本發(fā)明涉及微生物酶工程技術(shù)及生物化學(xué)與分子生物學(xué)，具體涉及一種具有激發(fā)植物免疫活性的木葡聚糖酶nfxyg12a及其突變體與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、全球人口增長對農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量及質(zhì)量帶來了巨大的挑戰(zhàn)，保障主糧作物產(chǎn)量與質(zhì)量是維護國家安全的重要任務(wù)。鑒于人們對綠色、高品質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品的美好追求。近十年微生物來源的質(zhì)外體免疫激發(fā)子在植物廣譜抗性方面應(yīng)用潛力大而備受關(guān)注。

2、木葡聚糖酶是一種胞外酶，在cazy(http://www.cazy.org/)數(shù)據(jù)庫中分布廣泛，分別存在gh5，gh12，gh16，gh44和gh74家族中。其中g(shù)h12家族的糖苷水解酶主要包括纖維素酶(ec?3.2.1.4)和木葡聚糖酶(ec?3.2.1.151)二大類(www.cazy.org)。

3、木葡聚糖酶特異性降解木葡聚糖，對于主鏈為β-1，4糖苷鍵的多聚糖均具有水解能力。木葡聚糖作為植物細胞壁中半纖維素多糖的重要組分，存在于大多數(shù)植物的初生細胞壁中，對細胞壁組織結(jié)構(gòu)和生長發(fā)育具有重要調(diào)控作用。纖維素，半纖維素是可再生資源，我國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生大量的農(nóng)作物廢料秸稈可以回收降解利用。木葡聚糖酶作為纖維素，半纖維素降解過程中的關(guān)鍵酶，可以協(xié)同其他纖維素酶高效降解植物纖維素。除此之外，由于木葡聚糖酶普遍具有較好的溫度穩(wěn)定性及在堿性條件下催化效果好的特征被應(yīng)用于各行各業(yè)。例如：在生物乙醇行業(yè)中，木葡聚糖酶與纖維素酶的協(xié)同作用可增加木質(zhì)纖維素的水解，進而提高生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟效益；在食品行業(yè)中,一方面木葡聚糖可以作為食品增稠劑，另一方面木葡聚糖酶可以使果汁中的渾濁變澄清，改善果汁質(zhì)量；在紡織造紙業(yè)中,由于大部分木葡聚糖酶偏堿性，在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較好，故而在造紙及紡織行業(yè)中有著較大的應(yīng)用潛力。

4、酶解法降解木葡聚糖和纖維素及其降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的工藝大多需要在酸性條件下進行，然而能夠滿足酸性條件下具有較高水解活性的木葡聚糖酶極為少見。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種具有植物免疫活性的來源于費希爾曲霉(aspergillusfischeri)的高效木葡聚糖酶nfxyg12a及其突變體的。nfxyg12a具有高溫和偏酸性水解的特性，其突變體在ph穩(wěn)定性條件下的催化活性表現(xiàn)優(yōu)異，在飼料發(fā)酵生產(chǎn)和食品添加劑行業(yè)中可充分發(fā)揮木葡聚糖酶的應(yīng)用潛力。本發(fā)明首次利用其植物免疫活性，將其噴灑在植物葉面，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。

2、本發(fā)明提供的的具有植物免疫活性的木葡聚糖酶nfxyg12a為如下a1)-a6)中的任一種：

3、a1)氨基酸序列是seq?id?no.1的第94-313位的蛋白質(zhì)；

4、a2)氨基酸序列是seq?id?no.3的第94-313位的蛋白質(zhì)；

5、a3)氨基酸序列是seq?id?no.5的第94-313位的蛋白質(zhì)；

6、a4)氨基酸序列是seq?id?no.7的第94-313位的蛋白質(zhì)；

7、a5)將序列表中seq?id?no.1的第94-313位或seq?id?no.3的第94-313位或seq?idno.5的第94-313位或seq?id?no.7的第94-313位所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

8、a6)在a1)或a2)或a3)或a4)或a5)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)。

9、為了使a1)-a4)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在其氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標簽。

10、表：標簽的序列

11、 標簽 殘基 序列 poly-arg 5-6(通常為5個) rrrrr poly-his 2-10(通常為6個) hhhhhh flag 8 dykddddk strep-tag?ii 8 wshpqfek c-myc 10 eqkliseedl

12、上述a5)中的nfxyg12a蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

13、上述a5)中的nfxyg12a蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將seq?id?no.2的第280-939位或seq?id?no.4的第280-939位或seq?id?no.4的第280-939位或seq?id?no.4的第280-939位所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上上表所示的標簽的編碼序列得到。其中，seq?idno.2的第280-939位所示的dna分子編碼seq?id?no.1的第94-313位所示的蛋白質(zhì)；seq?idno.4的第280-939位所示的dna分子編碼seq?id?no.3的第94-313位所示的蛋白質(zhì)；seq?idno.6的第280-939位所示的dna分子編碼seq?id?no.5的第94-313位所示的蛋白質(zhì)；seq?idno.8的第280-939位所示的dna分子編碼seq?id?no.7的第94-313位所示的蛋白質(zhì)。

14、在本發(fā)明的實施例中，a6)所述蛋白質(zhì)如seq?id?no.1或seq?id?no.3或seq?idno.5或seq?id?no.7所示。

15、本發(fā)明還提供了與nfxyg12a相關(guān)的生物材料，所述生物材料為下述b1)至b7)中的任一種：

16、b1)編碼nfxyg12a的核酸分子；

17、b2)含有b1)所述核酸分子的表達盒；

18、b3)含有b1)所述核酸分子的重組載體、或含有b2)所述表達盒的重組載體；

19、b4)含有b1)所述核酸分子的重組微生物、或含有b2)所述表達盒的重組微生物、或含有b3)所述重組載體的重組微生物；

20、b5)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系、或含有b2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；

21、b6)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有b2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；

22、b7)含有b1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有b2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官。

23、上述生物材料中，b1)所述核酸分子可為如下b1)-b14)中的任一種：

24、b1)編碼序列是序列表中seq?id?no.2的第280-939位的cdna分子或dna分子；

25、b2)序列表中seq?id?no.2的第280-939位的所示的dna分子；

26、b3)序列表中seq?id?no.2所示的dna分子；

27、b4)編碼序列是序列表中seq?id?no.4的第280-939位的cdna分子或dna分子；

28、b5)序列表中seq?id?no.4的第280-939位的所示的dna分子；

29、b6)序列表中seq?id?no.4所示的dna分子；

30、b7)編碼序列是序列表中seq?id?no.6的第280-939位的cdna分子或dna分子；

31、b8)序列表中seq?id?no.6的第280-939位的所示的dna分子；

32、b9)序列表中seq?id?no.6所示的dna分子；

33、b10)編碼序列是序列表中seq?id?no.8的第280-939位的cdna分子或dna分子；

34、b11)序列表中seq?id?no.8的第280-939位的所示的dna分子；

35、b12)序列表中seq?id?no.8所示的dna分子；

36、b13)與b1)-b12)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的cdna分子或dna分子；

37、b14)在嚴格條件下與b1)-b12)中任一限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的cdna分子或dna分子。

38、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

39、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼nfxyg12a蛋白質(zhì)的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的nfxyg12a蛋白質(zhì)的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼nfxyg12a蛋白質(zhì)且具有nfxyg12a蛋白質(zhì)功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

40、這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本發(fā)明的編碼seq?id?no.1的第94-313位或seq?id?no.3的第94-313位或seq?id?no.5的第94-313位或seq?id?no.7的第94-313位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

41、上述生物材料中，所述嚴格條件可為如下：50℃，在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，2×ssc，0.1％?sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，1×ssc，0.1％?sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，0.5×ssc，0.1％?sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，0.1×ssc，0.1％?sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×ssc，0.1％?sds中漂洗；也可為：在6×ssc，0.5％?sds的溶液中，在65oc下雜交,然后用2×ssc,0.1％?sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可為：2×ssc，0.1％?sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％?sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；也可為：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

42、上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。

43、上述生物材料中，b2)所述的含有編碼nfxyg12a蛋白質(zhì)的核酸分子的表達盒(nfxyg12a基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達nfxyg12a蛋白質(zhì)的dna，該dna不但可包括啟動nfxyg12a基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止nfxyg12a基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列。

44、可用現(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有所述nfxyg12a基因表達盒的重組載體。

45、上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述質(zhì)粒具體可為ppic9。

46、b3)所述重組載體具體可為ppic9-nfxyg12a、ppic9-n106s/s173a、ppic9-n106s或ppic9-s173a。

47、ppic9-nfxyg12a為將ppic9質(zhì)粒的ecor?i和not?i識別序列間的dna片段替換為序列表中seq?id?no.2的第280-942位所示的nfxyg12a基因得到的重組質(zhì)粒。ppic9-nfxyg12a含有序列表中seq?id?no.2所示的dna片段，能表達seq?id?no.1所示的nfxyg12a。

48、ppic9-n106s/s173a為將ppic9-nfxyg12a中seq?id?no.2所示的基因替換為seqid?no.4所示的基因得到的重組質(zhì)粒。

49、ppic9-n106s為將ppic9-nfxyg12a中seq?id?no.2所示的基因替換為seq?id?no.6所示的基因得到的重組質(zhì)粒。

50、ppic9-s173a為將ppic9-nfxyg12a中seq?id?no.2所示的基因替換為seq?id?no.8所示的基因得到的重組質(zhì)粒。

51、上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌。其中，酵母可為畢赤酵母gs115。

52、上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。

53、nfxyg12a在作為木葡聚糖酶中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。

54、本發(fā)明還提供了nfxyg12a，或所述生物材料的下述任一應(yīng)用：

55、m1、制備木葡聚糖酶；

56、m2、水解木葡聚糖；

57、m3、制備水解木葡聚糖產(chǎn)品；

58、m4、生產(chǎn)葡萄糖；

59、m5、制備生產(chǎn)葡萄糖產(chǎn)品；

60、m6、水解纖維素或半纖維素；

61、m7、制備水解纖維素或半纖維素產(chǎn)品；

62、m8、提高植物逆境抗性；

63、m9、制備提高植物逆境抗性產(chǎn)品；

64、m10、激發(fā)植物對病蟲害的免疫性；

65、m11、制備激發(fā)植物對病蟲害的免疫性產(chǎn)品。

66、其中，所述提高植物逆境抗性可體現(xiàn)在鹽脅迫環(huán)境中種子的萌發(fā)上。所述鹽脅迫環(huán)境可為高于植物正常生長環(huán)境中的鹽(如質(zhì)量百分比濃度為0.5％的nacl)濃度的生長環(huán)境。

67、所述激發(fā)植物對病蟲害的免疫性可體現(xiàn)在對植物細胞壞死反應(yīng)的誘導(dǎo)、對防御相關(guān)基因(如pti及eti途徑相關(guān)基因)的表達的誘導(dǎo)和/或?qū)﹄蓦召|(zhì)沉淀的誘導(dǎo)上。所述pti及eti途徑相關(guān)基因可為pti5、acre31、h1n1和/或hsr203j基因。

68、上述應(yīng)用中，所述逆境可為鹽脅迫環(huán)境。

69、所述植物可為p1)或p2)或p3)：

70、p1)雙子葉植物或單子葉植物；

71、p2)茄科植物；

72、p3)煙草。

73、本發(fā)明還提供了水解木葡聚糖的方法，所述方法包括：將nfxyg12a置于含有木葡聚糖的反應(yīng)體系中進行反應(yīng)，實現(xiàn)木葡聚糖的水解。

74、上述方法中，所述反應(yīng)體系的ph可為2-8。所述反應(yīng)可在30-80℃下進行。

75、所述反應(yīng)體系的ph可為2-7或2-6或2-5或2-4.5或3-4.5或3.5-4.5。

76、所述反應(yīng)體系的ph具體可為2、3、3.5、4、4.5、5、6、7或8。

77、所述反應(yīng)可在40-70℃或50-70℃或55-70℃或60-70℃下進行。

78、所述反應(yīng)具體可在30、40、50、55、60、65、70、80下進行。

79、本發(fā)明還提供了促進鹽脅迫環(huán)境下種子萌發(fā)的方法，所述方法包括：利用nfxyg12a處理植物種子，實現(xiàn)促進鹽脅迫環(huán)境下種子萌發(fā)。

80、上述方法中，所述植物可為p1)或p2)或p3)：

81、p1)雙子葉植物或單子葉植物；

82、p2)茄科植物；

83、p3)煙草。

84、實驗證明，本發(fā)明的nfxyg12a為高溫酸性木葡聚糖酶，該酶具有優(yōu)良的ph穩(wěn)定性和催化活性。與初始木葡聚糖酶nfxyg12a相比，突變后的催化效率有明顯的增加，本發(fā)明的木葡聚糖酶突變體可用于木質(zhì)纖維素的水解，并提高生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟效益。本發(fā)明的nfxyg12a還可以作為一種植物免疫激發(fā)子，在增強植物免疫方面有很高的應(yīng)用價值。本發(fā)明的nfxyg12a具有廣泛的應(yīng)用前景。