本發(fā)明涉及指紋圖譜構(gòu)建，特別是一種煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、賓王菇，學(xué)名煙色離褶傘，屬傘菌目、離褶傘科、離褶傘屬。每年夏秋季節(jié)發(fā)生在遼寧省彰武縣境內(nèi)。該菇營養(yǎng)豐富、味道鮮美、藥食兼用，被當(dāng)?shù)匕傩找暈檎淦贰＝陙碛捎诟鞣N原因，野生資源驟減，部分賓王菇發(fā)生地已滅絕，如何保護(hù)該資源成為亟待解決的問題。遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作為國內(nèi)首次馴化成功的單位，目前已實(shí)現(xiàn)工廠化栽培，在栽培過程中菌絲形態(tài)與鹿茸菇菌絲形態(tài)差異顯著，菌絲的生長活力和遺傳性狀受其基因序列控制，而基因序列的突變是產(chǎn)生菌絲形態(tài)差異的根本原因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)施的：

3、本發(fā)明的目的之一是要提供一種煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

4、s1、菌絲培養(yǎng)：將煙色離褶傘菌株sll-3轉(zhuǎn)接到pda液體綜合培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)10-12d后收集菌絲；所述煙色離褶傘菌株(lyophyllum?fumosum)sll-3于2021年11月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.23859,保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；

5、s2、基因組dna的提?。豪谜婢鷇na提取試劑盒，按照試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟提取基因組dna，并取2μl?dna進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測；紫外分光光度法檢測總基因組dna濃度和純度，調(diào)整樣品dna的濃度一致；

6、s3、樣品基因組dna檢測合格后，將dna片段化，然后對片段化的dna進(jìn)行片段純化、末端修復(fù)、3′端加a、連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，進(jìn)行pcr擴(kuò)增形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢；

7、s4、質(zhì)檢合格的文庫用illuminanovaseq6000平臺進(jìn)行測序，有效數(shù)據(jù)用于分析尋找海量snp標(biāo)記；

8、s5、snp位點(diǎn)過濾；

9、s51、snp位點(diǎn)在染色體上的dna鏈上前后大于50bp的序列保守，過濾得到12210個snp標(biāo)記；

10、s52、保留平均深度5x及以上、質(zhì)量值大于30、最小完整度大于0.9、最小等位基因頻率大于0.05，且snp是雙等位基因的snp標(biāo)記，過濾得到10932個snp標(biāo)記；

11、s53、截取過濾得到的10932個snp標(biāo)記上下游各100bp序列，然后使用blast軟件將序列比對參考基因組，去除比對上多個位置的snp標(biāo)記，過濾得到10480個snp標(biāo)記；

12、s54、保留多態(tài)信息含量pic大于0.2的snp標(biāo)記，過濾得到2744個snp標(biāo)記；其中多態(tài)信息含量pic計(jì)算公式如下：

13、

14、其中pi和pj是snp的兩個等位基因在所有被測品種中的發(fā)生頻率，l是樣本數(shù)量；

15、s6、對過濾得到的2744個snp標(biāo)記分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，只有引物設(shè)計(jì)成功的snp位點(diǎn)才認(rèn)為是合格的kasp標(biāo)記，得到2386個kasp標(biāo)記；

16、s7、snp位點(diǎn)的的驗(yàn)證以及分型；

17、s71、snp位點(diǎn)的一代驗(yàn)證：基于一代引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)位點(diǎn)的有效性；

18、s72、kasp引物設(shè)計(jì)結(jié)果：對于一代成功的位點(diǎn)進(jìn)行篩選，根據(jù)真實(shí)的一代測序設(shè)計(jì)kasp引物，并進(jìn)行kasp分型；

19、s73、位點(diǎn)信息整合：將一代引物，kasp引物以及位點(diǎn)的分型信息等進(jìn)行整合；

20、s8、指紋圖譜構(gòu)建；

21、s81、標(biāo)記鑒定效率：對2386個kasp標(biāo)記進(jìn)行鑒定效率作圖；

22、s82、指紋圖譜作圖：使用perl語言程序，對2386個kasp標(biāo)記進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建。

23、進(jìn)一步地，所述步驟s3中，用機(jī)械打斷的方法或超聲波將dna片段化。

24、進(jìn)一步地，所述步驟s3中，pcr反應(yīng)體系為：

25、

26、引物擴(kuò)增條件的設(shè)置：95℃5min；95℃30s，58℃退火30s，72℃1min循環(huán)35次；72℃10min。

27、進(jìn)一步地，所述步驟s72中，設(shè)計(jì)的kasp引物如下：

28、

29、

30、本發(fā)明的目的之二是要提供一種利用上述方法構(gòu)建的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜。

31、本發(fā)明的目的之三是要提供一種權(quán)利要求6所述的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用，利用鹿茸菇自測全基因組為參考基因組，利用基因組重測序技術(shù)開發(fā)的snp經(jīng)過變異檢測、注釋和篩選后，得到質(zhì)量高、代表性強(qiáng)、標(biāo)記/組合的材料區(qū)分度高、在基因組上分布均勻、特異性強(qiáng)的snp標(biāo)記作為煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜；對收集的23份包含鹿茸菇在內(nèi)的鹿茸菇和煙色離褶傘菌株sll-3進(jìn)行帶型擴(kuò)增，不同kasp位點(diǎn)的編號組合能夠在所收集的23份資源中有效識別sll-3菌種。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)；檢測所需的操作時間在24h以內(nèi)(包括提取基因組dna、pcr擴(kuò)增、電泳分析、數(shù)據(jù)分析)，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗(yàn)則需要至少6個月的時間：本發(fā)明方法在所收集的23個鹿茸菇和煙色離褶傘菌株sll-3中具有sll-3菌種的專一性，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟s3中，用機(jī)械打斷的方法或超聲波將dna片段化。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟s3中，pcr反應(yīng)體系為：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟s72中，設(shè)計(jì)的kasp引物如下表：

5.一種如權(quán)利要求1-4任一所述的方法構(gòu)建的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜。

6.一種權(quán)利要求5所述的煙色離褶傘菌株sll-3的kasp標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用，其特征在于：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于指紋圖譜構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種煙色離褶傘菌株SLL?3的KASP標(biāo)記指紋圖譜的構(gòu)建方法及應(yīng)用，依次經(jīng)過菌絲培養(yǎng)、基因組重測序和簡化測序、SNP原始文件、統(tǒng)計(jì)作圖、多樣性過濾、同源性過濾、引物設(shè)計(jì)、KASP標(biāo)記、標(biāo)記評估構(gòu)建得到煙色離褶傘菌株SLL?3的KASP標(biāo)記指紋圖譜；利用煙色離褶傘菌株SLL?3的KASP標(biāo)記指紋圖譜對煙色離褶傘菌株進(jìn)行KASP標(biāo)記擴(kuò)增，將得到的帶型與指紋圖譜對照，與該組指紋圖譜一致即為煙色離褶傘菌株SLL?3。本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時間短、準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：宋瑩,劉娜,張敏,呂立濤,李躍,齊偉,張鵬
受保護(hù)的技術(shù)使用者：遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/14