化可的松、肝磷脂、抗壞血酸、fbs、慶大霉素的ebm2^tm基本培養(yǎng)基，等等。

培養(yǎng)基可以補(bǔ)充一種或更多組分，包括，例如，血清(例如，fcs或fbs，例如，約2-20％(v/v)；馬血清(es)；人血清(hs))；β-巰基乙醇(bme)，優(yōu)選的約0.001％(v/v)；一種或更多生長(zhǎng)因子，例如，血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)、白血病抑制因子(lif)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)和促紅細(xì)胞生成素(epo)；氨基酸，包括l-纈氨酸；以及一種或更多抗生素和/或抗真菌劑以控制微生物污染，例如，青霉素g、硫酸鏈霉素、兩性霉素b、慶大霉素和制霉菌素，其可單獨(dú)或組合使用。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞(amdac)可被培養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件，例如，培養(yǎng)于組織培養(yǎng)皿或多孔板。細(xì)胞還可以使用懸滴方法進(jìn)行培養(yǎng)。在該方法中，細(xì)胞在約5ml的培養(yǎng)基中懸浮于約1×10⁴細(xì)胞每ml，且一滴或更多培養(yǎng)基置于組織培養(yǎng)容器的蓋內(nèi)，例如，在100mlpetri培養(yǎng)皿中。這些液滴可以是，例如，單一液滴，或來(lái)自例如多通道移液管的多個(gè)液滴。小心地將蓋翻轉(zhuǎn)并置于培養(yǎng)皿底部的頂上，其中含有一定體積的液體，例如，足夠維持培養(yǎng)皿中潮濕環(huán)境的無(wú)菌pbs，并進(jìn)而培養(yǎng)細(xì)胞。amdac也可以在標(biāo)準(zhǔn)或大體積或高產(chǎn)量培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，例如t-搖瓶、corningcellfactories(nunc)、1-，2-，4-，10或40-traycellstack，等等。

在一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在能夠維持細(xì)胞未分化表型的化合物的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，該化合物是取代的3,4-二氫吡啶酚[4,5-d]嘧啶。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，該化合物是具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物：

該化合物可以與一種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或該細(xì)胞群進(jìn)行接觸，其濃度為，例如，約1μm至約10μm。

5.5.2羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的擴(kuò)增和增殖

一旦分離了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或分離了該細(xì)胞群(例如，分離自至少50％的羊膜細(xì)胞的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或該細(xì)胞群，該細(xì)胞或細(xì)胞群通常與其在體內(nèi)相關(guān)聯(lián))，即可以在體外增殖和擴(kuò)增細(xì)胞。例如，貼壁細(xì)胞或羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群可以在組織培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)，例如，培養(yǎng)皿、搖瓶、多孔板等，培養(yǎng)持續(xù)足夠時(shí)間使得細(xì)胞增殖至40-70％匯合度(confluence)，即，直到細(xì)胞及其后代占據(jù)40-70％的組織培養(yǎng)容器的培養(yǎng)表面積。

可以在培養(yǎng)容器中接種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，接種密度允許細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，可以在低密度(例如，約400至約6,000細(xì)胞/cm²)至高密度(例如，約20,000或更多細(xì)胞/cm²)下接種細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)于co2為約0％至約5％的空氣中。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)于約0.1％至約25％o2的空氣中，優(yōu)選的約5％至約20％o2的空氣中。細(xì)胞優(yōu)選的培養(yǎng)于約25℃至約40℃，優(yōu)選的約37℃。

細(xì)胞優(yōu)選的培養(yǎng)于保溫箱中。培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基可以是靜止或進(jìn)行攪拌的，例如，培養(yǎng)過(guò)程中使用生物反應(yīng)器。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞優(yōu)選的生長(zhǎng)于低氧化壓力下(例如，添加谷胱甘肽、抗壞血酸、過(guò)氧化氫酶、生育酚、n-乙酰半胱氨酸等)。

雖然羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞可以生長(zhǎng)至全滿，但是細(xì)胞優(yōu)選的不生長(zhǎng)至全滿。例如，一旦達(dá)到40％-70％的匯合度，即可以傳代細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行酶處理，例如，胰蛋白酶化，將其從組織培養(yǎng)表面進(jìn)行分離。吸走細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)后，可以將約20,000-100,000細(xì)胞、優(yōu)選的約50,000細(xì)胞、或約400至約6,000細(xì)胞/cm²傳代至含有新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)容器。一般地，新培養(yǎng)基與去除細(xì)胞的培養(yǎng)基為相同類型。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以傳代至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次，或更多。amdac可以在培養(yǎng)物中翻倍至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或至少50倍或更多。

5.6羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的保存

在例如收集過(guò)程或使用諸如在此描述的方法來(lái)生產(chǎn)在此描述的組合物之前，可以將羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞保存于，即，置于允許長(zhǎng)期存儲(chǔ)的條件下，或抑制諸如凋亡或壞死的細(xì)胞死亡的條件下。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以使用例如包含凋亡抑制劑、壞死抑制劑和/或攜氧全氟化碳的組合物進(jìn)行保存，如描述于美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2007/0190042，其公開(kāi)內(nèi)容在此全文引入作為參考。在一個(gè)實(shí)施方式中，保存該細(xì)胞或該細(xì)胞群的方法包括將所述細(xì)胞或細(xì)胞群與細(xì)胞收集組合物接觸，包括凋亡抑制劑和攜氧全氟化碳，其中與不接觸凋亡抑制劑的細(xì)胞群相比，所述凋亡抑制劑的用量和使用時(shí)間足以減少或防止細(xì)胞群中的凋亡。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述凋亡抑制劑為半胱天冬酶抑制劑。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述凋亡抑制劑為jnk抑制劑。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述jnk抑制劑不調(diào)節(jié)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的分化或增殖。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞收集組合物包含所述凋亡抑制劑且所述攜氧全氟化碳在不同的相中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞收集組合物在乳液中含有所述凋亡抑制劑和所述攜氧全氟化碳。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞收集組合物還包含乳化劑，例如，卵磷脂。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在接觸細(xì)胞時(shí)所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳為約0℃至約25℃。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，在接觸細(xì)胞的時(shí)候所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳為約2℃至10℃、或約2℃至約5℃。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述接觸在所述細(xì)胞群傳遞過(guò)程中進(jìn)行。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述接觸在所述細(xì)胞群凍融過(guò)程中進(jìn)行。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群可以通過(guò)例如包括將所述細(xì)胞群與凋亡抑制劑和器官保存化合物進(jìn)行接觸的方法進(jìn)行保存，其中與不接觸凋亡抑制劑的細(xì)胞群相比，所述凋亡抑制劑的用量和使用時(shí)間足以減少或防止細(xì)胞群中的凋亡。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，器官保存化合物為uw溶液(描述于美國(guó)專利號(hào)4,798,824；也稱為viaspan；還參見(jiàn)southard等人，transplantation49(2):251-257(1990))或描述于stern等人，美國(guó)專利號(hào)5,552,267的溶液。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述器官保存化合物為羥乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖、或其組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞收集組合物還包含攜氧全氟化碳，其存在于兩相中或以乳液形式存在。

在所述方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在灌注過(guò)程中與包含凋亡抑制劑和攜氧全氟化碳的細(xì)胞收集組合物、器官保存化合物或其組合進(jìn)行接觸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在組織粉碎過(guò)程中與細(xì)胞收集組合物接觸，例如，在酶促消化羊膜組織過(guò)程中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在通過(guò)例如酶促消化羊膜組織的組織破碎進(jìn)行收集后與細(xì)胞收集組合物接觸。

一般地，在收集、富集和分離羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞過(guò)程中，優(yōu)選最小化或消除由于低氧和機(jī)械壓力造成的細(xì)胞壓力。從而，在本方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群在收集、富集和分離時(shí)在所述保存過(guò)程中被暴露于低氧條件下少于6小時(shí)，其中低氧條件為氧濃度例如低于正常的大氣氧濃度；低于正常血氧濃度等。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞或所述細(xì)胞群在所述保存過(guò)程中暴露于所述低氧條件下少于2小時(shí)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞或所述細(xì)胞群在收集、富集或分離過(guò)程中暴露于所述低氧條件下少于1小時(shí)，或低于30分鐘，或不暴露于低氧條件。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群在收集、富集或分離過(guò)程中不暴露于剪切力。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以通過(guò)一般方法或在此公開(kāi)的特殊方法進(jìn)行低溫貯藏，例如，在諸如安瓶的小容器中的低溫貯藏培養(yǎng)基內(nèi)保存。合適的低溫貯藏培養(yǎng)基包括但不限于以下培養(yǎng)基，包括，例如，生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，例如商業(yè)可獲得的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基，例如，根據(jù)sigmaaldrich產(chǎn)品目錄號(hào)c2695、c2639(1×細(xì)胞冷凍無(wú)血清培養(yǎng)基，不含dmso)或c6039(1×細(xì)胞冷凍甘油培養(yǎng)基，含有最小必需培養(yǎng)基、甘油、小牛血清和牛血清)的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基、lonzaprofreeze^tm2×培養(yǎng)基、甲基纖維素、葡聚糖、人血清白蛋白、胎牛血清、胎牛血清、或plasmalyte。低溫貯藏培養(yǎng)基優(yōu)選的包括dmso(二甲亞砜)或甘油，其濃度為，例如，約1％至約20％，例如，約5％-10％(v/v)，可選的包含胎牛血清或人血清。低溫貯藏培養(yǎng)基可以包含其它試劑，例如，甲基纖維素和/或甘油。分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在低溫貯藏中優(yōu)選的以約1℃/min的速度冷凍。優(yōu)選的低溫貯藏溫度為約-80℃至約-180℃，優(yōu)選的約-125℃至約-140℃。低溫貯藏細(xì)胞可以在解凍使用之前被轉(zhuǎn)移至液氮的氣相中。在一些實(shí)施方式中，例如，一旦安瓶達(dá)到約-80℃，其即被轉(zhuǎn)移至液氮儲(chǔ)存區(qū)內(nèi)。低溫貯藏也可以使用控制速率的冰箱。低溫貯藏細(xì)胞優(yōu)選的在溫度為約25℃至約40℃下解凍，優(yōu)選的解凍至溫度為約37℃。

5.7制備羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞庫(kù)

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以使用多種不同方式培養(yǎng)，生產(chǎn)一系列的批次(lot)，例如，一系列可個(gè)體施用劑量(dose)的所述細(xì)胞。獲自多個(gè)胎盤的一系列的血管生成羊膜細(xì)胞批次可置于一種細(xì)胞庫(kù)內(nèi)用于例如長(zhǎng)期儲(chǔ)存。一般地，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞來(lái)自于細(xì)胞的初代培養(yǎng)以形成種子培養(yǎng)，后者在控制條件下進(jìn)行擴(kuò)增，從大約相當(dāng)數(shù)量的倍增中形成細(xì)胞群。細(xì)胞批次優(yōu)選的衍生自單一胎盤的組織，但也可以衍生于多個(gè)胎盤的組織。

在一個(gè)非限制性實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的批次或劑量按照以下方式獲得。首先破碎羊膜組織，例如，按照描述于上述5.4.3節(jié)的使用系列胰蛋白酶和膠原蛋白酶消化過(guò)程進(jìn)行消化。培養(yǎng)來(lái)自膠原蛋白酶消化組織的細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間例如約1-3周，優(yōu)選的約2周。在移除非貼壁細(xì)胞后，收集例如經(jīng)胰蛋白酶消化所形成的高密度群落。將這些細(xì)胞收集并重懸于合適體積的培養(yǎng)基中，并定義為0代細(xì)胞。

然后可以將0代細(xì)胞用于接種擴(kuò)增培養(yǎng)物。擴(kuò)增培養(yǎng)可以是任意安排的分離的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備，例如，nunc^tm的cellfactory。0代培養(yǎng)細(xì)胞可以細(xì)分至任何程度用于接種擴(kuò)增培養(yǎng)物，例如，1×10³、2×10³、3×10³、4×10³、5×10³、6×10³、7×10³、8×10³、9×10³、1×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、或10×10⁴貼壁細(xì)胞。優(yōu)選的，使用約1×10³至約3×10⁴的0代細(xì)胞接種各擴(kuò)增培養(yǎng)物。擴(kuò)增培養(yǎng)物數(shù)量可以取決于0代細(xì)胞的數(shù)量，也可以更多或更少，其取決于貼壁細(xì)胞來(lái)源的特定胎盤。

然后可以使擴(kuò)增培養(yǎng)物生長(zhǎng)至培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度達(dá)到特定值，例如，約1×10⁵細(xì)胞/cm²。在這個(gè)點(diǎn)上可以將細(xì)胞進(jìn)行收集和低溫貯藏，或傳代至新的如上所述的擴(kuò)增培養(yǎng)物。細(xì)胞在使用前可以傳代例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。優(yōu)選的在擴(kuò)增培養(yǎng)中持續(xù)記錄群體倍增累積數(shù)量。0代培養(yǎng)細(xì)胞可以擴(kuò)增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40倍，或高達(dá)60倍。然而，優(yōu)選的，在將細(xì)胞群分為個(gè)體劑量前，群體倍增數(shù)量為約15至約30倍。細(xì)胞可以在擴(kuò)增過(guò)程中連續(xù)培養(yǎng)，或可以在擴(kuò)增過(guò)程中的一個(gè)或更多時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行冷凍。

用于個(gè)體劑量的細(xì)胞可以進(jìn)行冷凍，例如，進(jìn)行低溫貯藏以待后用。個(gè)體劑量可以包括，例如，約1百萬(wàn)至約5千萬(wàn)細(xì)胞每ml，且可以包括約10⁶至約10¹⁰細(xì)胞總量。

在一個(gè)實(shí)施方式中，含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞庫(kù)可以通過(guò)下述方法進(jìn)行制備，包括：從人產(chǎn)后胎盤擴(kuò)增原代培養(yǎng)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞作為第一次的多個(gè)群體倍增；低溫貯藏細(xì)胞形成原始細(xì)胞庫(kù)；可選的從原始細(xì)胞庫(kù)擴(kuò)增多個(gè)細(xì)胞用于第二次的多個(gè)群體倍增；低溫貯藏?cái)U(kuò)增的細(xì)胞形成工作細(xì)胞庫(kù)；可選的從工作細(xì)胞庫(kù)擴(kuò)增多個(gè)擴(kuò)增的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞用于第三次的多個(gè)群體倍增；以及按照個(gè)體劑量低溫貯藏得到的擴(kuò)增細(xì)胞，其中所述個(gè)體劑量共同組成細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞庫(kù)可以含有單獨(dú)的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的劑量或批次，或可以含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的組合批次和另一種細(xì)胞的批次或劑量，例如，另一種干細(xì)胞或祖細(xì)胞。優(yōu)選的，各個(gè)體劑量只含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在所述原代培養(yǎng)的所有所述細(xì)胞都來(lái)自于相同胎盤。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述個(gè)體劑量含有約10⁴至約10⁵細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述個(gè)體劑量含有約10⁵至約10⁶細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述個(gè)體劑量含有約10⁶至約10⁷細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述個(gè)體劑量含有約10⁷至約10⁸細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述個(gè)體劑量含有約10⁸至約10⁹細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述個(gè)體劑量含有約10⁹至約10¹⁰細(xì)胞。

在某些實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以從工作細(xì)胞庫(kù)中解凍并培養(yǎng)多個(gè)群體倍增。當(dāng)產(chǎn)生期望數(shù)量的細(xì)胞時(shí)，或發(fā)生期望數(shù)量的群體倍增時(shí)，可以通過(guò)例如離心來(lái)收集貼壁細(xì)胞，并重懸于溶液中，其含有，例如，葡聚糖，例如，5％葡聚糖。在某些實(shí)施方式中，葡聚糖為葡聚糖-40。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞被二次收集并重懸于含有葡聚糖和低溫貯藏劑的溶液中，例如，含有10％has和2％-20％例如5％dmso的5％葡聚糖(例如，葡聚糖-40)溶液，并進(jìn)行低溫貯藏?？梢詫?duì)低溫貯藏的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞進(jìn)行解凍，例如，在使用之前立刻解凍。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)胎盤的捐獻(xiàn)人(例如，母親)檢測(cè)至少一種病原體。在某些實(shí)施方式中，如果母親對(duì)病原體測(cè)試呈陽(yáng)性，則丟棄來(lái)自胎盤的整個(gè)批次。該檢測(cè)可以在羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞批次生產(chǎn)的任何時(shí)間進(jìn)行，包括在0代細(xì)胞培植前后，或擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中。待檢測(cè)的病原體可以包括但不限于，肝炎a、肝炎b、肝炎c、肝炎d、肝炎e、人免疫缺陷病毒(i和ii型)、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒等等。

5.8羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的用途

本發(fā)明提供了包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的組合物。這些組合物的例子包括藥物組合物(參見(jiàn)下述5.8.1節(jié))；基質(zhì)和支架(參見(jiàn)下述5.8.2節(jié))，和羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基(參見(jiàn)下述5.8.3節(jié))。

5.8.1包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的組合物

在某些實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞包含于藥物組合物或?yàn)槠渲械慕M分?？梢园凑绽趯?duì)個(gè)體進(jìn)行施用的方式制備細(xì)胞，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其被置于一個(gè)適于進(jìn)行醫(yī)藥用途的容器內(nèi)。該容器可以是，例如，注射器、無(wú)菌塑料袋、燒瓶、罐、或其它容器，其中羊膜來(lái)源的血管生成細(xì)胞群可以很容易地進(jìn)行分配。例如，容器可以是血袋或其它塑料的、適于液體靜脈施用至受體的醫(yī)學(xué)上可接受的袋子。在某些實(shí)施方式中，容器允許低溫貯藏細(xì)胞。在此提供的組合物例如藥物組合物中的細(xì)胞可以包括羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，后者衍生于單一供體或多個(gè)供體。細(xì)胞對(duì)于目標(biāo)受體而言可以是完全的hla-匹配，或部分或完全的hla-不匹配。

從而，在一個(gè)實(shí)施方式中，在此提供的組合物中的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞以在容器中含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的組合物的形式施用至有需求的個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，容器為袋子、燒瓶或罐。在更具體的實(shí)施方式中，所述袋子是無(wú)菌塑料袋。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述袋子適于，允許或有利于所述貼壁細(xì)胞的靜脈施用，例如，通過(guò)靜脈輸液，彈丸注射等。袋子可以包括多個(gè)腔或隔間，其相互連通以允許在施用前或施用中混合細(xì)胞和一種或更多其它溶液，例如，一種藥物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，低溫貯藏前，含有羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的溶液包含一種或更多有利于低溫貯藏細(xì)胞的化合物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞存在于生理可接受的水溶液中。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述生理可接受的水溶液為0.9％nacl溶液。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞包括對(duì)所述細(xì)胞的受體hla-匹配的胎盤細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞包括對(duì)所述細(xì)胞的受體至少部分hla-不匹配的細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞衍生于多個(gè)供體。在各個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述容器包括約、至少、或最多1×10⁶所述細(xì)胞、5×10⁶所述細(xì)胞、1×10⁷所述干細(xì)胞、5×10⁷所述細(xì)胞、1×10⁸所述細(xì)胞、5×10⁸所述細(xì)胞、1×10⁹所述細(xì)胞、5×10⁹所述細(xì)胞、或1×10¹⁰所述細(xì)胞。在關(guān)于任何前述低溫貯藏群體的其它具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞已經(jīng)傳代約，至少，或不多于5次，不多于10次，不多于15次，或不多于20次。在關(guān)于任何前述低溫貯藏細(xì)胞的另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述細(xì)胞已經(jīng)在所述容器中進(jìn)行了擴(kuò)增。在具體的實(shí)施方式中，單一單位劑量的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以包括，在不同的實(shí)施方式中，約，至少，或不多于1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰、5×10¹⁰、1×10¹¹或更多的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。

在某些實(shí)施方式中，在此提供的藥物組合物包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群，其包括50％活細(xì)胞或更多(即，在群體中至少50％的細(xì)胞為有功能的或存活的)。優(yōu)選的，在群體中至少60％的細(xì)胞是活細(xì)胞。更加優(yōu)選的，在藥物組合物的群體中至少70％、80％、90％、95％、或99％的細(xì)胞是活細(xì)胞。

5.8.2包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的基質(zhì)

進(jìn)一步在此提供的是組合物，其包含基質(zhì)、水凝膠、支架，等等。該組合物可用于代替或輔助液體懸液中的該細(xì)胞。

基質(zhì)可以是，例如，永久的或可降解的去細(xì)胞化的組織，例如，去細(xì)胞化的羊膜，或合成的基質(zhì)?；|(zhì)可以是三維支架。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包含膠原蛋白、明膠、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白、果膠、鳥(niǎo)氨酸、或玻璃體粘連蛋白。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，基質(zhì)為羊膜或羊膜來(lái)源的生物材料。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包含胞外膜蛋白。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包含合成的化合物。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述基質(zhì)包含生物活性化合物。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述生物活性化合物為生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、抗體、或低于5,000道爾頓的有機(jī)分子。

在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可被接種至天然基質(zhì)上，例如，胎盤生物材料例如羊膜材料。該羊膜材料可以是，例如，直接切開(kāi)哺乳動(dòng)物胎盤得到的羊膜；固定的或熱處理的羊膜、基本上干燥的(即，<20％h2o)羊膜，絨膜、基本上干燥的絨膜、基本上干燥的羊膜和絨膜，等等。可以接種在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的優(yōu)選的胎盤生物材料描述于hariri，美國(guó)申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2004/0048796，其公開(kāi)內(nèi)容在此全文引入作為參考。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，基質(zhì)為包含胞外基質(zhì)的組合物。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述組合物為matrigel^tm(bdbiosciences)。

在此描述的分離的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可懸浮于例如適合注射的水凝膠溶液。水凝膠為例如有機(jī)聚合物(天然或合成的)，其通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵或氫鍵交聯(lián)形成三維開(kāi)放式晶格結(jié)構(gòu)，包圍水分子形成凝膠。適合該組合物的水凝膠包括自組裝肽，例如rad16。在一個(gè)實(shí)施方式中，含有細(xì)胞的水凝膠溶液可以允許例如在模子中硬化形成具有用于移植的分散細(xì)胞的基質(zhì)。該基質(zhì)中的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在例如移植前也可以進(jìn)行培養(yǎng)，從而細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂擴(kuò)增。水凝膠形成材料包括例如海藻酸及其鹽的多糖、多肽、含磷氮鏈聚合物和聚丙烯酸酯，其離子化交聯(lián)；或嵌段共聚物，例如聚氧化乙烯-聚丙烯醇嵌段共聚物，其分別通過(guò)溫度或ph進(jìn)行交聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，水凝膠或基質(zhì)是生物可降解的。

在某些實(shí)施方式中，在此提供的含有細(xì)胞的組合物，包含原位可聚合的凝膠(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2002/0022676；anseth等人，j.controlrelease,78(1-3):199-209(2002)；wang等人，biomaterials，24(22):3969-80(2003)。在一些實(shí)施方式中，聚合物在諸如水、緩沖鹽溶液、或具有荷電側(cè)鏈基團(tuán)的水性醇溶液、或其單價(jià)離子鹽等的水性溶液中至少部分溶解。能與陽(yáng)離子反應(yīng)、具有酸性側(cè)鏈基團(tuán)的聚合物的例子有聚(磷氮基)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、聚(醋酸乙烯酯)、以及例如磺化聚苯乙烯的磺化聚合物。也可以使用具有酸性側(cè)鏈基團(tuán)的共聚物，其通過(guò)丙烯酸或甲基丙烯酸與乙烯醚單體或聚合物反應(yīng)形成。酸性基團(tuán)的例子有羧酸基團(tuán)、磺酸基團(tuán)、鹵化(優(yōu)選的氟化)醇基團(tuán)、酚oh基團(tuán)，和酸性oh基團(tuán)。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，基質(zhì)為氈，其可以由諸如pga、pla、pcl共聚物或混紡或透明質(zhì)酸等生物吸收材料制成的復(fù)絲紗線制成。紗線使用標(biāo)準(zhǔn)紡織工藝技術(shù)制成氈，包括卷邊、剪裁、梳理和針織。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞接種到可以是復(fù)合結(jié)構(gòu)的泡沫支架上。另外，三維框架可以模塑為可用的形狀，例如需要修復(fù)、替換或擴(kuò)張的特定身體結(jié)構(gòu)。其它可用的支架例子包括非織氈、多孔泡沫或自組裝多肽。可以使用含有合成的乙醇酸和乳酸共聚物(例如，pga/pla)(vicryl，ethicon，inc.，somerville，n.j.)的可吸收共聚物的纖維制成非織氈。通過(guò)諸如冷凍干燥或凍干的過(guò)程進(jìn)行制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6,355,699)的聚(ε-己內(nèi)酯)/聚(乙醇酸)(pcl/pga)共聚物組成的泡沫也可以用作支架。

在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可接種于三維框架或支架上，并植入體內(nèi)。該框架可以與任何一種或更多的例如刺激組織形成的，例如骨骼形成或脈管形成的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞、藥物或其它組分一起移植。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，在此提供的胎盤羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以接種于泡沫支架上，其可以是復(fù)合結(jié)構(gòu)。該泡沫支架可以模塑為可用的形狀，例如需要修復(fù)、替換或擴(kuò)張的特定身體結(jié)構(gòu)的部分。在一些實(shí)施方式中，框架使用例如0.1m乙酸進(jìn)行處理，然后在細(xì)胞接種前在聚賴氨酸、pbs和/或膠原蛋白中孵育，以增強(qiáng)細(xì)胞吸附。基質(zhì)外表面可以進(jìn)行修飾以增強(qiáng)細(xì)胞吸附或生長(zhǎng)以及組織分化，例如采用血漿包被基質(zhì)，或添加一種或更多蛋白(例如，膠原蛋白，彈性纖維，網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、粘多糖(例如，硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、皮膚素硫酸鹽、角質(zhì)素硫酸鹽，等)、細(xì)胞基質(zhì)和/或其它材料，例如但不限于明膠、海藻酸、瓊脂、瓊脂糖、和植物膠，等等。

在一些實(shí)施方式中，基質(zhì)包括使其不致栓塞的材料，或經(jīng)其處理。這些處理和材料也可以促進(jìn)和維持內(nèi)皮生長(zhǎng)、遷移和胞外基質(zhì)沉積。這些材料和處理的例子包括但不限于天然材料，例如基膜蛋白，例如層粘連蛋白和iv型膠原蛋白；合成材料例如eptfe；和切開(kāi)的聚氨酯脲硅酮，例如purspan^tm(thepolymertechnologygroup，inc.，berkeley，calif.)?；|(zhì)也可以包括抗血栓劑例如肝磷脂；支架也可以在接種在此提供的貼壁細(xì)胞前進(jìn)行處理改變表面電荷(例如，血漿包被)。

框架可以在接種在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞前進(jìn)行處理以增強(qiáng)細(xì)胞吸附。例如，在接種本發(fā)明的細(xì)胞前，可以使用0.1摩爾乙酸處理尼龍基質(zhì)并在聚賴氨酸、pbs和/或膠原蛋白中孵育以包被尼龍?？梢允褂昧蛩釋?duì)聚苯乙烯進(jìn)行類似處理。

另外，三維框架外表面可以進(jìn)行修飾以增強(qiáng)細(xì)胞吸附或生長(zhǎng)以及組織分化，例如采用血漿包被框架，或添加一種或更多蛋白(例如，膠原蛋白、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維)、糖蛋白、粘多糖(例如，硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、軟骨素-6-硫酸鹽、皮膚素硫酸鹽、角質(zhì)素硫酸鹽)、細(xì)胞基質(zhì)和/或其它材料，例如但不限于明膠、海藻酸、瓊脂、瓊脂糖、或植物膠。

在一些實(shí)施方式中，基質(zhì)包括使其不致栓塞的材料，或經(jīng)其處理，例如天然材料，例如基膜蛋白，例如層粘連蛋白和iv型膠原蛋白；和合成材料例如eptfe或切開(kāi)的聚氨酯脲硅酮，例如purspan(thepolymertechnologygroup，inc.，berkeley，calif.)。該材料可以進(jìn)一步處理使得支架不致栓塞，例如，使用肝磷脂處理，以及改變材料表面電荷的處理，例如血漿包被。

包括羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的治療的細(xì)胞組合物還可以以基質(zhì)-細(xì)胞復(fù)合物的形式提供。基質(zhì)可以包括生物可相容的支架、點(diǎn)陣、自組裝結(jié)構(gòu)等等，不論其可生物吸收與否或是液體、凝膠或固體。本領(lǐng)域已知該基質(zhì)可用于治療細(xì)胞處理、手術(shù)恢復(fù)、組織工程和創(chuàng)傷愈合。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞附著于基質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞包埋或包含在基質(zhì)空間內(nèi)。最優(yōu)選的是那些細(xì)胞與基質(zhì)緊密相連生長(zhǎng)的基質(zhì)-細(xì)胞復(fù)合物，且當(dāng)醫(yī)療上使用時(shí)，其刺激并支撐受體細(xì)胞的向內(nèi)生長(zhǎng)，或刺激或支撐血管生成。基質(zhì)-細(xì)胞組合物可用本領(lǐng)域已知的任何方法導(dǎo)入個(gè)體體內(nèi)，包括但不限于植入、注射、手術(shù)附著、移植其它組織、注射等等。在一些實(shí)施方式中，基質(zhì)形成于體內(nèi)或原位。例如，可以使用原位可聚合凝膠配合本發(fā)明。該凝膠的例子是本領(lǐng)域已知的。

在一些實(shí)施方式中，在此提供的細(xì)胞接種至該三維基質(zhì)上，例如支架，并植入體內(nèi)，其中接種的細(xì)胞在框架上或框架內(nèi)進(jìn)行增殖或在體內(nèi)幫助培植替換組織，其中可以有其它細(xì)胞的協(xié)同作用，也可以沒(méi)有。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或其共培養(yǎng)物在三維框架的生長(zhǎng)優(yōu)選的導(dǎo)致形成三維組織或其基礎(chǔ)，其可以在體內(nèi)進(jìn)行利用，例如用于修復(fù)損壞的或患病的組織。例如，三維支架可用于形成管狀結(jié)構(gòu)，例如用于修復(fù)血管；或循環(huán)系統(tǒng)或冠狀結(jié)構(gòu)的方面。按照本發(fā)明的一個(gè)方面，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或其共培養(yǎng)物被接種于三維框架或基質(zhì)，例如支架、泡沫或水凝膠?？蚣芸梢栽O(shè)置為不同形狀，例如基本為平的、基本為圓柱的或管狀的，或可以完全是自由形態(tài)的，因?yàn)榭赡苄枰蛞笃湓诳紤]之中為可修正的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)于三維結(jié)構(gòu)，而在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞只是勉強(qiáng)存活或甚至死亡，但刺激或促進(jìn)了受體內(nèi)的新組織向內(nèi)生長(zhǎng)或血管形成。

本發(fā)明的細(xì)胞可以在培養(yǎng)物中自由生長(zhǎng)，從培養(yǎng)物中移出并接種至三維框架。用一定濃度細(xì)胞接種三維框架，例如，大約10⁶至5×10⁷細(xì)胞每微升，優(yōu)選的導(dǎo)致三維支撐的培植以相對(duì)較短的時(shí)間進(jìn)行。另外，在一些應(yīng)用中可以優(yōu)選的使用更多或更少的細(xì)胞數(shù)量，其取決于期望的效果。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，可以將基質(zhì)切成條狀(例如，形狀為矩形)，其寬度大約等于其最終將要插入的管狀器官的內(nèi)徑。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以接種至支架并通過(guò)流動(dòng)或懸浮于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到合適的匯合度階段，可以通過(guò)將長(zhǎng)邊接在一起將支架卷入管中。然后可以使用合適材料、合適直徑的纖維縫合兩個(gè)邊緣將縫隙封閉。為了防止細(xì)胞堵塞內(nèi)腔，可以將管狀框架的一個(gè)開(kāi)口端固定在噴嘴上?？梢詫⒁后w培養(yǎng)基從連接培養(yǎng)室的來(lái)源室進(jìn)行擠壓通過(guò)噴嘴，在管狀框架內(nèi)部形成流體。可以將另一個(gè)開(kāi)口端固定于出液孔，其連接收集室，其中培養(yǎng)基可以通過(guò)來(lái)源室進(jìn)行再循環(huán)。當(dāng)培養(yǎng)完成后可以使管子脫離噴嘴和出液孔。參見(jiàn)，例如，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杦o94/25584。

一般而言，可以按照本發(fā)明使用任何下述方法將兩個(gè)三維框架組合成一個(gè)管子。可以將兩個(gè)或更多平面框架置于另一個(gè)頂部并進(jìn)行縫合。然后可以將得到的雙層片進(jìn)行翻卷，并按照上述方法進(jìn)行連接和密封。在某些實(shí)施方式中，可以用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞接種一個(gè)作為內(nèi)層的管狀支架并進(jìn)行培養(yǎng)?？梢詫⒌诙Ъ苌L(zhǎng)為扁平條帶，其寬度略大于管狀框架的外徑。在獲得合適的生長(zhǎng)后，將扁平框架包在管狀支架的外部，然后封閉扁平框架兩端的縫隙并將扁平框架密封至內(nèi)管。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以將兩種或更多直徑稍有不同的管狀網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分別生長(zhǎng)?？梢詫⒕哂休^小直徑的框架插入較大的內(nèi)部并進(jìn)行密封。對(duì)于每種這樣的方法，可以通過(guò)對(duì)雙層管重復(fù)使用該方法在其中添加更多的層?？梢栽谘蚰?lái)源的貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的任何階段組合支架，且組合支架的培養(yǎng)可以在需要時(shí)繼續(xù)進(jìn)行。

與上述操作一起，在此提供的細(xì)胞和治療組合物可與能夠移植的設(shè)備一起使用。例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以與例如支架、人工瓣膜、心室輔助設(shè)備、電解可脫性彈簧圈等等一同施用。由于所述設(shè)備可能構(gòu)成針對(duì)需要該治療的個(gè)體的主要治療手段，細(xì)胞等可以用作輔助性治療劑或第二治療劑使用，以輔助、刺激或促進(jìn)植入設(shè)備區(qū)域的適當(dāng)愈合。本發(fā)明的細(xì)胞和治療組合物還可以用于預(yù)處理某些可移植設(shè)備，以最小化其在體內(nèi)使用時(shí)的問(wèn)題。該預(yù)處理的設(shè)備，包括包被的設(shè)備，可以更好地被移植它們的患者所接納，降低了局部或系統(tǒng)性感染的風(fēng)險(xiǎn)，或例如血管重狹窄或進(jìn)一步閉塞的風(fēng)險(xiǎn)。

5.8.3羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基

在此進(jìn)一步提供了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞條件化培養(yǎng)基，即，包含貼壁細(xì)胞分泌或排出的一種或更多生物分子的培養(yǎng)基。在不同的實(shí)施方式中，條件化培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次群體倍增，或更多。在其它實(shí)施方式中，條件化培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基中羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞已經(jīng)生長(zhǎng)到至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％匯合度，或直至100％匯合度。該條件化培養(yǎng)基可用于支撐細(xì)胞群的培養(yǎng)，例如，干細(xì)胞，例如，胎盤干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、成體干細(xì)胞等。在另一個(gè)實(shí)施方式中，條件化培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基中羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和非羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞被共同培養(yǎng)。

條件化培養(yǎng)基可以包括在此提供的貼壁細(xì)胞。從而，本發(fā)明提供了包括羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，條件化培養(yǎng)基包括多個(gè)，例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群。

5.9修飾的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞

5.9.1遺傳修飾的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞

在另一個(gè)方面，在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以是遺傳修飾的，例如，以制備目標(biāo)核酸或多肽，或制備分化型細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、周細(xì)胞或血管生成細(xì)胞，其制備目標(biāo)核酸或多肽。例如，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以進(jìn)行修飾制備血管生成因子，諸如促血管生成分子、可溶性因子和受體或或促遷移分子例如趨化因子，例如，基質(zhì)細(xì)胞衍生的因子1(sdf-1)或趨化因子受體?？梢允褂美缁诓《镜妮d體進(jìn)行遺傳修飾，包括但不限于，非整合型復(fù)制載體，例如，乳突瘤病毒載體，sv40載體、腺病毒載體；整合型病毒載體，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺體相關(guān)的病毒載體；或復(fù)制-缺陷型病毒載體。將dna導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、基因槍、直接dna注射等。

在此提供的貼壁細(xì)胞可以，例如，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染dna，其被控制或可操作地連接一種或更多合適的表達(dá)調(diào)控元件，例如，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多腺苷酸化位點(diǎn)、內(nèi)部核酸進(jìn)入位點(diǎn)。優(yōu)選的，該dna包括可選標(biāo)記。在外源dna導(dǎo)入后，工程化的貼壁細(xì)胞可以例如在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并隨后轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于工程化羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的dna包括編碼目標(biāo)多肽的核酸序列，例如，細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、分化劑或治療多肽。

用于工程化貼壁細(xì)胞的dna可以包括任何本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，人細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)核苷酸序列。例如，啟動(dòng)子包括但不限于cmv啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、sv40啟動(dòng)子、乳突瘤病毒啟動(dòng)子、epstein-barr病毒啟動(dòng)子、彈性蛋白基因啟動(dòng)子等等。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是可調(diào)節(jié)的，從而核苷酸序列只有在需要時(shí)才進(jìn)行表達(dá)。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型(例如，與金屬硫蛋白和熱休克蛋白相關(guān)的)或組成型的。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子為組織特異性或表現(xiàn)出組織特異性。該啟動(dòng)子的例子包括但不限于肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(shani，1985，nature314:283)(骨骼肌)。

在此公開(kāi)的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以進(jìn)行工程化或用其他方式選擇“敲除(knockout)”或“抑制(knockdown)”一種或更多基因在該細(xì)胞中的表達(dá)。細(xì)胞自身基因的表達(dá)可以通過(guò)例如同源重組的方式使基因完全失活來(lái)進(jìn)行抑制。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，通過(guò)諸如neo的陽(yáng)性篩選標(biāo)記打斷編碼蛋白重要區(qū)域的外顯子或5’至該區(qū)域的外顯子，防止從目標(biāo)基因產(chǎn)生常規(guī)mrna并導(dǎo)致該基因失活。還可以通過(guò)在基因的一部分創(chuàng)造缺口或缺失整個(gè)基因來(lái)使基因失活。通過(guò)使用具有在基因組上彼此遠(yuǎn)離的兩個(gè)目標(biāo)基因的同源區(qū)域的構(gòu)建子，可以缺失介于該兩個(gè)區(qū)域之間的序列(mombaerts等人，1991，proc.nat.acad.sci.u.s.a.88:3084)。抑制目標(biāo)基因表達(dá)的反義、嗎啉(morpholinos)、dna酶、干擾小rna、短發(fā)卡樣rna和核酶分子也可以用于降低貼壁細(xì)胞中的目標(biāo)基因活性。例如，已發(fā)現(xiàn)抑制主要的組織相容性基因復(fù)合物(hla)表達(dá)的反義rna分子對(duì)于免疫響應(yīng)而言是最通用的?？梢允褂萌菪肿咏档湍繕?biāo)基因活性水平。參見(jiàn)，例如，l.g.davis等人(編輯)，1994，basicmethodsinmolecularbiology，第2版，appleton&lange，norwalk，conn.，其在此引入作為參考。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在此公開(kāi)的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以使用包括編碼目標(biāo)多肽的核苷酸序列的核酸分子進(jìn)行遺傳修飾，其中目標(biāo)多肽的表達(dá)是可通過(guò)外源因子控制的，例如，多肽、有機(jī)小分子，等。目標(biāo)多肽可以是治療多肽。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽是il-12或白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(il-1ra)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，目標(biāo)多肽為白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑與二氫葉酸還原酶(dhfr)融合物，且外源因子為抗葉酸素，例如，氨甲喋呤。該構(gòu)建子通過(guò)接觸氨甲喋呤可用于工程化羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，其表達(dá)il-1ra、或il-1ra和dhfr融合物。該構(gòu)建子可用于，例如，治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在本實(shí)施方式中，在暴露于諸如氨甲喋呤的抗葉酸素時(shí)il-1ra和dhfr融合物轉(zhuǎn)譯上調(diào)。從而，在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，用于遺傳工程化羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的核酸可以包括核苷酸序列，其編碼第一多肽和第二多肽，其中所述第一和第二多肽作為融合蛋白進(jìn)行表達(dá)，其在外源因子存在下轉(zhuǎn)譯上調(diào)。多肽可以短暫或長(zhǎng)期(例如，經(jīng)過(guò)數(shù)周或數(shù)月的時(shí)間)表達(dá)。該核酸分子可以另外包括編碼多肽的核苷酸序列，其允許對(duì)工程化的細(xì)胞進(jìn)行陽(yáng)性篩選，或允許工程化細(xì)胞可視化。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，核苷酸序列編碼多肽，其在例如熒光素酶(luc)的適當(dāng)可視化條件下發(fā)生熒光。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，該核酸分子可以包括il-1ra-dhfr-ires-luc，其中il-1ra為白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑，ires為核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)，以及dhfr為二氫葉酸還原酶。

5.9.2永生化羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞系

哺乳動(dòng)物羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以通過(guò)轉(zhuǎn)染任何含有促生長(zhǎng)基因的合適載體進(jìn)行有條件的永生化，即，編碼在適當(dāng)條件下促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白的基因，從而促生長(zhǎng)蛋白的制備和/或活性可以由外部因子調(diào)節(jié)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中促生長(zhǎng)基因?yàn)榘┗颍绲幌抻?，v-myc、n-myc、c-myc、p53、sv40大t抗原、多瘤病毒大t抗原、e1a腺病毒或人乳突瘤病毒e7蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以使用cre-lox重組永生化，如narushima，m.等人，(naturebiotechnology，2005，23(10:1274-1282)中的針對(duì)人胰腺β-細(xì)胞系的例子所示。

促生長(zhǎng)蛋白的外部調(diào)控可以通過(guò)將促生長(zhǎng)基因置于外部可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行，例如，一種活性可以通過(guò)例如改變轉(zhuǎn)染細(xì)胞或與細(xì)胞接觸的培養(yǎng)基組合物的溫度進(jìn)行控制的啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以采用四環(huán)素(tet)控制的基因表達(dá)系統(tǒng)(參見(jiàn)gossen等人，proc.natl.acad.sci.usa89:5547-5551，1992；hoshimaru等人，proc.natl.acad.sci.usa93:1518-1523，1996)。在tet不存在的情況下，在該載體中的tet-控制的反式激活子(tta)強(qiáng)烈激活來(lái)自phcmv*-1的轉(zhuǎn)錄，后者是來(lái)自人巨細(xì)胞病毒的最小啟動(dòng)子，其與tet操縱子序列融合。tta為轉(zhuǎn)座子-10衍生的大腸桿菌(escherichiacoli)tet抗性操縱子抑制劑(tetr)與單純皰疹病毒vp16的酸性區(qū)域的融合蛋白。低的、無(wú)毒性的tet濃度(例如，0.01-1.0μg/ml)被tta幾乎完全取消了反式激活。

在一個(gè)實(shí)施方式中，載體進(jìn)一步包含編碼可選標(biāo)記的基因，例如，產(chǎn)生抗藥性的蛋白。細(xì)菌新霉素抗性基因(neo^r)是一種可用于本方法的標(biāo)記。攜帶neo^r的細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知曉的方法進(jìn)行篩選，例如將100-200μg/mlg418添加至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

轉(zhuǎn)染可以通過(guò)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知曉的方法進(jìn)行，包括但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。一般而言，細(xì)胞培養(yǎng)物可以通過(guò)與收集自載體的生產(chǎn)細(xì)胞系的條件化培養(yǎng)基混合物和含有n2補(bǔ)充物的dmem/f12一起孵育進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，按照上述制備的胎盤細(xì)胞培養(yǎng)物可以在體外例如5天后通過(guò)與一體積的條件化培養(yǎng)基和兩體積的含有n2補(bǔ)充物的dmem/f12孵育約20小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后可以按照上述篩選攜帶可選標(biāo)記的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染后，將培養(yǎng)物傳代到允許增殖的表面，例如，允許至少30％的細(xì)胞在24小時(shí)的時(shí)間內(nèi)倍增。優(yōu)選的，基質(zhì)為聚鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白基質(zhì)，包括包被有聚鳥(niǎo)氨酸(10μg/ml)和/或?qū)诱尺B蛋白(10μg/ml)的組織培養(yǎng)塑料、聚賴氨酸/層粘連蛋白基質(zhì)或用纖維粘連蛋白處理的表面。然后每3-4天給培養(yǎng)物補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中可以或可以不補(bǔ)充一種或更多增殖-增強(qiáng)因子。增殖-增強(qiáng)因子可以在培養(yǎng)物低于50％匯合度狀態(tài)下添加至生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

條件永生化的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞系可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)傳代，例如當(dāng)80-95％匯合度時(shí)通過(guò)胰蛋白酶消化。在一些實(shí)施方式中，直至大約第20代才有利于維持篩選(例如通過(guò)在含有新霉素抗性基因的細(xì)胞中添加g418)。也可以將細(xì)胞冷凍在液氮中長(zhǎng)時(shí)間保存。

可以從根據(jù)上述制備的條件永生化的貼壁細(xì)胞系中分離無(wú)性細(xì)胞系。一般而言，該無(wú)性細(xì)胞系可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行分離，例如通過(guò)有限稀釋或使用克隆環(huán)(cloningring)，并進(jìn)行擴(kuò)增。無(wú)性細(xì)胞系一般可以按照上述進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。

條件永生化的人羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞系，其可以是克隆的，但不是必需，一般可以通過(guò)在利于分化的培養(yǎng)條件下抑制促生長(zhǎng)蛋白的制備和/或活性進(jìn)行誘導(dǎo)分化。例如，如果編碼促生長(zhǎng)蛋白的基因在外部可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的控制下，諸如溫度或培養(yǎng)基組合物的條件可以進(jìn)行改變以抑制促生長(zhǎng)基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)于上述四環(huán)素控制的基因表達(dá)系統(tǒng)，可以通過(guò)添加四環(huán)素抑制促生長(zhǎng)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分化。一般而言，4-5天的1μg/ml四環(huán)素足以啟動(dòng)分化。為了促進(jìn)進(jìn)一步分化，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可以還包含其它試劑。

5.10使用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞進(jìn)行治療的方法

5.10.1循環(huán)系統(tǒng)疾病

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞、該細(xì)胞的群體和包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群，可用于治療表現(xiàn)出多種血管生成可以改善的疾病狀態(tài)或癥狀的個(gè)體。所述疾病狀態(tài)或癥狀的例子包括心肌梗塞、中風(fēng)、充血性心力衰竭、周圍動(dòng)脈疾病、左心發(fā)育不全綜合癥、糖尿病潰瘍、褥瘡潰瘍、靜脈潰瘍、動(dòng)脈潰瘍、灼傷、骨折不愈合、腫瘤相關(guān)的骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎和口腔頜面骨修復(fù)。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，和該細(xì)胞的群體，還可以用于促進(jìn)表現(xiàn)出外傷組織缺損或防止形成傷疤的個(gè)體、或具有全關(guān)節(jié)置換或鑲牙的個(gè)體的血管生成。

在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和該細(xì)胞的群體，可用于治療患有循環(huán)系統(tǒng)功能不全的個(gè)體，例如，患有周圍血管疾病或冠狀動(dòng)脈疾病的個(gè)體。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療患有心臟病或心臟損傷的患者的方法，包括向患有心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病或損傷的患者施用治療性細(xì)胞組合物，并評(píng)價(jià)患者心臟功能的改善，其中所述細(xì)胞組合物包含在此描述的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，心臟病為心肌病。在具體的實(shí)施方式中，心肌病是先天性的或具有已知原因的心肌病。在其它具體的實(shí)施方式中，心肌病本質(zhì)上為缺血性的或非缺血性的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病包括一種或多種的血管成形術(shù)、動(dòng)脈瘤、心絞痛(心絞痛癥)、主動(dòng)脈瓣狹窄、主動(dòng)脈炎、心率不齊、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈炎、非對(duì)稱性心室間隔肥厚(ash)、動(dòng)脈粥樣硬化、心房纖顫和撲動(dòng)、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、barlow綜合征(二尖瓣脫垂)、心動(dòng)過(guò)緩、buerger疾病(血栓閉塞性脈管炎)、心臟肥大、心肌病、心臟炎、頸動(dòng)脈疾病、主動(dòng)脈縮窄、先天性心臟病(先天性心臟缺陷)、充血性心力衰竭(心臟衰竭)、冠狀動(dòng)脈疾病、eisenmenger綜合征、栓塞、心內(nèi)膜炎、紅斑性肢痛病、纖維性顫動(dòng)、肌纖維發(fā)育不良、心傳導(dǎo)阻滯、心雜音、高血壓、低血壓、先天性嬰兒動(dòng)脈鈣化、川崎病(粘膜皮膚淋巴腺癥候群、粘膜皮膚淋巴腺疾病、嬰兒多動(dòng)脈炎)、代謝綜合征、微血管心絞痛、心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、心肌炎、陣發(fā)性房性心動(dòng)過(guò)速(pat)、結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎(多動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎)、心包炎、周圍血管疾病、嚴(yán)重肢體缺血、糖尿病血管病變、靜脈炎、肺動(dòng)脈瓣狹窄(肺狹窄)、raynaud病、腎動(dòng)脈狹窄、腎血管性高血壓、風(fēng)濕性心臟病、隔膜缺陷、心肌缺血、綜合征x、心動(dòng)過(guò)速、高安氏動(dòng)脈炎、法洛四聯(lián)癥、大血管移位、三尖瓣閉鎖、動(dòng)脈干、瓣膜性心臟病、曲張性潰瘍、靜脈曲張、血管炎、心室隔膜缺陷、wolff-parkinson-white綜合征、或心內(nèi)膜墊缺陷。

在其它實(shí)施方式中，心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病包括一種或多種的急性風(fēng)濕性發(fā)燒、急性風(fēng)濕性心包炎、急性風(fēng)濕性心內(nèi)膜炎、急性風(fēng)濕性心肌炎、慢性風(fēng)濕性心臟病、二尖瓣疾病、二尖瓣狹窄、風(fēng)濕性二尖瓣機(jī)能不全、主動(dòng)脈瓣疾病、其它心內(nèi)膜結(jié)構(gòu)疾病、缺血性心臟病(急性和亞急性)、心絞痛、肺循環(huán)疾病(急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病)、脊柱后側(cè)凸性心臟病、心肌炎、心內(nèi)膜炎、心內(nèi)膜心肌纖維化、心內(nèi)膜纖維彈性組織增生、房室傳導(dǎo)阻滯、心節(jié)律異常、心肌變性、包括腦血管疾病的循環(huán)系統(tǒng)疾病、腦前動(dòng)脈閉塞和狹窄、腦動(dòng)脈閉塞、動(dòng)脈疾病、小動(dòng)脈和毛細(xì)血管疾病(動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈瘤)、或靜脈和淋巴管疾病。

在一個(gè)實(shí)施方式中，治療包括使用包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的治療性細(xì)胞組合物治療患有心肌病的患者，其中使用或不使用另一種細(xì)胞類型。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，患者從該治療中受益，例如受益于所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞支持其它細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，包括心臟中的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，來(lái)自組織生長(zhǎng)或血管化中的組織，和受益于有益細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞激素等等的存在，但是所述羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞細(xì)胞不整合入患者體內(nèi)或在其中擴(kuò)增。在另一個(gè)實(shí)施方式中，患者從所述細(xì)胞治療中受益，但是所述細(xì)胞在患者體內(nèi)并不存活很久。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞的數(shù)量、活力或生化活性逐漸降低，在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞的減少可以在一段活性周期之前，例如生長(zhǎng)、分裂或生化活性。在其它實(shí)施方式中，衰老的、無(wú)活力的或者甚至是死亡的所述細(xì)胞都可能具有有益的治療效果。

患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個(gè)體的改善可以通過(guò)對(duì)循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的一種或更多的癥狀的可檢測(cè)地改善進(jìn)行評(píng)價(jià)或表現(xiàn)，其中個(gè)體被施用在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或治療組合物。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，患有循環(huán)系統(tǒng)疾病或紊亂的個(gè)體的改善可以通過(guò)對(duì)一種或更多心功能指標(biāo)的可檢測(cè)地改善進(jìn)行評(píng)價(jià)或表現(xiàn)，其中個(gè)體被施用在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或治療組合物，例如，與施用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞前的該個(gè)體相比，在以下一種或多種方面表現(xiàn)出可檢測(cè)地改善：胸部心輸出量(co)、心指數(shù)(ci)、肺動(dòng)脈楔壓(pawp)、和心指數(shù)(ci)、％縮短分?jǐn)?shù)(％fs)、射血分?jǐn)?shù)(ef)、左心室射血分?jǐn)?shù)(lvef)；左心室舒張末內(nèi)徑(lvedd)、左心室收縮末內(nèi)徑(lvesd)、收縮性(例如dp/dt)、壓力-容積環(huán)、心臟功能檢測(cè)、心房或心室功能增強(qiáng)；泵效率增加、泵效率損失速率降低、血液動(dòng)力學(xué)功能損失降低；以及與心肌病相關(guān)的并發(fā)癥減少。

接受在此提供的治療組合物的個(gè)體的改善也可以通過(guò)主觀指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如，個(gè)體對(duì)他或她在施用后的健康狀況的自我評(píng)價(jià)。

在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞的成功施用并不取決于施用的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在個(gè)體中的存活。相反，所述成功是基于心臟或循環(huán)健康的一種或更多改善的指標(biāo)，如上所述。從而，所述細(xì)胞不需要整合并與患者的心臟一起跳動(dòng)，或進(jìn)入血管。

在某些實(shí)施方式中，在此提供的治療方法包括誘導(dǎo)治療性的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞按照間充質(zhì)譜系進(jìn)行分化，例如，分化成為心肌細(xì)胞樣表型、血管生成表型或血管原性表型，或形成諸如肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞、心外膜細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞(例如血管平滑肌細(xì)胞)的細(xì)胞。

對(duì)需要的個(gè)體施用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或包含該細(xì)胞的治療組合物，可以通過(guò)以下方式進(jìn)行，例如，通過(guò)植入、移植(例如，細(xì)胞自身或作為基質(zhì)-細(xì)胞組合的一部分的細(xì)胞)、注射(例如，直接至疾病或狀況的位置，例如，直接至患有心肌梗塞的個(gè)體的心臟缺血位置)、融合、導(dǎo)管傳輸或任何其它本領(lǐng)域已知的用于提供細(xì)胞治療的方法。

在一個(gè)實(shí)施方式中，治療性細(xì)胞組合物通過(guò)例如在個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)位置處進(jìn)行注射來(lái)提供給有需求的個(gè)體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，治療性細(xì)胞組合物通過(guò)心內(nèi)注射進(jìn)行提供，例如，至缺血性的心臟區(qū)域。在其它具體的實(shí)施方式中，細(xì)胞注射到心臟表面、相鄰區(qū)域或甚至更遠(yuǎn)的區(qū)域。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以將細(xì)胞錨定(home)至患病或受傷的區(qū)域。

患有冠狀或血管系統(tǒng)疾病或狀況的個(gè)體可以在細(xì)胞利于治療的任何時(shí)間施用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，例如，本發(fā)明的細(xì)胞或治療組合物在心肌梗塞的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時(shí)，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天內(nèi)施用。對(duì)于心肌梗塞，例如1-3或1-7天內(nèi)的接近時(shí)間施用優(yōu)于較晚施用，例如，心肌梗塞3或7天后。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞或治療組合物在對(duì)疾病或狀況初診后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24小時(shí)，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30天內(nèi)進(jìn)行施用。

在此還提供了用于治療心肌梗塞的試劑盒。試劑盒中提供治療性細(xì)胞組合物，其可以制成藥學(xué)上可接受的形式，例如通過(guò)混合藥學(xué)上可接受的載體；和涂藥器，以及使用說(shuō)明。理想的，該試劑盒可用于例如在醫(yī)師辦公室中，或通過(guò)急救提供者應(yīng)用給經(jīng)診斷患有心肌梗塞或類似的心臟事件的患者。

在此提供的治療方法的具體的實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞與干細(xì)胞(即，并非羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的干細(xì)胞)、成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、心成肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞，或成肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、心成肌細(xì)胞、和/或成心肌細(xì)胞的祖細(xì)胞一起施用。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，在此提供的治療方法包括施用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，例如，包含所述細(xì)胞的治療組合物，至患有心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病的患者；以及評(píng)價(jià)患者心功能的改善，其中治療性細(xì)胞組合物作為基質(zhì)-細(xì)胞復(fù)合物進(jìn)行施用。在某些實(shí)施方式中，基質(zhì)為支架，優(yōu)選的可生物吸收，其至少包含細(xì)胞。

為此，本發(fā)明提供了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群，其在刺激干細(xì)胞或祖細(xì)胞向心原性、血管原性、血管生成或血管原等途徑分化的一種或更多因子存在的條件下進(jìn)行孵育。所述因子是本領(lǐng)域已知的；可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適于分化的條件。所述因子包括但不限于因子，例如生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞產(chǎn)物、去甲基化試劑和其它刺激物，其現(xiàn)在已知或以后確定為能夠刺激例如干細(xì)胞向心原性、血管原性、血管生成或血管原等途徑或譜系分化。

通過(guò)在包含至少一種的去甲基化試劑、bmp、fgf、wnt因子蛋白、hedgehog和/或抗wnt因子等因子存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞，可以使得羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞向心原性、血管原性、血管生成或血管原等途徑或譜系分化。

含有去甲基化試劑允許細(xì)胞向心原性途徑的間質(zhì)系進(jìn)行分化。分化可以通過(guò)下述方式進(jìn)行測(cè)定，例如表達(dá)至少一種的心肌凝蛋白、骨肌凝蛋白或gata4；或自發(fā)或用其他方式誘導(dǎo)獲得心律；或能夠至少部分整合至患者的心肌中而不會(huì)誘發(fā)心率不齊的能力。可用于啟動(dòng)所述分化的去甲基化試劑包括但不限于5-氮雜胞苷、5-氮雜-2’-脫氧胞苷、二甲亞砜、氯化白屈菜赤堿、類維生素a或其鹽、2-氨基-4-(乙基硫)丁酸、普魯卡因胺、和普魯卡因。

在此的某些實(shí)施方式中，經(jīng)上述鑒定使用一種或更多因子進(jìn)行誘導(dǎo)的細(xì)胞可以成為心原性、血管原性、血管生成或血管原細(xì)胞或祖細(xì)胞。優(yōu)選的至少一些細(xì)胞可以至少部分整合至受體的心血管系統(tǒng)，包括但不限于心肌、血管和心臟的其它結(jié)構(gòu)，心血管或周邊血管，等等。在某些其它的實(shí)施方式中，分化的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分化為獲得能夠識(shí)別心原性細(xì)胞或其祖細(xì)胞的兩種或更多標(biāo)記的細(xì)胞，且能夠部分或全部整合至受者的心臟或維管系統(tǒng)。在具體的實(shí)施方式中，給個(gè)體施用的細(xì)胞不會(huì)增加心率不齊、心臟缺陷、血管缺陷或個(gè)體循環(huán)系統(tǒng)或健康的其它異常。在某些實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞能夠促進(jìn)天然存在于患者心肌、血管、血液等等的干細(xì)胞的分化，其自身分化成例如成心肌細(xì)胞，或至少向心原性、血管原性、血管生成或血管原系分化。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞和所述細(xì)胞的群體可以作為治療或預(yù)防來(lái)提供給個(gè)體，例如，患有心臟或循環(huán)系統(tǒng)疾病、紊亂或癥狀、或感染的個(gè)體。所述疾病、紊亂或癥狀可以包括由動(dòng)脈粥樣硬化、心肌病或心損傷引起的充血性心力衰竭，例如，缺血性損傷，例如來(lái)自心肌梗塞或創(chuàng)傷(急性或慢性)。

在某些實(shí)施方式中，對(duì)個(gè)體施用治療有效量的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，例如，在包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞群中。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體包含約50％的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述群體為基本上均勻的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞群。在其它實(shí)施方式中，所述群體包含至少約5％、10％、20％、25％、30％、33％、40％、60％、66％、70％、75％、80％、或90％的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以以包含該細(xì)胞和另一種下述治療劑的治療組合物的形式對(duì)個(gè)體施用，例如胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)、血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)、il-8、抗血栓形成劑(例如、肝磷脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、和ppack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)；抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、雙嘧達(dá)莫、魚(yú)精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑、和/或血小板抑制劑)、抗凋亡劑(例如，epo、epo衍生物和類似物及其鹽、tpo、igf-i、igf-ii、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)或半胱天冬酶抑制劑)、抗炎劑(例如，p38map激酶抑制劑、他汀、il-6和il-1抑制劑、吡嘧司特、曲尼司特、類克、西羅莫司，非類固醇類抗炎癥化合物例如乙酰水楊酸、布洛芬、替泊沙林、托美丁、或舒洛芬)、免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑(例如，鈣神經(jīng)素抑制劑，例如環(huán)孢菌素、他羅利姆，mtor抑制劑例如西羅莫司或依維莫司；抗增生劑例如硫唑嘌呤和麥考酚酸嗎乙酯；皮質(zhì)類固醇，例如，潑尼松龍或氫化可的松；抗體，例如單克隆抗il-2rα受體抗體、巴利昔單抗、daclizuma，多克隆抗t-細(xì)胞抗體例如抗胸腺細(xì)胞球蛋白(atg)，抗淋巴細(xì)胞球蛋白(alg)，和單克隆抗t細(xì)胞抗體okt3，或描述于美國(guó)專利號(hào)7,468,276和美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0275362的貼壁胎盤干細(xì)胞，其公開(kāi)內(nèi)容全文引入作為參考)，和/或抗氧化劑(例如，普羅布可；維生素a、c和e，輔酶q-10，谷胱甘肽，l半胱氨酸，n-乙酰半胱氨酸，或前述抗氧化劑的衍生物、類似物或鹽)。在某些實(shí)施方式中，包含羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的治療組合物進(jìn)一步包含一種或更多另外的細(xì)胞類型，例如，成體細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞或內(nèi)胚層細(xì)胞)或干細(xì)胞或祖細(xì)胞。該治療劑和/或一種或更多另外的細(xì)胞可分別施用至有需求的個(gè)體，或施用兩種或更多的該化合物或試劑的組合。

在某些實(shí)施方式中，待治療的個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，待治療的個(gè)體為人。在具體的實(shí)施方式中，個(gè)體為家畜類動(dòng)物或家畜。在其它具體的實(shí)施方式中，待治療的個(gè)體為馬、羊、牛或閹公牛、豬、狗或貓。

5.10.2中風(fēng)和其它缺血性疾病

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療患有例如在腦內(nèi)或腦周圍或在周圍維管系統(tǒng)中血流破壞(disruption)的個(gè)體的方法，其包括施用至個(gè)體治療有效量的amdac。在某些特定實(shí)施方式中，缺血為周圍動(dòng)脈疾病(pad)，例如，嚴(yán)重肢體缺血(cli)。在某些其它的實(shí)施方式中，缺血為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)缺血。在某些其它的實(shí)施方式中，缺血為周圍動(dòng)脈疾病、缺血性血管疾病、缺血性心臟病，缺血性腦部疾病或缺血性腎疾病。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述血流破壞為中風(fēng)。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述中風(fēng)為缺血性的中風(fēng)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述中風(fēng)為出血性中風(fēng)，例如，顱內(nèi)腦出血或自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述破裂為血腫。在更加具體的實(shí)施方式中，血腫為硬腦膜血腫、硬膜下血腫或蛛網(wǎng)膜下腔血腫。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述血腫由頭蓋骨受到外力所引起，例如，頭部損傷。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述破裂為短暫性腦缺血發(fā)作(tia)，例如，再生性tia。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述破裂為血管痙攣，例如，出血性中風(fēng)后的血管痙攣。

在本方法的另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述治療有效量為一定的amdac的數(shù)量，其消除、可檢測(cè)地改善引起所述個(gè)體表現(xiàn)出的腦內(nèi)或腦周圍或cns的血流破壞例如缺氧損傷或低氧損傷的一種或更多癥狀或神經(jīng)性缺乏，或減輕上述一種或更多癥狀或神經(jīng)性缺乏嚴(yán)重程度或減緩它們的進(jìn)程。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述治療有效量的分離的amdac被預(yù)防性地施用至所述個(gè)體，例如，減少或消除由所述血流破壞之后在腦內(nèi)或腦周圍或cns的二次或繼發(fā)性血流破壞引起的神經(jīng)損傷。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述腦內(nèi)或腦周圍的血流破壞癥狀，例如，中風(fēng)，缺氧損傷或低氧損傷，是以下癥狀中的一種或多種：偏癱(半身麻痹)；輕偏癱(半身無(wú)力)；面部肌肉無(wú)力；麻木；感覺(jué)降低；嗅覺(jué)、味覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)或視覺(jué)改變；嗅覺(jué)、味覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)或視覺(jué)損失；眼瞼下垂(下垂癥)；可檢測(cè)的眼球外肌無(wú)力；咽反射降低；吞咽能力降低；瞳孔光反應(yīng)降低；面部感覺(jué)降低；平衡降低；眼球震顫；呼吸速率改變；心跳速率改變；胸鎖乳突肌無(wú)力，難以或無(wú)法轉(zhuǎn)動(dòng)頭部；舌頭無(wú)力；失語(yǔ)癥(不能說(shuō)話或理解語(yǔ)言)；失用癥(改變的隨意運(yùn)動(dòng))；視野缺陷；記憶缺失；半邊忽略或半側(cè)空間忽視(損傷另一側(cè)的視野空間注意力缺乏)；思維瓦解；思維混亂；發(fā)展猥褻手勢(shì)(hypersexualgestures)；病感失認(rèn)(堅(jiān)持拒絕承認(rèn)存在缺陷)；行走困難；運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性改變；眩暈；平衡不穩(wěn)；意識(shí)喪失；頭疼；和/或嘔吐。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，上述治療方法包括對(duì)所述個(gè)體施用第二治療劑。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述第二治療劑為神經(jīng)保護(hù)劑。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述第二治療劑為nxy-059(一種苯基丁基硝酮的二磺?；苌铮憾c4-((叔-丁亞胺)-甲基)苯-1,3-二磺酸n-氧化物，或二鈉4-((氧化-叔-丁基-胺亞基)-甲基)苯-1,3-二磺酸；也稱為disufenton)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，第二治療劑為溶血栓劑。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述溶血栓劑為組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tpa)。在腦內(nèi)或腦周圍的血流破壞為出血性的實(shí)施方式中，第二治療劑可以是抗高血壓藥，例如，a、β阻斷劑或利尿藥物，利尿藥物和保鉀利尿藥物的組合，a、β阻斷劑和利尿藥物的組合，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ace)抑制劑和利尿劑的組合，血管緊張肽-ii拮抗劑和利尿藥物，和/或鈣通道阻斷劑和ace抑制劑。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，第二治療劑為鈣通道阻斷劑，谷氨酸拮抗劑，γ氨基丁酸(gaba)激動(dòng)劑，抗氧化劑或自由基清除劑。

在另一個(gè)具體的治療方法實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的21-30天內(nèi)，例如，21天內(nèi)施用至所述個(gè)體，例如，在發(fā)展出中風(fēng)、缺氧損傷或低氧損傷的癥狀的21-30天內(nèi)，例如，21天內(nèi)。在另一個(gè)具體的治療方法實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的14天內(nèi)施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的治療方法實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的7天內(nèi)施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的治療方法實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的48小時(shí)內(nèi)施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的24小時(shí)內(nèi)施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的12小時(shí)內(nèi)施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac在所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍發(fā)展出血流破壞的一種或更多癥狀的3小時(shí)內(nèi)施用至所述個(gè)體。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述血流破壞為嚴(yán)重肢體缺血(cli)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述cli為下肢動(dòng)脈嚴(yán)重堵塞，其顯著降低血流量。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述cli的特征為缺血性的休息痛，當(dāng)人不動(dòng)的時(shí)候腿部和足部發(fā)生重度疼痛，腿部或足部未治愈的潰瘍，足部疼痛或麻木，腿部或足部的有光澤的、光滑的、干枯的皮膚，腳趾甲變厚，腿部或足部脈搏不存在或消失，開(kāi)放性潰瘍，無(wú)法愈合的皮膚感染或潰瘍，腿部或足部的干性壞疽(干燥、黑色皮膚)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，cli可以引起指頭或整個(gè)肢體的受損。在本方法的另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述治療有效量為一定的amdac的數(shù)量，其消除、可檢測(cè)地改善所述個(gè)體腦內(nèi)或腦周圍或cns的血流破壞例如缺氧損傷或低氧損傷引起的一種或更多肢體功能缺損或不供氧(氧不足/缺氧)的癥狀，減輕上述癥狀嚴(yán)重的程度或減緩進(jìn)程。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述治療有效量的分離的amdac預(yù)防性地施用至所述個(gè)體，例如，減少或消除由所述血流破壞之后在肢體內(nèi)或其周圍的二次或繼發(fā)性的血流破壞引起的組織損傷。

5.10.3施用劑量和途徑

將amdac施用至有需求的個(gè)體時(shí)可以采用任何醫(yī)學(xué)上可接受的與待治療的疾病或狀況相關(guān)的途徑。在上述治療方法的另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述amdac通過(guò)彈丸注射施用。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac通過(guò)靜脈輸液施用。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述靜脈輸液為靜脈輸液約1至約8小時(shí)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac通過(guò)顱內(nèi)施用。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac通過(guò)肌肉注射施用。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac通過(guò)腹膜內(nèi)施用。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac通過(guò)動(dòng)脈內(nèi)施用。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac在缺血性區(qū)域內(nèi)施用。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac施用至缺血性區(qū)域周圍。在另一個(gè)特別的治療方法實(shí)施方式中，所述分離的amdac通過(guò)肌肉注射、皮內(nèi)或皮下施用。

在上述治療方法的另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述amdac對(duì)所述個(gè)體施用一次。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述分離的amdac兩次或更多次施用至所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用約1×10⁴至1×10⁵分離的amdac，例如，amdac每千克所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用約1×10⁵至1×10⁶分離的amdac每千克所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用約1×10⁶至1×10⁷分離的amdac每千克所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用約1×10⁷至1×10⁸分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體。在其它具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用約1×10⁶至約2×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約2×10⁶至約3×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約3×10⁶至約4×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約4×10⁶至約5×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約5×10⁶至約6×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約6×10⁶至約7×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約7×10⁶至約8×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；約8×10⁶至約9×10⁶分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體；或約9×10⁶至約1×10⁷分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用至所述個(gè)體約1×10⁷至約2×10⁷分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用至所述個(gè)體約1.3×10⁷至約1.5×10⁷分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用至所述個(gè)體多達(dá)約3×10⁷分離的胎盤細(xì)胞每千克所述個(gè)體。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用至所述個(gè)體約5×10⁶至約2×10⁷分離的胎盤細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括在約20毫升溶液中施用約150×10⁶分離的胎盤細(xì)胞至所述個(gè)體。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括施用約5×10⁶至約2×10⁷分離的胎盤細(xì)胞至所述個(gè)體，其中所述細(xì)胞包含在包括10％葡聚糖，例如，葡聚糖-40，5％人血清白蛋白，和可選的免疫抑制劑的溶液中。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括靜脈注射施用約5×10⁷至3×10⁹分離的胎盤細(xì)胞。在更加具體的實(shí)施方式中，所述施用包括靜脈注射施用約9×10⁸分離的胎盤細(xì)胞或約1.8×10⁹分離的胎盤細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述施用包括顱內(nèi)施用約5×10⁷至1×10⁸分離的胎盤細(xì)胞。在一個(gè)更加具體的實(shí)施方式中，所述施用包括顱內(nèi)施用約9×10⁷分離的胎盤細(xì)胞。

5.11羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的分化

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以是分化的。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)例如使細(xì)胞接觸血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)，或按照描述于下述5.11.2、6.3.3或6.3.4節(jié)的方法，細(xì)胞已經(jīng)充分分化至能夠表現(xiàn)出至少一種的內(nèi)皮細(xì)胞、肌性細(xì)胞或周細(xì)胞的特性。在更加具體的實(shí)施方式中，所述內(nèi)皮細(xì)胞、肌性細(xì)胞或周細(xì)胞的特性是表達(dá)cd9、cd31、cd54、cd102、ng2(神經(jīng)/神經(jīng)膠質(zhì)抗原2)或α平滑肌肌動(dòng)蛋白中的一種或多種，其相對(duì)于oct-4^–、vegfr2/kdr⁺、cd9⁺、cd54⁺、cd105⁺、cd200⁺，和ve-鈣粘蛋白^–羊膜細(xì)胞而言表達(dá)增強(qiáng)。在其它更加特殊的實(shí)施方式中，所述內(nèi)皮細(xì)胞、肌性細(xì)胞或周細(xì)胞的特性是表達(dá)cd9、cd31、cd54、cd102、ng2(神經(jīng)/神經(jīng)膠質(zhì)抗原2)或α平滑肌肌動(dòng)蛋白中的一種或多種，其相對(duì)于oct-4^–、vegfr2/kdr⁺，和vegfr1/flt-1⁺羊膜細(xì)胞而言表達(dá)增強(qiáng)。

5.11.1誘導(dǎo)血管生成

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞導(dǎo)致的血管生成可以通過(guò)如下方式進(jìn)行。例如在-2(lonza)的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，或下述培養(yǎng)基中培養(yǎng)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞至第3代，所述培養(yǎng)基含有60％dmem-lg(gibco)，40％mcdb-201(sigma)；2％胎牛血清(hyclonelabs.)；1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(its)；1×亞油酸-牛血清白蛋白(la-bsa)；5×10^-9m地塞米松(sigma)；10^-4m抗壞血酸2-磷酸鹽(sigma)；表皮生長(zhǎng)因子10ng/ml(r&dsystems)；以及血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)10ng/ml(r&dsystems)。然后將細(xì)胞置于matrigel^tm或基質(zhì)包括膠原蛋白-1上，例如，在96-孔板中，其密度為，例如，約1.5×10⁴細(xì)胞每孔，其在相同培養(yǎng)基中或具有包含例如約10-50ng每微升的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)的fbs(0–5％v/v)的dmem中。培養(yǎng)基可以約一周兩次進(jìn)行更換。血管生成通過(guò)視覺(jué)觀察細(xì)胞出芽管樣結(jié)構(gòu)和管腔形成進(jìn)行證實(shí)，其可以在例如50×-100×放大倍數(shù)的顯微鏡下進(jìn)行觀察。

5.11.2誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞

在此提供的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的肌源性(心源性)分化可以通過(guò)例如將細(xì)胞置于誘導(dǎo)分化為成心肌細(xì)胞的培養(yǎng)條件下來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的成心肌細(xì)胞培養(yǎng)基包括補(bǔ)充1μm類維生素a的dmem/20％cbs；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，10ng/ml；以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1，2ng/ml；以及表皮生長(zhǎng)因子，100ng/ml。knockout血清替代品(invitrogen，carlsbad，california)可用于替代cbs?？蛇x的，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)充1-100的dmem/20％cbs中24小時(shí)，例如，50ng/ml的心肌營(yíng)養(yǎng)蛋白-1。在另一個(gè)實(shí)施方式中，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可以培養(yǎng)10-14天，其中在無(wú)蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，然后使用例如在補(bǔ)充1％臍帶血血清的1％hepes緩沖液中勻漿人心肌得到的人心肌提取物進(jìn)行刺激。

可以通過(guò)例如rt/pcr顯示基因表達(dá)或通過(guò)可觀察的細(xì)胞博動(dòng)(beating)來(lái)確認(rèn)分化。當(dāng)細(xì)胞表現(xiàn)出一種或多種的這些特性時(shí)可以認(rèn)為貼壁細(xì)胞已經(jīng)分化為心肌細(xì)胞。

6.實(shí)施例

6.1實(shí)施例1：來(lái)自羊膜的貼壁細(xì)胞的分離和擴(kuò)增

本實(shí)施例顯示羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的分離和擴(kuò)增。

6.1.1分離

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞按照下述方法從羊膜中分離。從胎盤切下羊膜/絨毛膜，并將羊膜從絨毛膜中進(jìn)行手工分離。用無(wú)菌pbs洗滌羊膜去除剩余的血液、血塊和其它物質(zhì)。使用無(wú)菌紗布去除洗滌未曾除去的血液、血塊或其它物質(zhì)，并用pbs再次洗滌羊膜。從膜上去除多余的pbs，并用手術(shù)刀將羊膜切成2”乘2”的碎片。為了釋放上皮細(xì)胞，通過(guò)將無(wú)菌加套的玻璃加工容器與37℃循環(huán)水浴使用管路和連接器進(jìn)行連接，并安裝至攪拌盤上，來(lái)構(gòu)建加工容器。將胰蛋白酶(0.25％，300ml)在加工容器中加熱至37℃；加入羊膜碎片，攪拌羊膜/胰蛋白酶懸液，例如，在37℃下100rpm-150rpm攪拌15分鐘。將無(wú)菌容器置于靠近加工容器的無(wú)菌區(qū)域內(nèi)并在其中插入無(wú)菌的75μm-125μm篩選器(millipore，billerica，ma)，裝配無(wú)菌篩選系統(tǒng)。攪拌羊膜碎片15分鐘后，將加工容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至篩選器，并使用例如無(wú)菌鑷子將羊膜碎片轉(zhuǎn)移回加工容器；丟棄含有上皮細(xì)胞的胰蛋白酶溶液。將羊膜碎片與如上所述的300ml胰蛋白酶溶液(0.25％)進(jìn)行再次攪拌。用大約100-150ml的pbs洗滌篩選器，并丟棄pbs溶液。攪拌羊膜碎片15分鐘后，將加工容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至篩選器。然后將羊膜碎片轉(zhuǎn)移回加工容器；丟棄含有上皮細(xì)胞的胰蛋白酶溶液。將羊膜碎片與如上所述的300ml胰蛋白酶溶液(0.25％)進(jìn)行再次攪拌。用洗滌篩選器大約100-150ml的pbs，并丟棄pbs溶液。攪拌羊膜碎片15分鐘后，將加工容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至篩選器。然后將羊膜碎片轉(zhuǎn)移回加工容器，并丟棄含有上皮細(xì)胞的胰蛋白酶溶液。在37℃下將羊膜碎片在pbs/5％fbs(體積比1:1比例的羊膜：pbs/5％fbs溶液)中攪拌大約2-5分鐘中和胰蛋白酶。裝配新鮮的無(wú)菌篩選系統(tǒng)。中和胰蛋白酶后，將加工容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至新篩選器，并將羊膜碎片轉(zhuǎn)移回加工容器。室溫下，將無(wú)菌pbs(400ml)加至加工容器，并將加工容器內(nèi)容物攪拌約2-5分鐘。用約100-150ml的pbs洗滌篩選器。攪拌后，將加工容器的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至篩選器；用pbs洗滌加工的燒瓶，并丟棄pbs溶液。用300ml預(yù)熱的dmem填充加工容器，并將羊膜碎片轉(zhuǎn)移至dmem溶液。

為了釋放羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞，將上述處理的羊膜進(jìn)一步用膠原蛋白酶進(jìn)行如下處理。通過(guò)在dmem中溶解適當(dāng)數(shù)量的膠原蛋白酶粉末(隨著供應(yīng)商提供的膠原蛋白酶批次的活性而變化)制備無(wú)菌膠原蛋白酶儲(chǔ)存液(500u/ml)。將溶液經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾并分裝至單獨(dú)的無(wú)菌容器中。將cacl2溶液(0.5ml，600mm)加至各100ml劑量，并冷凍各劑量。在加工容器中將膠原蛋白酶(100ml)加至羊膜碎片，并對(duì)加工容器進(jìn)行攪拌30-50分鐘，或直至通過(guò)視覺(jué)觀察羊膜已經(jīng)消化完成。羊膜消化完成后，將100ml的預(yù)熱的無(wú)菌pbs/5％fbs加至加工容器，并另外攪拌加工容器2-3分鐘。攪拌后，燒瓶的內(nèi)容物被轉(zhuǎn)移至一個(gè)無(wú)菌60μm篩選器中，并通過(guò)真空過(guò)濾收集液體。加工容器用400ml的pbs洗滌，并無(wú)菌過(guò)濾該pbs溶液。然后將過(guò)濾的細(xì)胞懸液在20℃下離心300xg15分鐘，并將細(xì)胞沉淀重懸于預(yù)熱的pbs/2％fbs(共大約10ml)。

6.1.2培植

新鮮分離的血管生成羊膜細(xì)胞被加至含有60％dmem-lg(gibco)；40％mcbd-201(sigma)；2％fbs(hyclonelabs)，1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(its)；10ng/ml亞油酸-牛血清白蛋白(la-bsa)；1n-地塞米松(sigma)；100μm抗壞血酸2-磷酸鹽(sigma)；10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(r&d系統(tǒng))；以及10ng/ml血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)(r&d系統(tǒng))的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并以10,000細(xì)胞每cm²的接種密度接種于t-flask中。然后在37℃，5％co2和>90％濕度下孵育培養(yǎng)設(shè)備。每天監(jiān)控細(xì)胞的附著、生長(zhǎng)和形態(tài)。及時(shí)去除非貼壁細(xì)胞和碎片在更換培養(yǎng)。培養(yǎng)基每周更換兩次。具有典型的成纖維樣/紡錘形態(tài)的貼壁細(xì)胞在最初接種的幾天后出現(xiàn)。當(dāng)匯合度達(dá)到40％-70％(最初接種后4–11天)，通過(guò)胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶–edta)5分鐘在室溫下(37℃)收獲細(xì)胞。用pbs-5％fbs中和后，細(xì)胞在室溫下200–400g離心5-15分鐘，然后重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。這時(shí)，可以認(rèn)為amdac系已經(jīng)成功地在初代進(jìn)行了培植。在一些情況下，將初代羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞進(jìn)行低溫貯藏或擴(kuò)增。

6.1.3培養(yǎng)方法

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)于上述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并在密度為2000–4000每cm²下接種于合適的組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)設(shè)備。然后在37℃，5％co2和>90％濕度下孵育培養(yǎng)設(shè)備。培養(yǎng)過(guò)程中，amdac將會(huì)貼壁并增殖。每天監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)和匯合度。如果培養(yǎng)延續(xù)至5天或更多則每周更換兩次培養(yǎng)基補(bǔ)充新鮮營(yíng)養(yǎng)物。當(dāng)匯合度達(dá)到40％-70％(接種后3-7天)時(shí)，通過(guò)胰蛋白酶消化(0.05％-0.25％胰蛋白酶–edta)5分鐘在室溫下(37℃)收獲細(xì)胞。用pbs-5％fbs中和后，細(xì)胞在室溫下200–400g離心5-15分鐘，然后重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

按照本方法分離并培養(yǎng)的amdac一般在接種的1×10⁶細(xì)胞中產(chǎn)生33530+/–15090集落形成單位(成纖維細(xì)胞)(cfu-f)。

6.2實(shí)施例2：羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的表型特性

6.2.1基因和蛋白表達(dá)譜

本實(shí)施例描述了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的表型特性，包括細(xì)胞表面標(biāo)記、mrna和蛋白質(zhì)表達(dá)等特性。

樣品制備：羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞按照描述于實(shí)施例1的方法獲得。第6代的細(xì)胞在描述于上述實(shí)施例1的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至大約70％匯合度，進(jìn)行胰蛋白酶化和pbs洗滌。將ntera-2細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所，atcc編號(hào)crl-1973)生長(zhǎng)于含有4.5g/l葡萄糖、2mm谷氨酰胺和10％fbs的dmem。進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)以獲得最少2×10⁶-1x10⁷細(xì)胞。然后使用qiagenrneasy試劑盒(qiagen，valencia，ca)裂解細(xì)胞，使用qiashredder得到裂解物。然后使用qiagenrneasy試劑盒分離rna。使用nanodropnd1000分光光度計(jì)檢測(cè)rna的數(shù)量和質(zhì)量，25ng/μlrna/反應(yīng)。使用appliedbiosystems(fostercity，ca)的highcapacitycdnaarchive試劑盒進(jìn)行cdna反應(yīng)。使用appliedbiosystems的universalpcrmastermixes進(jìn)行實(shí)時(shí)pcr反應(yīng)。在appliedbiosystems7300實(shí)時(shí)pcr系統(tǒng)中以標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)。

樣品分析和結(jié)果：使用實(shí)時(shí)pcr方法和特定的基因表達(dá)探針和/或人血管生成陣列(appliedbiosystems)，表征了細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)的血管生成性和心原性標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果或者顯示為與有關(guān)細(xì)胞對(duì)照相比目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)，或者與普遍存在的看家基因(例如，gapdh、18s或gusb)相比目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)(δct)。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞表達(dá)不同的干細(xì)胞相關(guān)性血管生成性和心原性基因，并且，與ntera-2細(xì)胞相比，表現(xiàn)出相對(duì)缺失的oct-4表達(dá)。表1總結(jié)了選定的血管生成、心原性和干細(xì)胞基因的表達(dá)。

表1：經(jīng)rt-pcr測(cè)定羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞基因表達(dá)譜。

“mrna”欄表示在每個(gè)例子中測(cè)定特定標(biāo)記的mrna是否存在。

在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)amdac表達(dá)下述基因：芳基碳?xì)浠衔锸荏w核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(arnt2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(gdnf)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3(nt-3)、nt-5、低氧誘導(dǎo)的因子1α(hif1a)、低氧誘導(dǎo)的蛋白2(hig2)、血紅素加氧酶(脫環(huán))1(hmox1)、胞外超氧化物歧化酶[cu-zn](sod3)、過(guò)氧化氫酶(cat)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(tgfb1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1受體(tgfb1r)和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(hgfr/c-met)。

6.2.2使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

使用流式細(xì)胞術(shù)作為定量羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞表型標(biāo)記的方法來(lái)定義細(xì)胞同一性。細(xì)胞樣品來(lái)自冷凍儲(chǔ)存。解凍前和試劑制備過(guò)程中，將細(xì)胞瓶維持在干冰上。然后，使用37℃水浴快速解凍樣品。使用預(yù)冰凍的細(xì)胞計(jì)數(shù)(count)來(lái)計(jì)算初始解凍后基于數(shù)量的細(xì)胞稀釋液。將冷凍管在37℃水浴中短暫解凍大約30秒并輕輕攪拌。解凍后馬上將大約100-200μl的冷的(2-8℃)解凍溶液(添加2.5％白蛋白和5％gentran40的pbs)加至冷凍管并混合。輕柔混合后，將冷凍管的內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)移到含有相等體積的冷的(2-8℃)解凍溶液的15ml圓錐管中。去除上清液之前，在室溫下圓錐管中400g離心肌細(xì)胞5分鐘。剩余體積用移液管測(cè)量(估測(cè))；在室溫下剩余體積和細(xì)胞沉淀重懸于含1％fbs的pbs中，得到細(xì)胞濃度250×x10³細(xì)胞/100μl緩沖液。例如，將1×10⁶細(xì)胞重懸于400μl1％fbs。將細(xì)胞懸液置于預(yù)標(biāo)記的5mlfacs管(bectondickinson(bd)，franklinlakes，nj)。對(duì)于每種第一抗體類別，將100μl的細(xì)胞懸液分裝至一個(gè)同型對(duì)照管。表型分析前，將全部抗體的濃度最優(yōu)化以達(dá)到好的信號(hào)/噪聲比以及cd抗原跨4-log動(dòng)態(tài)范圍的充分檢測(cè)。對(duì)于用來(lái)染色各樣品的各同型和樣品抗體的體積進(jìn)行了測(cè)定。為了標(biāo)準(zhǔn)化同型和樣品管中抗體的量(以μg計(jì))，各抗體的濃度按照下式計(jì)算：(1/實(shí)際抗體濃度(μg/μl))x(對(duì)于2.5×10⁵細(xì)胞的目標(biāo)最終抗體μg數(shù))＝添加的抗體#μl。通過(guò)添加適當(dāng)數(shù)量的抗體至各管中制備同型和樣品抗體的mastermix。將細(xì)胞在暗處室溫下染色15-20分鐘。染色后，通過(guò)離心(400g×5分鐘)去除各樣品中未結(jié)合的抗體，然后在重懸于150μl的室溫1％fbspbs之前使用2ml1％fbspbs(室溫)洗滌。然后在bectondickinsonfacscalibur、facscantoi或bdfacscantoii流式細(xì)胞儀中按照生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行樣品分析。在不設(shè)定實(shí)時(shí)設(shè)備補(bǔ)償參數(shù)的情況下得到多參數(shù)流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)集(側(cè)散射(ssc)、前散射(fsc)和整合熒光譜(fl))。在得到(數(shù)據(jù))后使用facsdiva軟件根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明測(cè)定補(bǔ)償參數(shù)。這些設(shè)備的設(shè)定被應(yīng)用至各個(gè)樣品。在這些研究中所使用的熒光基團(tuán)偶聯(lián)物為別藻藍(lán)蛋白(apc)、熒光劑647(af647)、異硫氰酸熒光素(fitc)、藻紅蛋白(pe)和多甲藻素葉綠素蛋白(percp)，其全部來(lái)自bdbiosciences。表2總結(jié)了選定的細(xì)胞表面標(biāo)記，包括血管生成標(biāo)記的表達(dá)。

表2：按照流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)記。

“免疫定位流式細(xì)胞術(shù)”一欄表示通過(guò)免疫定位，特別是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定特定標(biāo)記是否存在。

在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，amdac細(xì)胞被標(biāo)記了抗人cd49f(藻紅蛋白-偶聯(lián)的克隆goh3；bdpharmingen商品號(hào)555736)，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。大約96％的amdac標(biāo)記了抗cd49f(即，為cd49f⁺)。

在另外的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)免疫定位還發(fā)現(xiàn)amdac表達(dá)cd49a、cd106、cd119、cd130、c-met(肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體；hgfr)、cxc趨化因子受體1(cxcr1)、pdgfra、和pdgfrb。通過(guò)免疫定位還發(fā)現(xiàn)amdac缺乏cd49e、cd62e、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(fgfr3)、腫瘤壞死因子受體超家族成員12a(tnfrsf12a)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(igf-1r)、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr6、趨化因子受體1(ccr1)、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、表皮生長(zhǎng)因子受體(egf-r)、胰島素受體(cd220)、白細(xì)胞介素受體4(il4-r；cd124)、il6-r(cd126)、tnf-r1a和1b(cd120a、b)以及erbb2/her2的表達(dá)。

6.2.3使用免疫組織化學(xué)(ihc)/免疫熒光化學(xué)(ifc)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

將第6代羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在4孔腔式載玻片上生長(zhǎng)至大約70％匯合度并用4％福爾馬林溶液各固定30分鐘。固定后，用pbs洗滌載玻片兩次5分鐘。將載玻片與來(lái)自第二抗體相同宿主的10％常規(guī)血清、2×酪蛋白和pbs中0.3％的tritonx100一起在室溫下的濕度箱中孵育20分鐘。吸干過(guò)量血清并用第一抗體(山羊多克隆igg(santacruz；santacruz，ca))在濕度箱中孵育載玻片。孵育溫度和時(shí)間取決于針對(duì)所用抗體選擇的最優(yōu)條件。一般而言，孵育時(shí)間為37℃下1-2小時(shí)或4℃下過(guò)夜。然后用pbs洗滌載玻片三次各5分鐘并在室溫下濕度箱中與針對(duì)第一抗體(兔抗山羊抗體(santacruz))宿主的熒光-偶聯(lián)的抗免疫球蛋白第二抗體一起孵育20-30分鐘。隨后用pbs洗滌載玻片三次各5分鐘，使用dapi(vectorlabs)裝好蓋玻片，加入溶液以復(fù)染胞核。細(xì)胞染色可以使用nikon熒光顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。所有圖像均采用相等的曝光時(shí)間，其針對(duì)對(duì)應(yīng)類別(山羊igg(santacruz))的背景進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。表3總結(jié)了羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞表達(dá)血管生成蛋白的結(jié)果。

表3：羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞存在或缺失的血管生成標(biāo)記。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞表達(dá)血管生成標(biāo)記腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物7(tem-7)，表3所示蛋白質(zhì)中的一種。參見(jiàn)圖2。

6.2.4使用膜蛋白質(zhì)組學(xué)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

膜蛋白純化：將第6代羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至大約70％匯合度，胰蛋白酶消化，并用pbs洗滌。在細(xì)胞裂解前，將細(xì)胞用含有蛋白酶抑制劑混合物(p8340，sigmaaldrich，st.louis，mo)的溶液孵育15分鐘。然后通過(guò)添加10mmhcl溶液(從而避免使用洗滌劑)裂解細(xì)胞并在400g下離心10分鐘以沉淀和去除胞核。將去核上清液轉(zhuǎn)移至超離心管并使用具有t-1270轉(zhuǎn)子(thermofisherscientific，asheville，nc)的wx80超速離心機(jī)在100,000g下離心150分鐘，產(chǎn)生膜蛋白沉淀。

蛋白脂質(zhì)體的生成、固定化和消化：將膜蛋白沉淀用nanoxis緩沖液(10mmtris，300mmnacl，ph8)洗滌幾次。將膜蛋白沉淀重懸于1.5ml的nanoxis緩沖液中，然后使用vibra-cell^tmvc505超聲處理器(sonics&materials，inc.，newtown，ct)在冰上尖端超聲20分鐘。通過(guò)使用fm1-43染料(invitrogen，carlsbad，ca)染色測(cè)定蛋白脂質(zhì)體大小并用熒光顯微鏡觀察。蛋白脂質(zhì)體懸液的蛋白濃度通過(guò)bca分析(thermoscientific)測(cè)定。然后使用標(biāo)準(zhǔn)移液管頭將蛋白脂質(zhì)體注射至lpi^tmflowcell(nanoxisab，gothenburg，sweden)并使之固定化1小時(shí)。固定化以后，進(jìn)行一系列洗滌步驟，并直接向lpi^tmflowcell注射胰蛋白酶5μg/ml(princetonseparations，adelphi，nj)。37℃下將芯片孵育過(guò)夜，并將胰蛋白酶多肽從lpi^tm芯片上洗脫，然后使用sep-pak盒(waterscorporation，milford，ma)脫鹽。

ltq線性離子阱lc/ms/ms分析：將各胰蛋白酶消化樣品在0.2mm×150mm3μmmagicc18柱(michrombioresources，inc.，auburn，ca)上分離，其直接連接于沿軸式去溶劑化真空輔助納米毛細(xì)管級(jí)電噴霧電離(advance)源(michrombioresources，inc.)。使用180分鐘梯度(緩沖液a：水，0.1％甲酸；緩沖液b：乙腈，0.1％甲酸)。advance源在非常高的流速3μl/min下操作是可以達(dá)到相當(dāng)于傳統(tǒng)的納米esi的靈敏度。在ltq線性離子阱質(zhì)譜儀(thermofisherscientific，sanjose，ca)上對(duì)洗脫的多肽進(jìn)行分析，其在各全掃描質(zhì)譜后采用10數(shù)據(jù)依賴的ms/ms掃描。對(duì)各生物樣品收集7個(gè)分析重復(fù)數(shù)據(jù)集。

生物信息學(xué)：對(duì)各細(xì)胞系收集的7個(gè)分析重復(fù)數(shù)據(jù)集對(duì)應(yīng)的7個(gè)raw文件進(jìn)行搜索作為針對(duì)ipi人數(shù)據(jù)庫(kù)的單獨(dú)搜索，其中使用sorcerersolo^tm工作站(sage-nresearch，sanjose，ca)實(shí)施的sequest算法。指定1.2amu的肽質(zhì)量允差、甲硫氨酸氧化作為差分修正、以及脲甲基化作為靜態(tài)修正。使用trans-proteomicpipeline(tpp)實(shí)施的支架軟件來(lái)分類和解析膜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。對(duì)于那些鑒定為肽概率95％、蛋白概率95％且為唯一肽的蛋白考慮進(jìn)行分析。使用自身發(fā)展的自定義perl腳本對(duì)于膜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較。

結(jié)果：如表4所示羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞表達(dá)不同的血管生成和心原性標(biāo)記。

表4：羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞表達(dá)的心原性或血管生成標(biāo)記。

6.2.5使用分泌蛋白質(zhì)組譜評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

蛋白陣列：將第6代的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞按照與生長(zhǎng)培養(yǎng)基中相等的數(shù)量接種，4天后收集條件化培養(yǎng)基。使用raybiotech血管生成蛋白陣列(norcross，ga)對(duì)于細(xì)胞條件化培養(yǎng)基中的多個(gè)血管生成細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子進(jìn)行同步定性分析。簡(jiǎn)要地，將蛋白陣列與2ml1×封閉緩沖液(raybiotech)一起在室溫下孵育30分鐘(min)以封閉膜。然后，傾倒出封閉緩沖液并將膜與1ml的樣品(用各自的細(xì)胞條件化生長(zhǎng)培養(yǎng)基4天)在室溫下一起孵育1-2小時(shí)。然后，傾出樣品并將膜用2ml1×洗滌緩沖液i(raybiotech)在室溫下振蕩洗滌3×5min。然后，將膜用2ml1×洗滌緩沖液ii(raybiotech)在室溫下振蕩洗滌2×5min。其后，將1ml稀釋的生物素-偶聯(lián)抗體(raybiotech)加至各膜，在室溫下孵育1-2小時(shí)，并用如上所述的洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌。然后將稀釋的hrp-偶聯(lián)的鏈霉親和素(2ml)加至各膜，并將膜在室溫下孵育2小時(shí)。最終，再次洗滌膜，按照說(shuō)明書(shū)用ecl^tm檢測(cè)試劑盒(amersham)進(jìn)行孵育，對(duì)結(jié)果用kodakgellogic2200成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。amdac分泌的各種血管生成蛋白顯示于圖3。

elisa：使用商業(yè)可獲得的r&dsystems(minneapolis，mn)試劑盒對(duì)細(xì)胞條件化培養(yǎng)基中的單一血管生成細(xì)胞因子/生長(zhǎng)因子進(jìn)行了定量分析。簡(jiǎn)要地，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行elisa分析，條件化培養(yǎng)基中的每種血管生成生長(zhǎng)因子的數(shù)量被歸一化為1×10⁶細(xì)胞。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞(n＝6)表現(xiàn)出大約4500pgvegf每百萬(wàn)細(xì)胞和大約17,200pgil-8每百萬(wàn)細(xì)胞。

表5：血管生成標(biāo)記的elisa結(jié)果

在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)確認(rèn)amdac還分泌促血管新生蛋白因子-1、促血管新生蛋白因子-2、pecam-1(cd31；血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子)、層粘連蛋白和纖維粘連蛋白。

6.2.6amdac的微rna表達(dá)證實(shí)了血管生成活性

本實(shí)施例顯示了amdac比骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)更高水平的某些微-rna(mirna)和更低水平的某些其它mirna，這些表達(dá)分別與血管生成功能相關(guān)。

已經(jīng)知道促-血管生成mir-296通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子受體水平來(lái)調(diào)節(jié)血管生成功能。例如，內(nèi)皮細(xì)胞中的mir-296顯著有助于血管生成，其通過(guò)直接靶向肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-調(diào)控酪氨酸激酶基質(zhì)(hgs)mrna，導(dǎo)致hgs水平降低并從而降低hgs-介導(dǎo)的生長(zhǎng)因子受體vegfr2和pdgfrb的降解。參見(jiàn)würdinger等人，cancercell14:382-393(2008)。另外，mir-15b和mir-16已顯示控制vegf的表達(dá)，后者為一種涉及血管生成的促-血管生成因子，且低氧誘導(dǎo)的mir-15b和mir-16的減少導(dǎo)致vegf的增加，vegf為一種促-血管生成細(xì)胞因子。參見(jiàn)kuelbacher等人，trendsinpharmacologicalsciences，29(1):12-15(2007)。

按照描述于上述實(shí)施例1的方法制備amdac。使用mirvana^tmmirna分離試劑盒(ambion，cat#1560)用amdac和bm-msc細(xì)胞(用作比較)進(jìn)行微rna(mirna)的制備。將0.5×10⁶-1.5×10⁶細(xì)胞在變性裂解緩沖液中進(jìn)行破碎。然后，用酸-酚+氯仿抽提樣品，分離高度富集小rna分子的rna。加入100％乙醇使得樣品含25％乙醇。當(dāng)該裂解物/乙醇混合物經(jīng)過(guò)玻璃纖維濾器后，大的rna被固定化，小rna分子被在過(guò)濾物中進(jìn)行收集。過(guò)濾物的乙醇濃度隨后增至55％，且將該混合物經(jīng)過(guò)第二玻璃纖維濾器，其中小rna分子被固定化。對(duì)該rna進(jìn)行洗滌并使用低離子強(qiáng)度溶液進(jìn)行洗脫?；厥盏男na的濃度和純度通過(guò)檢測(cè)其在260和280nm的吸光度進(jìn)行測(cè)定。

發(fā)現(xiàn)amdac能夠表達(dá)下述血管生成mirna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92、mir-20a、mir-20b、(血管生成mirna簇17-92的成員)、mir-296、mir-221、mir-222、mir-15b、mir-16。還發(fā)現(xiàn)amdac比骨髓來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞(bm-msc)表達(dá)更高水平的下述血管生成mirna：mir-17-3p、mir-18a、mir-18b、mir-19b、mir-92(血管生成mirna簇17-92的成員)、mir-296。這些結(jié)果很好地符合觀察到的amdac高水平表達(dá)vegfr2/kdr(參見(jiàn)上述)。相反，發(fā)現(xiàn)amdac比bm-msc表達(dá)更低水平的下述血管生成mirna：mir-20a、mir-20b、(血管生成mirna簇17-92的成員)、mir-221、mir-222、mir-15b、mir-16。mir-15b和mir-16的減少表達(dá)符合觀察到的amdac中更高水平的vegf表達(dá)。

6.3實(shí)施例3：羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的功能表征

本實(shí)施例顯示amdac與血管生成和分化能力相關(guān)的不同特性。

6.3.1huvec管腔形成評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)在第3代或更少的代時(shí)被次培養(yǎng)于egm-2培養(yǎng)基(cambrex，eastrutherford，nj)中3天，并在匯合度為大約70％-80％時(shí)進(jìn)行收獲。將huvec用基本培養(yǎng)基/抗生素(dmem/f12(gibco))洗滌一次并以期望的濃度重懸于相同培養(yǎng)基。在huvec制備的1小時(shí)之內(nèi)使用。將人胎盤膠原蛋白(hpc)用10mmhcl(ph2.25)配成濃度為1.5mg/ml，用緩沖液“中和”至ph7.2并置于冰上直至使用。將hpc與huvec懸液混合至細(xì)胞終濃度為4000細(xì)胞/μl。得到的huvec/hpc懸液馬上移液至96-孔板中，3μl每孔(板周圍需要預(yù)先填充無(wú)菌pbs以防止蒸發(fā)，每個(gè)條件下n＝5)。將huvec液滴在不添加培養(yǎng)基的情況下孵育于37℃和5％co275-90分鐘以允許膠原蛋白聚合。在“干燥”孵育完成后，輕柔地在各孔中填充200μl條件化的amdac培養(yǎng)基(n＝5細(xì)胞系)或?qū)φ张囵B(yǎng)基(例如，dmem/f12作為陰性對(duì)照，egm-2作為陽(yáng)性對(duì)照)并在37℃和5％co2下孵育20小時(shí)。通過(guò)將第6代羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育4–6小時(shí)制備條件化培養(yǎng)基；在貼壁和擴(kuò)散后，將培養(yǎng)基替換為dmem/f12培養(yǎng)24小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)基從孔中移除，而不干擾huvec液滴，并將孔用pbs洗滌一次。然后使huvec液滴固定10秒并使用diff-quik細(xì)胞染色試劑盒染色1分鐘，然后用無(wú)菌水洗滌3次。風(fēng)干染色的液滴，使用zeissstereodiscoveryv8顯微鏡獲取各孔的圖像。然后使用計(jì)算機(jī)軟件包“imagej”和/或matlab分析圖像。將圖像從彩色轉(zhuǎn)為8-bit灰度圖像，并設(shè)置臨界值轉(zhuǎn)化為黑白圖像。然后使用粒子分析特征來(lái)對(duì)圖像進(jìn)行分析，后者提供像素密度數(shù)據(jù)，包括計(jì)數(shù)(個(gè)體粒子的數(shù)量)、總面積、(個(gè)體粒子的)平均大小和面積分?jǐn)?shù)，其等價(jià)于分析中的內(nèi)皮管腔形成數(shù)。

條件化培養(yǎng)基對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞具有血管生成效果，如誘導(dǎo)增殖管腔的形成所示(參見(jiàn)圖4)。

6.3.2huvec遷移分析

本實(shí)驗(yàn)顯示羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力。huvec在纖維粘連蛋白(fn)包被的12-孔板上生長(zhǎng)至全滿，并用1ml塑料移液管頭“劃傷”單層以在全孔內(nèi)形成細(xì)胞系。通過(guò)用5種羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞系生長(zhǎng)3天獲得的無(wú)血清的條件化培養(yǎng)基(ebm2；cambrex)孵育“受傷的”細(xì)胞來(lái)檢測(cè)huvec遷移。不含細(xì)胞的ebm2培養(yǎng)基用作對(duì)照。15小時(shí)后，使用反轉(zhuǎn)的顯微鏡記錄細(xì)胞記錄(n＝3)遷移至非細(xì)胞區(qū)的細(xì)胞。然后使用計(jì)算機(jī)軟件包“imagej”和/或matlab分析圖像。將圖像從彩色轉(zhuǎn)為8-bit灰度圖像，并設(shè)置臨界值轉(zhuǎn)化為黑白圖像。然后使用粒子分析特征來(lái)對(duì)圖像進(jìn)行分析，后者提供像素密度數(shù)據(jù)，包括計(jì)數(shù)(個(gè)體粒子的數(shù)量)、總面積、(個(gè)體粒子的)平均大小和面積分?jǐn)?shù)，其等價(jià)于分析中的內(nèi)皮遷移數(shù)。將細(xì)胞遷移的程度相對(duì)于初始記錄的受傷細(xì)胞系的大小進(jìn)行計(jì)分，并將結(jié)果歸一化為1×10⁶細(xì)胞。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞具有血管生成效果，如誘導(dǎo)細(xì)胞遷移所示(圖5)。

在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，huvec在fn-包被的96-孔板上生長(zhǎng)至半滿，通過(guò)用來(lái)自5種各自的羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞系(ebm-2培養(yǎng)基，3天)的無(wú)血清的條件化培養(yǎng)基孵育細(xì)胞檢測(cè)誘導(dǎo)增殖。ebm-2培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照，egm-2用作陽(yáng)性對(duì)照。48小時(shí)后，通過(guò)使用promegacelltiterazonesolutioncellproliferationassay(promega，madison，wi)檢測(cè)dna含量對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行評(píng)分。誤差線表示分析平行重復(fù)(n＝3)的標(biāo)準(zhǔn)誤差，結(jié)果被歸一化為1×10⁶細(xì)胞。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分泌的營(yíng)養(yǎng)因子導(dǎo)致dna濃度的增加，其表示了huvec的增殖。參見(jiàn)圖6，其中“cm”為條件化培養(yǎng)基。

6.3.3使用乙?；兔苤鞍?acldl)的攝取來(lái)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)其吸收熒光acldl的能力進(jìn)行鑒定。如果ldl載脂蛋白的賴氨酸殘基被乙?；敲磍dl復(fù)合物不再結(jié)合ldl受體，相反其可以被內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以高度細(xì)胞特異性的方式攝取。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或者生長(zhǎng)于不添加vegf的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或者生長(zhǎng)于添加vegf的egm2-mv(cambrex)，以評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的一般血管生成能力，以及vegf對(duì)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分化潛力的影響。細(xì)胞培養(yǎng)于12-孔板上各自的培養(yǎng)基中4-7天，直至達(dá)到70-80％匯合度，然后與10μg/ml乙?；痩dl(invitrogen)一起孵育過(guò)夜。然后使用鈣黃綠素am(invitrogen)復(fù)染色細(xì)胞并使用熒光顯微鏡評(píng)價(jià)其乙?；痩dl吸收。huvec作為乙酰化ldl吸收的對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)于egm2-mv并進(jìn)行如上所述的分析。羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在正常生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)出最小的乙酰化ldl吸收，但會(huì)在受到vegf刺激的情況下誘導(dǎo)/分化至吸收能力增強(qiáng)。參見(jiàn)圖7。

6.3.4使用管腔形成來(lái)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞或者生長(zhǎng)于不添加vegf的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，或者生長(zhǎng)于添加vegf的egm2-mv，以評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的一般血管生成能力，以及vegf對(duì)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞分化潛力的影響。huvec作為管腔形成的對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)于egm2-mv。細(xì)胞培養(yǎng)于各自培養(yǎng)基4-7天，直至達(dá)到70-80％匯合度。將冷的(4℃)matrigel^tm溶液(50μl；bdbiosciences)分散至12-孔板的孔中，將板在37℃孵育60min允許溶液凝膠化。對(duì)amdac和huvec細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶化，重懸于適當(dāng)培養(yǎng)基中(含有或不含vegf)，并將100μl的稀釋的細(xì)胞(1-3x10⁴細(xì)胞)加至各個(gè)含有matrigel^tm的孔中。在聚合的matrigel^tm上的細(xì)胞，在0.5-100ngvegf存在或不存在下，被置于37℃5％co2培養(yǎng)箱4-24小時(shí)。在孵育后使用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡評(píng)價(jià)細(xì)胞的管腔形成跡象。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在缺少vegf的條件下表現(xiàn)出最小的管腔形成，但會(huì)在受到vegf刺激的情況下誘導(dǎo)/分化至形成管樣結(jié)構(gòu)。參見(jiàn)圖8。

6.3.5使用缺氧響應(yīng)評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

為評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞和/或內(nèi)皮祖細(xì)胞的血管生成功能，可以針對(duì)在缺氧和常氧條件下細(xì)胞分泌血管生成生長(zhǎng)因子的能力進(jìn)行評(píng)估。在缺氧條件下培養(yǎng)通常由內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生增加的血管生成生長(zhǎng)因子分泌，其可以在條件化培養(yǎng)基中進(jìn)行檢測(cè)。將羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞按照與其標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中相等的數(shù)量接種并生長(zhǎng)至大約70-80％匯合度。然后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)向無(wú)血清的培養(yǎng)基(ebm-2)并在常氧(21％o2)或缺氧(1％o2)條件下孵育48小時(shí)。收集條件化培養(yǎng)基并使用商業(yè)可獲得的r&dsystems的elisa試劑盒對(duì)血管生成生長(zhǎng)因子的分泌進(jìn)行分析。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行elisa分析，在條件化培養(yǎng)基中各血管生成生長(zhǎng)因子(vegf和il-8)的數(shù)量被歸一化為1×10⁶細(xì)胞。

羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在低氧條件表現(xiàn)出增加的血管生成生長(zhǎng)因子分泌。參見(jiàn)圖9。

在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，將amdac按照與其標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中相等的數(shù)量接種并生長(zhǎng)至大約70-80％匯合度。然后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)向無(wú)血清的培養(yǎng)基(ebm-2)并在常氧(21％o2)或低氧(1％o2)條件下孵育48小時(shí)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析其細(xì)胞標(biāo)記cd202b(也稱為tie2、tek或促血管新生蛋白因子-1受體)，一種涉及血管發(fā)育和血管生成的受體。收集條件化培養(yǎng)基并使用商業(yè)可獲得的r&dsystems的elisa試劑盒對(duì)血管生成生長(zhǎng)因子的分泌進(jìn)行分析。按照如上所述進(jìn)行流式細(xì)胞分析，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行elisa分析。在條件化培養(yǎng)基中各血管生成生長(zhǎng)因子(vegf和il-8)的數(shù)量被歸一化為1×10⁶細(xì)胞。amdac在低氧條件下比常氧條件下的表現(xiàn)出增加的cd202b表達(dá)。參見(jiàn)圖10。

6.3.6使用心原性分化評(píng)價(jià)羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的血管生成能力

為誘導(dǎo)祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞系分化，在幾個(gè)階段進(jìn)行了懸滴培養(yǎng)(hd，停止細(xì)胞增殖并開(kāi)始分化過(guò)程)并隨后對(duì)于具有特定因子的限制生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理的步驟組合。懸滴培養(yǎng)后，使用活化素a、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf，也稱為fgf2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf、也稱為vegfa)和dickkopf同源物1(dkk1)的組合誘導(dǎo)細(xì)胞16天。簡(jiǎn)要地，羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至大約70％匯合度。然后將細(xì)胞胰蛋白酶化，并用之前描述的緩沖液進(jìn)行洗滌。將20μl含有700細(xì)胞的液滴懸浮于相關(guān)培養(yǎng)基并使用多通道移液器置于100mmpetri培養(yǎng)皿的蓋子內(nèi)側(cè)。小心反轉(zhuǎn)蓋子，將其置于培養(yǎng)皿頂部，其中含有25ml的無(wú)菌pbs以防止液滴干燥。懸滴培養(yǎng)物在37℃5％co2的培養(yǎng)箱中孵育48h。然后，聚集的細(xì)胞體被重新接種至包被有0.1％明膠的含有細(xì)胞系特異性的分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)板，用于進(jìn)一步誘導(dǎo)。

刺激步驟如下：階段1，4天bmp4(0.5ng/ml)；階段2，5天bmp4(10ng/ml)、bfgf(5ng/ml)、活化素a(3ng/ml)；階段3，3天vegf(10ng/ml)、dkk1(150ng/ml)；階段4，4天vegf(10ng/ml)、dkk1(150ng/ml)、bfgf(5g/ml)(+/-5-10nm5-氮雜-胞苷)。然后，制備處理后的細(xì)胞的總rna，如前述進(jìn)行qrt-pcr分析心原性標(biāo)記。

結(jié)果顯示羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞可被誘導(dǎo)/分化為表達(dá)不同成心肌細(xì)胞標(biāo)記。參見(jiàn)圖11。

6.3.7amdac-條件化培養(yǎng)基的huvec響應(yīng)

amdac在含有60％dmem-lg(gibco)；40％mcbd-201(sigma)；2％fbs(hyclonelabs)，1×胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補(bǔ)充劑(its)；10ng/ml亞油酸-牛血清白蛋白(la-bsa)；1n-地塞米松(sigma)；100μm抗壞血酸2-磷酸鹽(sigma)；10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(r&d系統(tǒng))；以及10ng/ml血小板衍生的生長(zhǎng)因子(pdgf-bb)(r&d系統(tǒng))的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)，然后在無(wú)血清培養(yǎng)基中另外培養(yǎng)48小時(shí)。收集來(lái)自amdac培養(yǎng)物的條件化培養(yǎng)基并用于刺激血清饑餓的huvec5、15和30分鐘。然后裂解huvec并用bd^tmcba(cytometricbeadassay)cellsignalingflex試劑盒(bdbiosciences)染色磷蛋白，后者已知在血管生成途徑信號(hào)中起作用。amdac被發(fā)現(xiàn)為akt-1(其抑制凋亡過(guò)程)、akt-2(其為胰島素信號(hào)途徑的重要信號(hào)蛋白)、和huvec的erk1/2細(xì)胞增殖途徑的強(qiáng)激活劑。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示amdac的血管生成能力。

6.4實(shí)施例4：amdac誘導(dǎo)血管生成

本實(shí)施例顯示amdac在使用雞絨毛膜尿囊膜(cam)的體內(nèi)分析中的促血管生成。

進(jìn)行了兩組單獨(dú)的cam分析。在第一組cam分析中，評(píng)價(jià)了來(lái)自不同amdac制備的完整的細(xì)胞沉淀。在第二組cam分析中，評(píng)價(jià)了來(lái)自不同amdac制備的上清液。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)被用作陽(yáng)性對(duì)照，mda-mb-231人乳腺癌細(xì)胞作為參比(陰性對(duì)照)。本研究的終點(diǎn)是測(cè)定全部處理組和對(duì)照組的血管密度。

6.4.1使用細(xì)胞進(jìn)行cam分析

使用了按照上述方法制備和低溫貯藏的3批amdac細(xì)胞制備物，在此稱為lot1、lot2和lot3。將amdac解凍用于施用并測(cè)定了用于cam施用的細(xì)胞的數(shù)量。

研究設(shè)計(jì)：本研究包括7個(gè)組，每組10個(gè)胚胎。本研究的設(shè)計(jì)描述于表6。

表6：研究組，雞絨毛膜尿囊膜血管生成分析。

cam分析方法：在37℃的標(biāo)準(zhǔn)雞蛋培養(yǎng)箱中將新鮮受精卵孵育3天。在第3天，在無(wú)菌條件下將蛋打破，將胚胎置于20個(gè)100mm塑料板中，在胚胎培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，底架上儲(chǔ)水。使用一個(gè)小泵持續(xù)將空氣通入儲(chǔ)存水中，從而培養(yǎng)箱濕度維持恒定。在第6天，在各cam放置一個(gè)無(wú)菌的“o”型硅膠環(huán)，然后在無(wú)菌狀態(tài)下將amdac以密度為7.69×10⁵細(xì)胞/40μl培養(yǎng)基/matrigel^tm混合物(1:1)轉(zhuǎn)移至各“o”型環(huán)。表2a和2b表示所使用的細(xì)胞數(shù)量和添加至各細(xì)胞制備物用于施用的培養(yǎng)基數(shù)量。載體對(duì)照胚胎中加入40μl的載體(pbs/matrigel^tm，1:1)，陽(yáng)性對(duì)照中加入在40μl的dmem培養(yǎng)基/matrigel^tm混合物(1:1)中的100ng/mlbfgf，以及培養(yǎng)基對(duì)照中只加入40μl的dmem培養(yǎng)基。在各施用完成后將胚胎返回各培養(yǎng)箱。在第8天，將胚胎從培養(yǎng)箱中移出并置于室溫下，使用放大100×的圖像捕捉系統(tǒng)測(cè)定各“o”型環(huán)的血管密度。

通過(guò)使用正實(shí)數(shù)0-5、或指數(shù)血管1-32的評(píng)分系統(tǒng)檢測(cè)生成血管的密度，顯示cam處理位置處的血管數(shù)量。較高的分值表示較高的血管密度，0表示沒(méi)有血管生成。對(duì)于各施用位置的抑制百分比使用該位置記錄的分值/每個(gè)個(gè)體實(shí)驗(yàn)中對(duì)照樣品獲得的平均分值進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于給定化合物的各施用的抑制百分比通過(guò)合并來(lái)自8-10胚胎施用的所有結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

表7：為了歸一化最終施用的細(xì)胞懸液而添加至各細(xì)胞制備物的培養(yǎng)基的量

所有使用細(xì)胞處于第6代。

結(jié)果

血管密度評(píng)分值的結(jié)果見(jiàn)圖12。該結(jié)果清楚地顯示分別用干細(xì)胞懸液、或100ng/ml的bfgf、或mdamb231乳腺癌細(xì)胞懸液處理的雞絨毛膜尿囊膜的血管密度分值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著高于載體對(duì)照組的cam(p<0.001，t檢驗(yàn))。用于培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)血管密度沒(méi)有任何效果。此外，amdac制備物誘導(dǎo)的血管密度顯示了一些變化，但是這些變化在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。這說(shuō)明5種干細(xì)胞制備物各自的誘導(dǎo)能力基本相同。

6.4.2使用amdac細(xì)胞上清液進(jìn)行cam分析

來(lái)自mda-mb-231細(xì)胞和各描述于上述amdac的cam分析的不同干細(xì)胞制備物的上清液樣品被用于第二次cam分析。如同amdac的cam分析，bfgf和mda-mb-231細(xì)胞被用作陽(yáng)性對(duì)照。

研究設(shè)計(jì)：本研究包括7個(gè)組，每組10個(gè)胚胎。本研究的設(shè)計(jì)描述于表8。

表8：研究設(shè)計(jì)–使用細(xì)胞上清液進(jìn)行cam分析

使用的amdac細(xì)胞是第6代。

cam分析方法：分析方法與如上所述amdac的cam分析相同。唯一的區(qū)別是來(lái)自各干細(xì)胞制備物或來(lái)自mda-mb-231細(xì)胞的上清液被用作測(cè)試材料。對(duì)于劑量，各上清液與matrigel^tm(以1:1體積比)進(jìn)行混合并對(duì)各胚胎施用40μl的混合物。

結(jié)果

血管密度分值(參見(jiàn)圖13)顯示各干細(xì)胞制備物上清液的血管形成誘導(dǎo)各不相同。來(lái)自三個(gè)批次的amdac上清液樣品表現(xiàn)出對(duì)于血管誘導(dǎo)的顯著影響，分別為p<0.01、p<0.001和p<0.02(t檢驗(yàn))。如同預(yù)料的那樣，陽(yáng)性對(duì)照bfgf同樣顯示出對(duì)于血管形成的強(qiáng)誘導(dǎo)，如上述cam分析編號(hào)1(p<0.001，t檢驗(yàn))所示。然而，mda-mb-231人乳腺癌細(xì)胞上清液相對(duì)于載體對(duì)照組而言沒(méi)有顯示出對(duì)于血管形成的顯著誘導(dǎo)。如前所示，培養(yǎng)基本身沒(méi)有任何效果。

6.5實(shí)施例5：amdac表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)效果

本實(shí)施例使用氧氣-葡萄糖剝奪(ogd)損傷(insult)分析，顯示amdac在低氧和低葡萄糖條件下具有神經(jīng)保護(hù)效果，并降低活性氧。這些結(jié)果顯示amdac對(duì)于治療諸如中風(fēng)或周圍血管疾病的缺血性病癥是有效的，并能夠保護(hù)缺血性癥狀導(dǎo)致的再灌注損傷。

將人神經(jīng)元(sciencell，目錄號(hào)1520)根據(jù)生產(chǎn)商的建議進(jìn)行培養(yǎng)。簡(jiǎn)要地，培養(yǎng)容器在37℃下無(wú)菌蒸餾水中用聚-l-賴氨酸(2μg/ml)進(jìn)行包被1小時(shí)。將容器用雙蒸水洗滌3次。將神經(jīng)元培養(yǎng)基(sciencell)加至容器中并在培養(yǎng)箱中平衡至37℃。解凍神經(jīng)元，并直接加至容器中，不必離心。在隨后的培養(yǎng)中，初始培養(yǎng)后的當(dāng)天更換培養(yǎng)基，之后每隔一天更換。神經(jīng)元一般在第4天可以進(jìn)行損傷分析。

通過(guò)首先水浴加熱培養(yǎng)基，在一定程度上降低液體培養(yǎng)基中的氧氣溶解度，來(lái)配制ogd培養(yǎng)基(dulbecco的修飾的eagle培養(yǎng)基-無(wú)葡萄糖)。使用0.5μm漫射石在培養(yǎng)基中通入100％氮?dú)?0分鐘以去除溶解氧。加入hepes緩沖液至終濃度為1mm。噴射結(jié)束時(shí)將培養(yǎng)基直接加至神經(jīng)元。取培養(yǎng)基的小樣品使用下沉型氧氣傳感器確認(rèn)氧氣水平。氧氣水平一般被降至0.9％至約5.0％氧氣。

通過(guò)將箱子在充氣前置于37℃培養(yǎng)箱中至少4小時(shí)(優(yōu)選過(guò)夜)制備缺氧箱。去除培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基并替換為脫氣的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)容器置于缺氧箱中。通過(guò)系統(tǒng)在缺氧箱中以20-25lpm的速率通入95％n2/5％co2氣體至少5分鐘。將系統(tǒng)在培養(yǎng)箱中37℃下孵育4小時(shí)，且1小時(shí)后再次對(duì)箱子進(jìn)行脫氣。

在該損傷流程的最后，對(duì)ogd培養(yǎng)基進(jìn)行吸氣并將溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基加至神經(jīng)元。24-28小時(shí)后，將amdac和神經(jīng)元以相等的100,000細(xì)胞每孔的數(shù)量接種至6-孔板，其懸浮于神經(jīng)元培養(yǎng)基，后者被加至神經(jīng)元并共培養(yǎng)6天。

對(duì)于各條件下的6孔板的隨機(jī)區(qū)域拍攝顯微照片。對(duì)具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，并記錄神經(jīng)突長(zhǎng)度。神經(jīng)突的平均長(zhǎng)度與神經(jīng)元健康成正相關(guān)，其在神經(jīng)元和amdac的共培養(yǎng)物中更長(zhǎng)，表明amdac保護(hù)細(xì)胞不受損傷。

活性氧分析

經(jīng)測(cè)定，amdac在缺氧條件下表達(dá)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和血紅素加氧酶基因。在使用過(guò)氧化氫作為活性氧發(fā)生器的分析中測(cè)定了amdac吸收活性氧和保護(hù)細(xì)胞不受該種條件影響的能力。

分析描述：將目標(biāo)細(xì)胞(星形細(xì)胞，sciencellresearchlaboratories)接種到96-孔黑孔板，該板使用6000/cm²聚-l-賴氨酸進(jìn)行預(yù)包被。將星形細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中37℃和5％二氧化碳下貼壁過(guò)夜。第二天，去除培養(yǎng)基并將細(xì)胞與細(xì)胞滲透性染料dcfh-da(二氯熒光素二脂)一起孵育，后者為熒光探針。用dulbecco磷酸緩沖液鹽或hank緩沖鹽溶液洗滌去除過(guò)量染料。然后通過(guò)添加1000μm過(guò)氧化氫30-60分鐘損傷細(xì)胞。然后去除含過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基并替換為無(wú)血清的、無(wú)葡萄糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。amdac(lot1或lot2的細(xì)胞)，或bm-msc，被加至6000/cm²，并將細(xì)胞再培養(yǎng)24小時(shí)。然后用標(biāo)準(zhǔn)熒光讀板儀在480ex和530em下讀取細(xì)胞。培養(yǎng)基的活性氧含量與細(xì)胞溶質(zhì)中的dcfh-da水平成正比?；钚匝鹾客ㄟ^(guò)與預(yù)測(cè)定的dcf標(biāo)準(zhǔn)曲線比較進(jìn)行測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)中n＝24。

為了進(jìn)行分析，在使用前制備1×dcfh-da，其中將20×dcfh-da儲(chǔ)存液在不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋至1×，并攪拌均勻。過(guò)氧化氫(h202)稀釋液根據(jù)需要在dmem或dpbs中進(jìn)行制備。如下制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：通過(guò)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋1mm標(biāo)準(zhǔn)dcf，按照濃度范圍0μm-10μm的1:10進(jìn)行系列稀釋，轉(zhuǎn)移100μl的標(biāo)準(zhǔn)dcf至適于熒光檢測(cè)的96孔板，并添加100μl的細(xì)胞裂解緩沖液。在480ex和530em下讀取熒光。

結(jié)果：所用的兩個(gè)批次amdac均顯著降低了星形細(xì)胞共培養(yǎng)中的活性氧濃度。參見(jiàn)圖14a和14b。作為對(duì)比，bm-msc沒(méi)能顯著降低星形細(xì)胞共培養(yǎng)中的活性氧濃度。

6.6使用羊膜來(lái)源的貼壁細(xì)胞的治療方法

6.6.1治療心肌梗塞

50歲中期的一名成年男性表現(xiàn)出超過(guò)20分鐘的持續(xù)胸痛并輻射至左臂，氣短、惡心、心悸、出汗等。根據(jù)心電圖結(jié)果和血中肌酸激酶濃度的升降，鑒別診斷為(透壁性)心臟前壁心肌梗塞。在使用硝化甘油和溶栓素使個(gè)體穩(wěn)定后，對(duì)該個(gè)體局部麻醉心臟注射直接施用0.9％鹽水中的1×10⁸至5×10⁸的amdac至病損區(qū)域。在接下來(lái)的72小時(shí)對(duì)該個(gè)體按照急診基礎(chǔ)進(jìn)行監(jiān)護(hù)。在治療后接下來(lái)的3個(gè)月內(nèi)進(jìn)一步通過(guò)心電圖和/或染料可視化技術(shù)監(jiān)護(hù)個(gè)體，評(píng)價(jià)梗塞區(qū)域的血管再生程度。如果心電圖效果比施用amdac之前明顯更加接近正常，或如果梗塞區(qū)域可視化地明顯發(fā)生血管再生，則確認(rèn)治療效果。

6.6.2治療心肌病

個(gè)體表現(xiàn)出氣短、腿和踝部腫脹和不規(guī)則心跳。排除其它原因，并根據(jù)心電圖確認(rèn)，診斷為心肌病。超聲圖確認(rèn)該個(gè)體患有充血性心肌病。對(duì)該個(gè)體使用局部麻醉心臟注射直接施用0.9％鹽水中的1×10⁸至5×10⁸的amdac至心動(dòng)脈。在接下來(lái)的3個(gè)月內(nèi)監(jiān)護(hù)個(gè)體的超聲圖變化，是否顯示血流更加正常，且氣短的感覺(jué)有所改善以及腿和踝部腫脹減少。如果在監(jiān)護(hù)期間個(gè)體的任何這些體征表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

6.6.3治療周圍血管疾病

個(gè)體表現(xiàn)出足部寒冷發(fā)麻并在懸空時(shí)發(fā)紅，以及腿部疼痛、無(wú)力和疲勞。在排除了糖尿病后，診斷為周圍動(dòng)脈疾病。對(duì)該個(gè)體靜脈內(nèi)施用450ml0.9％鹽水中的1×10⁹至5×10⁹的amdac，并在接下來(lái)的3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行兩周一次監(jiān)護(hù)。如果在監(jiān)護(hù)期間任何上述癥狀表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

6.6.4治療周圍血管疾病

個(gè)體表現(xiàn)出足部寒冷發(fā)麻并在懸空時(shí)發(fā)紅，以及腿部疼痛、無(wú)力和疲勞。在排除了糖尿病后，診斷為周圍動(dòng)脈疾病。對(duì)該個(gè)體靜脈內(nèi)施用5ml0.9％鹽水中的1×10⁸至5×10⁸的amdac，和/或腳趾間局部的靜脈內(nèi)或動(dòng)脈內(nèi)施用相當(dāng)?shù)牧浚⒃诮酉聛?lái)的3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行兩周一次監(jiān)護(hù)。如果在監(jiān)護(hù)期間任何上述癥狀表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

6.6.5組合治療周圍血管疾病

個(gè)體表現(xiàn)出足部寒冷發(fā)麻并在懸空時(shí)發(fā)紅，以及腿部疼痛、無(wú)力和疲勞。在排除了糖尿病后，診斷為周圍動(dòng)脈疾病。對(duì)該個(gè)體靜脈內(nèi)施用450ml0.9％鹽水中的1×10⁹至5×10⁹的amdac，并在接下來(lái)的3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行兩周一次監(jiān)護(hù)。還對(duì)個(gè)體處方西洛他唑100mg每天兩次。如果在監(jiān)護(hù)期間任何上述癥狀表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

6.6.6組合治療周圍血管疾病

個(gè)體表現(xiàn)出足部寒冷發(fā)麻并在懸空時(shí)發(fā)紅，以及右腿疼痛、無(wú)力和疲勞。在排除了糖尿病后，診斷為周圍動(dòng)脈疾病。對(duì)個(gè)體實(shí)施血管成形術(shù)并在大腿動(dòng)脈內(nèi)手術(shù)植入支架。然后對(duì)該個(gè)體靜脈內(nèi)施用450ml0.9％鹽水中的1×10⁹至5×10⁹的amdac，并在接下來(lái)的3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行兩周一次監(jiān)護(hù)。如果在監(jiān)護(hù)期間任何上述癥狀表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

6.6.7使用amdac治療中風(fēng)

一名52歲的男性表現(xiàn)出左側(cè)身體偏癱和部分失語(yǔ)癥。診斷為缺血性中風(fēng)。在使用磁共振成像確定缺血區(qū)域后，對(duì)個(gè)體準(zhǔn)備手術(shù)，在受損側(cè)顱骨開(kāi)口。開(kāi)口后，1-2ml0.9％鹽水溶液中的5×10⁷至1×10⁸amdac被施用至缺血性區(qū)域。在接下來(lái)的7-14天對(duì)個(gè)體進(jìn)行監(jiān)護(hù)，觀察中風(fēng)，特別是偏癱或失語(yǔ)癥等任何癥狀是否有改善的跡象。如果在監(jiān)護(hù)期間任何上述癥狀表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

6.6.8使用amdac治療中風(fēng)

一名52歲的男性表現(xiàn)出左側(cè)身體偏癱和部分失語(yǔ)癥。診斷為缺血性中風(fēng)。在使用磁共振成像確定缺血區(qū)域后，對(duì)個(gè)體準(zhǔn)備手術(shù)，在受損側(cè)顱骨開(kāi)口。開(kāi)口后，靜脈內(nèi)施用450ml0.9％鹽水溶液中的1×10⁹至5×10⁹amdac。在接下來(lái)的7-14天對(duì)個(gè)體進(jìn)行監(jiān)護(hù)，觀察中風(fēng)，特別是偏癱或失語(yǔ)癥等任何癥狀是否有改善的跡象。如果在監(jiān)護(hù)期間任何上述癥狀表現(xiàn)出改善，則確認(rèn)治療效果。

等同：

本發(fā)明并不限于在此描述的具體實(shí)施方式的范圍。事實(shí)上，除了這些描述之外，根據(jù)之前的描述和隨后的附圖而對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的各種改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。這些改變同樣落入附加的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

在此引用了各種出版物、專利和專利申請(qǐng)，其公開(kāi)內(nèi)容全文引入作為參考。