本發(fā)明屬于微生物學(xué)檢測方面的質(zhì)量控制領(lǐng)域，特別涉及一種乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乳粉微生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域非常特殊。目前，國內(nèi)外尚未有機(jī)構(gòu)制備乳粉微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品和大規(guī)模生產(chǎn)的先例，仍屬空白領(lǐng)域。目前雖有一些機(jī)構(gòu)制備微生物類的標(biāo)準(zhǔn)樣品，但標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性和穩(wěn)定性幾乎不能滿足要求，運(yùn)輸極為困難；或標(biāo)準(zhǔn)樣品為僅含有目標(biāo)菌的純菌株，與實(shí)際樣品差距較大，不能滿足日常實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制等需要。金黃色葡萄球菌為常見的一種革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界，可以引起人和動物的感染。人類感染金黃色葡萄球菌后，即可引起皮膚的局部化膿性感染，也可引起嚴(yán)重的內(nèi)臟器官感染，甚至敗血癥、中毒性休克等。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素可沾染食物而致食物中毒。如果制備的金黃色葡萄球菌樣品中，目標(biāo)菌易發(fā)生變化(繁殖和死亡等)，就會導(dǎo)致樣品的保存期短，樣品的均勻性和穩(wěn)定性差，影響質(zhì)量控制效果。因此，綜合考慮細(xì)菌的生化特性，選取性質(zhì)相對穩(wěn)定的菌群作為目標(biāo)菌對保證樣品的均勻性和穩(wěn)定性十分重要。金黃色葡萄球菌樣品制備的工藝技術(shù)要求比較高，并且樣品的均勻性和穩(wěn)定性與凍干的菌種、凍干的工藝條件、凍干保護(hù)劑的使用、再水化的介質(zhì)等均有密切的關(guān)系。乳粉中金黃色葡萄球菌指標(biāo)，直接反映著乳粉的衛(wèi)生質(zhì)量與潛在致病風(fēng)險。如果金黃色葡萄球菌數(shù)超過一定限量，就會導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生。因此，制備均勻性與穩(wěn)定性俱佳的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品，可以避免金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)的隨意性和不確定性，有效地保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可信。這對提高實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制水平，保障乳粉安全，甚至于打破國際貿(mào)易壁壘、提高我國乳粉國際競爭力都具有特殊重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)菌的活菌數(shù)目在運(yùn)輸、儲存和測試等過程中總菌落數(shù)都可發(fā)生變化的問題，提供一種乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品，均勻性、穩(wěn)定性符合標(biāo)準(zhǔn)樣品要求，本發(fā)明的另一個目的是提供該樣品的制備方法，工藝簡單，成功率高。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征是：包括目標(biāo)菌和背景菌群，所述目標(biāo)菌為金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，所述背景菌群由弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)、大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)組成。所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)，其中海藻糖的體積分?jǐn)?shù)為12％、脫脂奶粉的體積分?jǐn)?shù)為15％。所述樣品中目標(biāo)菌的目標(biāo)濃度為102～103cfu/ml，背景菌群的目標(biāo)濃度為103cfu/ml。乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征是：包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護(hù)劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)四個步驟，其中樣品凍干過程為：菌株復(fù)蘇傳代—增菌—菌懸液配制—凍干和包裝—儲存，具體過程為：(1)菌株復(fù)蘇傳代將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復(fù)蘇和生長，并對復(fù)蘇的菌株進(jìn)行鑒定；(2)增菌目標(biāo)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期末，背景菌群培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從斜面刮取菌落，加到10ml的凍干保護(hù)劑中制成相應(yīng)單一菌種的菌液；(3)菌懸液配制將上一過程得到的菌液與凍干保護(hù)劑混合，按目標(biāo)菌的目標(biāo)濃度102～103cfu/ml和背景菌群的目標(biāo)濃度103cfu/ml配制菌懸液，分別配制目標(biāo)菌的菌懸液和4個背景菌的菌懸液，背景菌按1:1的體積比例混合形成背景菌群懸液，再將目標(biāo)菌懸液和背景菌群懸液按1：1體積比混合，置于磁力攪拌器上不斷攪拌下分裝到樣品瓶中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實(shí)；(4)凍干和包裝將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機(jī)中，冷凍干燥50～55h，當(dāng)樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進(jìn)行箱內(nèi)加塞，關(guān)閉機(jī)器，樣品瓶中樣品為真空狀態(tài)；(5)儲存將樣品放置在-18℃條件下避光保存，從全部樣品中隨機(jī)挑選樣品發(fā)放給參試實(shí)驗(yàn)室或進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。所述凍干保護(hù)劑為含有海藻糖和脫脂奶粉的無菌水，其中體積分?jǐn)?shù)分別為：海藻糖12％、脫脂奶粉15％。所述樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)按照gb/t15000.3-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》進(jìn)行。本發(fā)明菌種的選擇采用金黃色葡萄球菌作為目標(biāo)菌，以弗氏檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌作為背景菌群，最大程度保證測試樣品的穩(wěn)定性，且不影響金黃色葡萄球菌的檢測。本發(fā)明的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品具有以下優(yōu)勢特性：活的微生物、數(shù)量不發(fā)生變化、生化特征不發(fā)生變異，從滿足特殊運(yùn)輸?shù)臈l件著手，通過特殊工藝的研究、穩(wěn)定性和均勻性的研究等形成一套完善的標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)，適合于乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備。附圖說明圖1為本發(fā)明工藝流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不局限于具體實(shí)施例。實(shí)施例1乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括目標(biāo)菌和背景菌群，所述目標(biāo)菌為金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，所述背景菌群由弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)、大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)組成。所述樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)，其中海藻糖的體積分?jǐn)?shù)為12％、脫脂奶粉的體積分?jǐn)?shù)為15％。所述樣品中目標(biāo)菌的目標(biāo)濃度為102～103cfu/ml，背景菌群的目標(biāo)濃度為103cfu/ml。實(shí)施例2如圖1所示，一種實(shí)施例1中乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，包括樣品添加菌株的選擇、凍干保護(hù)劑的配制、樣品凍干、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)四個步驟，具體步驟如下：1、樣品添加菌株的選擇按照目標(biāo)菌：金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，背景菌群：大腸埃希氏菌(e.coil)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapnenmoniae)、蠟樣芽胞桿菌(bacilluscereus)、弗氏檸檬酸桿菌(citrobacterfreundii)選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株，所有標(biāo)準(zhǔn)菌株均購于政府指定的機(jī)構(gòu)，并附有菌株證書，保證了菌株的溯源性。2、凍干保護(hù)劑的配制樣品以海藻糖、脫脂奶粉和無菌水為基質(zhì)(體積分?jǐn)?shù)：海藻糖12％，脫脂奶粉15％)配制凍干保護(hù)劑。3、樣品凍干(1)菌株復(fù)蘇傳代將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中，在36±1℃下使其復(fù)蘇和生長，并對復(fù)蘇的菌株進(jìn)行鑒定；(2)增菌目標(biāo)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期末，背景菌群培養(yǎng)至穩(wěn)定期，從斜面上刮取菌落，加入到10ml凍干保護(hù)劑中制成相應(yīng)單一菌種的菌液；(3)菌懸液配制將上一過程得到的菌液與凍干保護(hù)劑混合，按目標(biāo)菌的目標(biāo)濃度102～103cfu/ml和背景菌群的目標(biāo)濃度103cfu/ml配制菌懸液。為保證得到的最終樣品中含有以上目標(biāo)濃度的菌株，本實(shí)施例中按照目標(biāo)菌103cfu/ml配制目標(biāo)菌的菌懸液；背景菌按103cfu/ml配制4個背景菌的菌懸液，按1:1的體積比例混合，形成背景菌群懸液，再將目標(biāo)菌懸液和背景菌群懸液按1：1體積比混合，得到混合菌懸液，采用比濁法檢查菌株含量；置于磁力攪拌器上不斷攪拌下取1.0ml分裝到樣品瓶(西林瓶)中，加上瓶塞，但要留有空隙，不要蓋實(shí)；(4)凍干和包裝將裝有混合菌懸液的樣品瓶開蓋放入凍干機(jī)中，冷凍干燥機(jī)參數(shù)按如下設(shè)置：冷凍速度(coolingrate)0.5℃/min早期冷凍點(diǎn)(incipientfreezingpoint)-1℃15min冷凍溫度(coolingtemperature)-40℃共熔點(diǎn)(meltingpointeutectictemperature)-29℃加熱溫度(heatingtemperature)20℃120min啟動冷凍干燥機(jī)，機(jī)器直接進(jìn)入程序化的冷凍干燥過程，整個凍干過程55h。當(dāng)樣品冷凍干燥結(jié)束后，直接進(jìn)行箱內(nèi)加塞；關(guān)閉機(jī)器。剔除塞子不緊的西林瓶，西林瓶中樣品為真空狀態(tài)；(5)儲存將樣品放置在-18℃條件下避光保存，并對保存的樣品進(jìn)行適當(dāng)管理和檢測，從全部樣品中隨機(jī)挑選樣品發(fā)放給實(shí)驗(yàn)室或進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)。4、樣品的均勻性和穩(wěn)定性試驗(yàn)對樣品中目標(biāo)菌的均勻性和穩(wěn)定性檢查是驗(yàn)證樣品制備過程有效性的主要方法。檢查樣品均勻性和穩(wěn)定性按照gb/t15000.3-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則(3)標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》進(jìn)行。所得樣品均勻性和穩(wěn)定性檢測方法及結(jié)果如下：分別隨機(jī)選取12個樣品，采用sn/t1895-2007金黃色葡萄球菌測試方法，在重復(fù)條件測試2×12份樣品的金黃色葡萄球菌。結(jié)果數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計處理，統(tǒng)計步驟及結(jié)果如下：表1方差分析公式上表中，表2樣品均勻性檢測結(jié)果表3樣品均勻性試驗(yàn)方差分析結(jié)果結(jié)論：在95％置信概率下，與其他因素對測試結(jié)果的影響相比，樣品的不均勻性是可接受的。采用兩種類型的穩(wěn)定性試驗(yàn)：一種是在貯存溫度(4℃)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，另一種是在高的溫度(模擬樣品的運(yùn)輸條件)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，選用三個溫度點(diǎn)，分別為20℃、36℃和42℃。定期檢測樣品，針對不同溫度點(diǎn)不同的保存時間測試3個樣本，將2×3份樣品結(jié)果的均值(對數(shù)轉(zhuǎn)化后)用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計處理，f值<f臨界值，則說明標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性符合要求，同時確定在不同溫度條件下符合標(biāo)準(zhǔn)樣品要求的最長保存時間。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表4和表5。表4樣品短期穩(wěn)定性試驗(yàn)方差分析結(jié)果表5樣品短期穩(wěn)定性試驗(yàn)方差分析結(jié)果ss自由度msf值f臨界值置信概率sbb組間0.114502440.0026021.411.640.950.019組內(nèi)0.082971450.001844實(shí)施例3本實(shí)施例中所述的乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法的各步驟均與實(shí)施例2中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標(biāo)菌懸液中目標(biāo)菌的濃度按照2×104cfu/ml配制；凍干過程50h。實(shí)施例4本實(shí)施例中所述的乳粉中金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法的各步驟均與實(shí)施例3中相同，不同的技術(shù)參數(shù)為：菌懸液配制中，目標(biāo)菌懸液中目標(biāo)菌的濃度按照4×103cfu/ml配制；凍干過程52h。當(dāng)前第1頁12