本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程，涉及一種骨類器官及其構建方法與用途。

背景技術：

1、口腔顱頜面部及全身其他部位骨缺損病因多樣，發(fā)病率高，形態(tài)復雜，骨再生難度大，嚴重影響患者的容貌、咀嚼、發(fā)音以及運動等功能，導致患者生活質量與身心健康深受損害。目前，對于小范圍骨缺損可通過填充人工骨粉等材料可實現(xiàn)修復。而對于較大范圍骨缺損，目前治療的方法包括自體骨移植、同種異體移植和合成骨替代物，但這些方法都有局限性，自體骨移植供區(qū)損傷、創(chuàng)傷大；同種異體移植和合成骨替代物存在免疫原性、感染、整合不良和血管化不足等問題。

2、類器官是基于細胞的簡單的組織工程體外模型，是細胞通過自我更新及自組織或在生物材料誘導下組織而形成的具有仿生空間特征的三維培養(yǎng)物，能夠模擬或部分模擬體內組織器官的細胞類型、結構及功能。目前類器官在組織發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展機制、藥物篩選以及組織工程的研究中發(fā)揮出至關重要的作用。因此，基于骨類器官構建的工程化組織，能夠為骨組織再生修復提供新途徑，同時還可以作為研究骨組織發(fā)育的模型、藥物篩選模型。

3、然而在骨類器官技術中，盡管研究者們對骨類器官的構建和應用付出了諸多努力，但構建骨類器官耗時長，仍存在缺乏對細胞命運的調控，促成骨效果不佳，且細胞組成單一，與天然骨差異明顯等局限性。例如專利申請“一種基于類骨器官的3d生物打印類骨組織工程支架”(申請?zhí)枺篶n202210911808.x)構建了包括殼體、外側仿生骨膜和內部微球填充的骨類器官，在靜態(tài)環(huán)境下模擬骨組織的宏觀結構，但并沒有模擬骨組織形成過程中所不可缺少的動態(tài)力學微環(huán)境，缺乏對細胞命運的調控。又如專利申請“一種骨骼類器官的構建系統(tǒng)及其使用方法”(申請?zhí)枺篶n202311219797.x)選擇包括骨髓基質細胞、骨祖細胞、前成骨細胞、成骨細胞、骨襯細胞、骨細胞或破骨細胞等至少一種細胞或多種細胞用于構建骨類器官。又如文獻“developmentally?engineered?callus?organoid?bioassembliesexhibit?predictive?in?vivo?long?bone?healing”(doi編號:10.1002/advs.201902295；pmid編號:31993293)中選擇以單一骨膜來源的干細胞構建骨類器官，然而這些細胞多是成骨向細胞，缺乏骨免疫穩(wěn)態(tài)、骨修復再生中起關鍵作用的巨噬細胞等免疫細胞。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的是提供一種骨類器官，以能夠快速構建獲得，與天然骨差異小，能夠對細胞命運進行調控，并能夠更好地促成骨和促進骨修復。

2、為實現(xiàn)此目的，在基礎的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，所述的骨類器官由細胞混合物經過三維培養(yǎng)獲得，所述的細胞混合物包含干細胞和巨噬細胞。

3、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，其中所述的干細胞選自臍帶血間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、多潛能誘導干細胞中的一種或者多種。

4、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，其中所述的巨噬細胞為骨髓來源的巨噬細胞和/或外周血來源的巨噬細胞。

5、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，其中所述的干細胞與所述的巨噬細胞的數(shù)量比為(2-3):1。

6、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，其中所述的細胞混合物還包含水凝膠基質材料。

7、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，其中所述的水凝膠基質材料選自甲基丙烯?；髂z、透明質酸、海藻酸鈉、絲素蛋白、羧甲基殼聚糖、硫酸軟骨素、膠原中的一種或多種。

8、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種骨類器官，其中全部細胞在所述的水凝膠基質材料中形成的密度為(1-5)×106個/ml。

9、本發(fā)明的第二個目的是提供一種如上所述的骨類器官的構建方法，以能夠快速制備如上所述的骨類器官，制得骨類器官與天然骨差異小，能夠對細胞命運進行調控，并能夠更好地促成骨和促進骨修復。

10、為實現(xiàn)此目的，在基礎的實施方案中，本發(fā)明提供一種如上所述的骨類器官的構建方法，所述的構建方法包括如下步驟：

11、(1)在三維培養(yǎng)反應器中均勻混合所述的細胞混合物中的各材料；

12、(2)使所述的水凝膠基質材料固化；

13、(3)進行細胞培養(yǎng)，以得到所述的骨類器官。

14、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種如上所述的骨類器官的構建方法，其中步驟(1)中，所述的三維培養(yǎng)反應器為基于動態(tài)拉應力的三維培養(yǎng)反應器。

15、所謂三維培養(yǎng)，是一種細胞在三維空間中生長、增殖和遷移的技術，細胞被包裹在具有三維結構的基質中，或是人工合成的支架材料上。相比傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)，三維細胞培養(yǎng)更接近體內細胞在生理環(huán)境中的生長狀態(tài)，包括細胞之間的相互作用、信號傳導以及細胞外基質的響應。因此，三維培養(yǎng)更能夠模擬組織和器官的生物學特性，為生物醫(yī)學研究、藥物開發(fā)和組織工程等領域提供更多可能性。關于三維培養(yǎng)的詳細介紹，可參見文獻：functional?and?biomimetic?materials?for?engineering?of?the?three-dimensionalcell?microenvironment(doi編號:10.1021/acs.chemrev.7b00094)。

16、動態(tài)拉應力三維培養(yǎng)，其不同于以往靜態(tài)環(huán)境下的三維培養(yǎng)，而是一種基于動態(tài)環(huán)境下的三維培養(yǎng)方式，其通過整個三維培養(yǎng)體系與腔室的結合，借助動態(tài)拉應力設備(例如cell?tank設備)對腔室的動態(tài)牽張，帶動整個三維培養(yǎng)體系的動態(tài)牽張，使發(fā)生牽張形變的同時產生動態(tài)拉應力，培養(yǎng)中的細胞也因此處在動態(tài)拉應力的環(huán)境中。

17、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種如上所述的骨類器官的構建方法，其中所述的基于動態(tài)拉應力的三維培養(yǎng)反應器在加入所述的細胞混合物前先后經過等離子體噴涂處理去除內表面雜質，和內表面涂覆多聚賴氨酸以提高內表面的親水性和黏附性的處理。

18、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種如上所述的骨類器官的構建方法，其中步驟(2)中，所述的固化為光固化，光固化的波長為400-420nm，光固化的時間為30-60s。

19、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種如上所述的骨類器官的構建方法，其中步驟(3)中，進行細胞培養(yǎng)時，動態(tài)拉應力的頻率為0.5-0.8hz，時間為2-3h/天，比例為8-10％。

20、本發(fā)明的第三個目的是提供如上所述的骨類器官用于制備骨修復材料或體外研究模型的用途，以能夠更好地促成骨和促進骨修復。

21、為實現(xiàn)此目的，在基礎的實施方案中，本發(fā)明提供如上所述的骨類器官用于制備骨修復材料或體外研究模型的用途。

22、在一種優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供如上所述的骨類器官用于制備骨修復材料或體外研究模型的用途，其中所述的骨修復材料用于治療骨缺損或骨質疏松，所述的體外研究模型用于組織發(fā)育研究或藥物篩選研究。

23、本發(fā)明的有益效果在于，利用本發(fā)明的骨類器官及其構建方法，能夠快速制備骨類器官，制得骨類器官與天然骨差異小，能夠對細胞命運進行調控，并能夠更好地促成骨和促進骨修復。

24、目前構建骨類器官多采用單一成骨向細胞，沒有考慮到骨免疫微環(huán)境，與天然骨組織差異明顯，本發(fā)明在成骨向細胞的基礎上同時引入巨噬細胞等免疫細胞調控骨免疫微環(huán)境，從而形成具有免疫調節(jié)作用的功能性骨類器官。

25、目前骨類器官的構建耗時長，缺乏對細胞命運的調控，促成骨效果不佳，本發(fā)明模擬天然骨組織的力學環(huán)境，構建動態(tài)拉應力三維培養(yǎng)系統(tǒng)，通過力學調控細胞命運，同時可縮短構建骨類器官的時間，獲得骨類器官可提高促成骨效果，可促進成熟的功能性骨類器官的形成。

26、本發(fā)明提供的骨類器官促進間充質干細胞成骨向分化和抑制骨質流失的能力較單獨的間充質干細胞凋亡囊泡顯著提高，在治療老年性骨質疏松方向有著廣闊的臨床應用前景。

27、相較于以往研究中基于靜態(tài)培養(yǎng)和單種細胞構建的骨類器官，本發(fā)明構建的骨類器官擁有更加優(yōu)異的骨修復效果。目前自體骨移植是治療骨缺損的金標準，但自體骨移植會造成供區(qū)損傷，本發(fā)明構建的骨類器官在植入14天后就能達到與自體骨修復相媲美的骨再生修復效果。