本發(fā)明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii（簡(jiǎn)寫(xiě)為spkp-xiii）在制備電壓門(mén)控鉀通道工具試劑-kv4.1型鉀通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

電壓門(mén)控鉀通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過(guò)程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鉀通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過(guò)程中的關(guān)鍵性作用，電壓門(mén)控鉀通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。電壓門(mén)控鉀通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類(lèi)具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鉀通道的活性成分。它們通過(guò)與鉀通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過(guò)闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鉀通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測(cè)鉀通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門(mén)控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開(kāi)發(fā)成治療人類(lèi)相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii在制備電壓門(mén)控鉀通道工具試劑-kv4.1型鉀通道抑制劑的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii（簡(jiǎn)寫(xiě)為spkp-xiii），其氨基酸序列為：

nh2-glucysargtrpleupheglyglycysglulysaspalaseraspcyscysgluhisleuglycysargargalalysprosertrpcysglytrpaspphethrphe-nh2,

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xiii作為單一有效活性組份用于制備kv4.1型鉀通道抑制劑。

所述的蜘蛛抑鉀肽-xiii的n端第2位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸之間，n端第16位半胱氨酸和第30位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-xiii作為單一有效活性組分用于制備kv4.1型鉀通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成kv4.1型鉀通道工具試劑。

蜘蛛抑鉀肽-xiii在制備kv4.1型鉀通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為5μmol/l。

蜘蛛抑鉀肽-xiii抑制kv4.1型鉀通道的作用呈現(xiàn)濃度依從性。

蜘蛛抑鉀肽-xiii對(duì)kv4.1型鉀通道的抑制呈現(xiàn)時(shí)間依從性，是一種較好的kv4.1型鉀通道工具試劑。

附圖說(shuō)明

圖1是spkp-xiii對(duì)kv4.1鉀通道亞型的影響.

圖2是spkp-xiii作用于kv4.1型鉀通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線。

圖3是spkp-xiii作用于kv4.1型鉀通道的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解和更充分公開(kāi)本發(fā)明，下面將通過(guò)細(xì)胞外給藥途徑，采用非洲爪蟾卵母細(xì)胞模型來(lái)說(shuō)明蜘蛛抑鉀肽-xiii的kv4.1型鉀通道抑制作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1通道質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取

采用promega公司的質(zhì)粒提取試劑盒（wizard?plussvminiprepsdnapurificationsystem）。

溶液的配方如下：

細(xì)胞重懸液細(xì)胞裂解液

tris-hcl(ph7.5)50mmnaoh0.2m

edta10mm1%sds

rnasea100μg/ml

中和液洗脫液

鹽酸胍4.09m乙酸鉀60mm

乙酸鉀0.759mtris-hcl(ph7.5)8.3mm

冰醋酸2.12medta0.04mm

ph為4.2加入95%乙醇,終濃度為60%乙醇

操作步驟：

?收集菌液（4℃，12000r/min，離心1min）

?棄上清，用濾紙吸干殘留在管壁的溶液，加入250μl細(xì)胞重懸液，充分混勻

?加入250μl細(xì)胞裂解液，溫和上下顛倒4次混勻，放置5min

?加入350μl中和液，溫和顛倒4次混勻

?12000r/min離心10min

?吸上清至離心柱中，12000r/min離心1min，棄下清

?往離心柱中加入750μl洗脫液，靜置2min，12000r/min離心

1min，棄下清

?重復(fù)第七步，加入250μl洗脫液，12000r/min離心1min棄下

清

?離心柱風(fēng)干后轉(zhuǎn)移到干凈滅菌的1.5mlep管上，加入50μl去

核酸酶水

?10000r/min離心30s，所得的質(zhì)粒dna可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或-20℃保

存

1.2電壓鉗實(shí)驗(yàn)活性檢測(cè)

取成年雌性非洲爪蟾，放入碎冰內(nèi)麻醉約30min?；蛘咴谧钢?chē)芤海s400ml）中加入0.5g麻醉劑（3-氨基苯酸乙烷基酯），爪蟾1hr后會(huì)處于麻醉狀態(tài)。將處于麻醉狀態(tài)的爪蟾放在冰上，腹部朝上，用鑷子和手術(shù)刀在其腹部劃開(kāi)一長(zhǎng)約1.0～1.5cm的口，拉出子宮瓣，剪取2-3葉放入無(wú)鈣nd96溶液中。將子宮放回腹部，分層縫合傷口后，將爪蟾放在冰上恢復(fù)，待其蘇醒后放回池中。將取出的卵葉用系線鑷初步分散成10－20個(gè)細(xì)胞一團(tuán)。然后轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加入含有膠原酶的無(wú)鈣nd96溶液，膠原酶終濃度為1mg/ml。在25℃,60rpm下酶解大約50min，直至80%以上的細(xì)胞已經(jīng)去除濾泡膜及微血管后則可停止酶解。酶解完畢，用無(wú)鈣的nd96多次洗滌細(xì)胞，洗去殘留的膠原酶。然后，挑選個(gè)體比較大、動(dòng)植物極分明的細(xì)胞轉(zhuǎn)入or2溶液在18℃培養(yǎng)。溶液配方：nd96（inmm）：nacl96、kcl2、cacl2-2h2o1.8、mgcl2-6h2o1、hepes-naoh5。用naoh調(diào)ph至7.5。or2(inmm):nacl82.5、kcl2.5、cacl2-2h2o1、mgcl2-6h2o1、na2hpo4-12h2o1、hepes5。用naoh調(diào)ph至7.5。使用前加入青霉素（10萬(wàn)單位/l）。

電壓鉗實(shí)驗(yàn)：通過(guò)顯微注射系統(tǒng)（wpi，german）將mrna注入挑選好的卵母細(xì)胞，每次注射體積約為20-50nl，從黑色的動(dòng)物極一側(cè)注入。之后，放入18℃低溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4天，每天更換一次新鮮的or2培養(yǎng)液。雙電極桿電壓鉗記錄在室溫（18～22℃）下進(jìn)行。玻璃電極經(jīng)一步拉制而成，灌注3mkcl后電阻為0.5-1.5mω。將細(xì)胞放入細(xì)胞槽中，用or2溶液灌流。然后將兩個(gè)玻璃電極分別插入細(xì)胞。將細(xì)胞鉗制在-80mv，給予去極化脈沖刺激。所用放大器為turbotec-03x（npielectronic,germany）。數(shù)據(jù)采集濾波為2khz。參比電極用ag/agcl電極與浴槽相連。刺激脈沖控制和電流信號(hào)記錄采用cellworks數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)（npi公司，germany）。線性漏電流和電容電流不予刪除。數(shù)據(jù)分析采用sigmaplot軟件進(jìn)行。所有毒素直接用or2溶液溶解并配制成目的濃度。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1spkp-xiii對(duì)kv4.1型電壓門(mén)控鉀通道的影響

我們檢測(cè)了spkp-xiii對(duì)表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的鉀通道kv4.1通道的作用。瞬時(shí)外向鉀通道kv4.1電流以去極化方式誘導(dǎo)：將細(xì)胞膜電位鉗制在-90mv，以200ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓+20mv，每隔5s重復(fù)一次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1μmspkp-xiii能抑制62%的kv4.1通道電流（如圖1）。spkp-xiii對(duì)kv4.1電流的抑制效應(yīng)具有濃度依從性，濃度依從性抑制效應(yīng)見(jiàn)圖2，經(jīng)過(guò)hill方程擬合后，得到spkp-xiii抑制kv4.1通道的半數(shù)有效抑制濃度ic50值為1.17μm。spkp-xiii對(duì)kv4.1電流的抑制具有時(shí)間依從性，在測(cè)試電壓+20mv下，加入5μmspkp-xiii能夠快速抑制kv4.1電流，抑制時(shí)間常數(shù)為28s，這種抑制完全可逆，毒素洗脫以后電流恢復(fù)的時(shí)間常數(shù)為44s（見(jiàn)圖3）。

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<110>長(zhǎng)沙沁才生物科技有限公司

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