本發(fā)明屬于腫瘤藥物材料，具體涉及一種靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、腫瘤微環(huán)境涉及腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞之間的復(fù)雜合作，實(shí)體瘤內(nèi)腫瘤血管的不規(guī)則生長(zhǎng)所形成的缺氧是腫瘤微環(huán)境的內(nèi)在特征之一，與腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、多重耐藥和免疫抑制等有關(guān)。目前，許多研究支持抑制腫瘤缺氧微環(huán)境內(nèi)的一些關(guān)鍵成分有助于腫瘤的治療。目前的納米技術(shù)為我們提供了對(duì)抗低氧腫瘤微環(huán)境的智能策略，如外源性氧輸送，細(xì)胞外ph調(diào)節(jié)，關(guān)鍵信號(hào)通路失調(diào)，細(xì)胞缺氧代謝重編程，進(jìn)一步執(zhí)行氧非依賴性放療和缺氧反應(yīng)性化療。

2、目前的納米技術(shù)提供了對(duì)抗低氧腫瘤微環(huán)境的智能策略，然而，一旦暴露于外部刺激，如化療，腫瘤細(xì)胞同時(shí)釋放惡性信號(hào)，形成腫瘤遷移和免疫抑制，給臨床帶來了挑戰(zhàn)。并且目前的納米技術(shù)提供了對(duì)抗低氧腫瘤微環(huán)境的智能策略，但很少有技術(shù)能夠系統(tǒng)地實(shí)現(xiàn)治療過程中甚至術(shù)后對(duì)腫瘤微環(huán)境的時(shí)空控制。

3、在實(shí)體腫瘤中，缺氧是一種常見的現(xiàn)象，它可以刺激欺騙性腫瘤外泌體的傳播，這些外泌體作為溝通的橋梁，協(xié)調(diào)各種支持細(xì)胞類型的募集，以增強(qiáng)腫瘤在腫瘤免疫微環(huán)境中的適應(yīng)性。盡管人們用各種有效設(shè)計(jì)來調(diào)節(jié)缺氧的腫瘤環(huán)境，但矛盾的是，腫瘤及其標(biāo)志物似乎總是有一些方法來成功地在極端惡劣的環(huán)境下生存。缺氧腫瘤微環(huán)境中的成員比我們想象的更精確地控制，這取決于彼此之間的本地或遠(yuǎn)程通信。當(dāng)受到外界刺激時(shí)，低氧腫瘤細(xì)胞通常對(duì)常規(guī)治療表現(xiàn)出強(qiáng)大的適應(yīng)性，具有釋放惡性信號(hào)的能力，從而促進(jìn)腫瘤的生存、遷移、耐藥和免疫抑制。因此，對(duì)這種應(yīng)激誘導(dǎo)的外泌體播散現(xiàn)象的監(jiān)督可能對(duì)當(dāng)前的臨床腫瘤治療策略構(gòu)成挑戰(zhàn)，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等問題，以及腫瘤免疫治療的失敗。

4、這些惡性信號(hào)的重要載體之一是腫瘤外泌體，它作為腫瘤局部微環(huán)境調(diào)控和遠(yuǎn)端系統(tǒng)環(huán)境重塑的新型信使正在興起。外泌體被稱為天然的信息載體，幾乎所有類型的細(xì)胞都分泌外泌體。外泌體內(nèi)的一些分子，如蛋白質(zhì)、dsdnas、非編碼rna和mrna，可以被轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的表型，其中，來自腫瘤的欺騙性和破壞性外泌體可以用來說服和馴服免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)可以感知腫瘤的存在并隨后遷移到腫瘤中。腫瘤細(xì)胞暴露于惡劣環(huán)境將進(jìn)一步增加其以外泌體為基礎(chǔ)的方式傳播惡性信號(hào)的風(fēng)險(xiǎn)，化療藥物在一定劑量范圍內(nèi)，可以促進(jìn)腫瘤分泌特殊的外泌體，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時(shí)也為遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移提供合適的生態(tài)位。此外，低氧腫瘤微環(huán)境作為一種應(yīng)激性低氧條件，在許多腫瘤疾病中作為外泌體生物發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子而受到廣泛關(guān)注。它不僅促進(jìn)了癌細(xì)胞的分泌水平，而且賦予腫瘤外泌體低氧特異性載貨能力，這是腫瘤存活、轉(zhuǎn)移、干性行為和免疫反應(yīng)的重要決定因素。因此，應(yīng)考慮腫瘤外泌體以應(yīng)激誘導(dǎo)的傳播方式對(duì)鄰近組織具有傳染性。

5、值得注意的是，來自缺氧腫瘤細(xì)胞的許多重要信號(hào)承擔(dān)著可能有助于免疫耐受和免疫逃逸的特殊任務(wù)。最近的研究也支持了缺氧誘導(dǎo)的外泌體介導(dǎo)與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞間通訊，并具有免疫調(diào)節(jié)作用，如抑制自然殺傷細(xì)胞的功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的m2樣極化，傳播pd-l1配體的信號(hào)。更重要的是，新出現(xiàn)的證據(jù)還表明，低氧腫瘤微環(huán)境在免疫細(xì)胞失調(diào)中發(fā)揮著重要作用，從多個(gè)方面限制了腫瘤免疫治療的效果，包括驅(qū)動(dòng)t淋巴細(xì)胞耗竭，促進(jìn)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞募集，影響自然殺傷細(xì)胞和成熟樹突狀細(xì)胞功能以及誘導(dǎo)免疫抑制性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化。因此，腫瘤微環(huán)境中的缺氧可以增強(qiáng)腫瘤的適應(yīng)性，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞群，這應(yīng)該是提高腫瘤臨床免疫治療的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。完全切斷腫瘤內(nèi)不同成員之間依賴外泌體的通訊，似乎有望有效改善傳統(tǒng)的臨床試驗(yàn)。

6、為了減弱腫瘤外泌體調(diào)控的傳染效應(yīng)，有必要在常規(guī)治療過程中構(gòu)建腫瘤微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞間通訊的干擾。水凝膠，得益于其定制的機(jī)械性能，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中提供智能時(shí)空控制方面取得了顯著的成功，例如組織再生，局部藥物輸送，愈合和免疫佐劑。纖維網(wǎng)絡(luò)的可編程孔徑將賦予水凝膠在生物物理上阻斷外泌體傳播方面的優(yōu)勢(shì)。近年來，基于短肽的自組裝水凝膠因其具有良好的反應(yīng)性和固有的生物相容性而備受關(guān)注基于響應(yīng)位點(diǎn)的肽基自組裝可以根據(jù)需要靶向細(xì)胞細(xì)胞器，提供具有特定生物功能的納米結(jié)構(gòu)。

7、最近設(shè)計(jì)的肽自組裝可以靶向腫瘤細(xì)胞膜，從而中斷膜功能，在腫瘤治療中具有顯著的優(yōu)勢(shì)，如運(yùn)動(dòng)限制、藥物積累、膜結(jié)合、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用工程等。目前，已經(jīng)在缺氧腫瘤細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了膜靶向自組裝，通過錨定碳酸酐酶(ca)ix誘導(dǎo)致死性內(nèi)噬作用。作為缺氧腫瘤重要的膜定位蛋白，caix還在免疫微環(huán)境中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用同時(shí)，其同工酶也被報(bào)道影響腫瘤外泌體的分泌。外泌體起源于細(xì)胞質(zhì)多泡體，與細(xì)胞膜功能密切相關(guān)，它們被運(yùn)送到細(xì)胞膜并與細(xì)胞膜融合，形成內(nèi)部小泡因此，通過細(xì)胞膜功能障礙和缺氧微環(huán)境調(diào)節(jié)，在細(xì)胞膜上靶向caix的自組裝可能是緩解腫瘤外泌體相關(guān)副作用的一種有希望的方法。此外，針對(duì)細(xì)胞膜的肽基自組裝可以在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周圍空間形成水凝膠，從而在空間上控制物質(zhì)的胞吞和基于外泌體的系統(tǒng)環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

8、因此，如何提供一種可以在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周圍空間形成水凝膠、阻止外泌體影響免疫系統(tǒng)的自組裝納米材料，已成為目前亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過對(duì)靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得該靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料可在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周圍空間形成水凝膠、阻止外泌體影響免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)，為治療腫瘤藥物的開發(fā)提供了新思路。

2、為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料，所述自組裝納米材料包括具有如下式pepabs-py所示結(jié)構(gòu)的化合物：

4、

5、現(xiàn)有技術(shù)提供的傳統(tǒng)的化療藥物不僅針對(duì)腫瘤，而且還會(huì)影響免疫系統(tǒng)。化療藥物的過量使用最終會(huì)導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)受到抑制。此外，現(xiàn)有技術(shù)研究表明，腫瘤來源的外泌體具有一定的能力，可以在遠(yuǎn)處器官中創(chuàng)造炎癥環(huán)境，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移細(xì)胞的發(fā)展，同樣，一些化療藥物，如阿霉素和紫杉醇，通過幫助腫瘤釋放惡性外泌體，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了一些明顯的作用。腫瘤源性外泌體中的信號(hào)分子能夠促進(jìn)正常細(xì)胞在腫瘤或遠(yuǎn)距離器官內(nèi)的惡性增殖、血管生成和免疫抑制作用，低氧條件下的腫瘤外泌體將攜帶許多重要信號(hào)并承擔(dān)促進(jìn)免疫耐受和免疫逃逸的特殊任務(wù)。因此目前的臨床治療策略仍然面臨腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的挑戰(zhàn)，以及腫瘤免疫治療的失敗。因此，在腫瘤治療過程中如何有效屏蔽腫瘤信號(hào)通信，來減弱常規(guī)治療過程中腫瘤外泌體誘導(dǎo)的效應(yīng)，非常值得關(guān)注。

6、本發(fā)明提供的靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料包含兩個(gè)非自然d型氨基酸序列df，從而在生物體內(nèi)得到長(zhǎng)效穩(wěn)定的自組裝納米結(jié)構(gòu)；自組裝短肽小分子包含非自然d型氨基酸序列dk，其側(cè)鏈氨基為化學(xué)鍵結(jié)合碳酸酐酶抑制劑提供良好反應(yīng)位點(diǎn)；自組裝短肽小分子包含自然型氨基酸序列g(shù)，幫助磷酸化的y氨基酸與氨基酸短肽結(jié)合；萘乙酸(nap)為芳香封端基團(tuán)，以酰胺和氨基酸相連，幫助氨基酸短肽dfdfdkgdpy提供更好的自組裝效果。

7、本發(fā)明通過對(duì)靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料進(jìn)行設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)得到的靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料可以通過細(xì)胞膜表面的去磷酸化觸發(fā)，并有效地自組裝在腫瘤細(xì)胞周圍形成水凝膠。新形成的水凝膠包裹腫瘤細(xì)胞，限制信號(hào)載體或小化學(xué)物質(zhì)的交換，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，abs與自組裝分子的結(jié)合也使這種新型外泌體干擾在體內(nèi)具有更好的抗缺氧性能。考慮到缺氧腫瘤外泌體的不同基因表達(dá)譜，在自組裝分子中進(jìn)行abs修飾可以進(jìn)一步確定t淋巴細(xì)胞是pepabs-py治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。由于腫瘤細(xì)胞在極端應(yīng)激下的自我保護(hù)策略，在治療過程中，幾種t淋巴細(xì)胞抑制劑的相對(duì)含量上調(diào)，這也可能有助于腫瘤的耐藥。然而，新形成的pepabs-py水凝膠可以有效地減少外泌體誘導(dǎo)效應(yīng)的危害，破壞腫瘤適應(yīng)，這可能是這種自組裝分子的另一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)。此外，這種自組裝的水凝膠是在腫瘤內(nèi)給藥小分子肽后形成的，在腫瘤內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)越的長(zhǎng)期滯留性，有助于達(dá)到最佳的治療效果。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已充分證實(shí)缺氧特征得到有效減輕，t淋巴細(xì)胞相關(guān)免疫抑制癥狀得到改善。因此，pepabs-py的應(yīng)用可以被認(rèn)為是一個(gè)新的治療方向，破壞信號(hào)分子的通訊，抑制腫瘤的瘋狂生長(zhǎng)。

8、本發(fā)明利用膜靶向治療策略，新穎地應(yīng)用自組裝短肽(pepabs-py)，在腫瘤細(xì)胞表面提供水凝膠，以纖維樣納米結(jié)構(gòu)阻斷外泌體的播散，有效地限制了傳統(tǒng)治療方法的全身效應(yīng)。此外，pepabs-py可以通過攜帶缺氧腫瘤過表達(dá)caix酶的抑制劑來減弱體內(nèi)缺氧腫瘤微環(huán)境，其中缺氧誘導(dǎo)的外泌體也被認(rèn)為是介導(dǎo)免疫系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞間通訊的重要調(diào)節(jié)因子。總的來說，pepabs-py具有阻斷外泌體播散的能力，可以作為一種有前景的腫瘤膜靶向治療工具，在免疫微環(huán)境中對(duì)抗腫瘤的適應(yīng)性，進(jìn)一步推進(jìn)傳統(tǒng)的化療。

9、且得益于abs偶聯(lián)，abs是低氧腫瘤過表達(dá)caix的抑制劑，這種自組裝分子表現(xiàn)出明顯的抗缺氧特性。因此，缺氧腫瘤產(chǎn)生的外泌體的mirnas含量被pepabs-py嚴(yán)重破壞，其中t細(xì)胞相關(guān)通路已被確定為重要的下游靶標(biāo)。因此，pepabs-py治療對(duì)腫瘤缺氧和免疫微環(huán)境有顯著改善。此外，盡管化療藥物在一定劑量范圍內(nèi)可以激活腫瘤轉(zhuǎn)移，但外泌體通訊干擾完全逆轉(zhuǎn)了化療藥物的副作用。綜上所述，本發(fā)明通過切斷腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞或遠(yuǎn)處器官之間的串?dāng)_，pepabs-py可以作為一種新的腫瘤治療工具。此外，水凝膠介導(dǎo)的外泌體干擾在未來的免疫調(diào)節(jié)中具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

10、以下作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，但不作為對(duì)本發(fā)明提供的技術(shù)方案的限制，通過以下優(yōu)選的技術(shù)方案，可以更好的達(dá)到和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的和有益效果。

11、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述自組裝納米材料的制備原料包括蛋白酶抗性d肽自組裝基序和碳酸酐酶抑制劑；

12、所述蛋白酶抗性d肽自組裝基序包括：(2-萘乙酸-(d)-phe-(d)-phe-(d)-lys-gly-oh(pep))；

13、所述碳酸酐酶抑制劑包括4-(2-氨基乙基)苯磺酰胺(abs)。

14、第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

15、(1)活化劑tcdi(n,n′-硫羰基二咪唑)和碳酸酐酶抑制劑進(jìn)行活化反應(yīng)，得到活化碳酸酐酶抑制劑；

16、

17、(2)通過標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法制備短肽，所述短肽的結(jié)構(gòu)式如下；

18、

19、(3)活化碳酸酐酶抑制劑和短肽反應(yīng)，得到所述靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料；

20、

21、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(1)中所述活化劑tcdi和碳酸酐酶抑制劑的摩爾比為(2.0-2.5)：1，例如可以是2.0:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1或2.5:1等。

22、優(yōu)選地，步驟(1)所述活化反應(yīng)的溫度為20-30℃(例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等)，時(shí)間為12-15h(例如可以是12h、12.5h、13h、13.5h、14h、14.5h或15h等)。

23、優(yōu)選地，步驟(1)具體如下：將活化劑tcdi溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，得到活化劑tcdi溶液；

24、將碳酸酐酶抑制劑(abs)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，然后向其中加入三乙胺調(diào)節(jié)ph至8.5-9.0后，向其中緩慢加入活化劑tcdi溶液，進(jìn)行活化反應(yīng)。

25、優(yōu)選地，所述活化劑tcdi溶液中，活化劑tcdi的物質(zhì)的量和n,n-二甲基甲酰胺的體積之間的比值為2mmol：(3ml-4ml)，例如可以是2mmol：3.0ml、2mmol：3.1ml、2mmol：3.2ml、2mmol：3.3ml、2mmol：3.4ml、2mmol：3.5ml、2mmol：3.6ml、2mmol：3.7ml、2mmol：3.8ml、2mmol：3.9ml或2mmol：4ml等。

26、優(yōu)選地，所述碳酸酐酶抑制劑溶于n,n-二甲基甲酰胺中，所述碳酸酐酶抑制劑的物質(zhì)的量和n,n-二甲基甲酰胺的體積之間的比值為1mmol：(2ml-3ml)，例如可以是1mmol：2ml、1mmol：2.1ml、1mmol：2.2ml、1mmol：2.3ml、1mmol：2.4ml、1mmol：2.5ml、1mmol：2.6ml、1mmol：2.7ml、1mmol：2.8ml、1mmol：2.9ml或1mmol：3ml等。

27、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(2)所述標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法制備短肽的方法包括fmoc固相合成方法。

28、優(yōu)選地，合成所述短肽的氨基酸個(gè)數(shù)為5個(gè)。

29、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述活化碳酸酐酶抑制劑和短肽的摩爾比為(1.2-1.5)：1，例如可以是1.2:1、1.25:1、1.3:1、1.35:1、1.4:1、1.45:1或1.5:1等。

30、優(yōu)選地，步驟(3)所述反應(yīng)的溫度為18-37℃(例如可以是18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃或37℃等)，時(shí)間為12-20h(例如可以是12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h等)。

31、優(yōu)選地，步驟(3)所述反應(yīng)在堿性物質(zhì)存在下進(jìn)行，所述堿性物質(zhì)包括可調(diào)節(jié)ph的可溶性無機(jī)鹽或者有機(jī)堿溶液，進(jìn)一步優(yōu)選為無水碳酸鈉、無水碳酸鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉或三乙胺中的任意一種或至少兩種的組合。

32、優(yōu)選地，所述堿性物質(zhì)為無水碳酸鈉。

33、優(yōu)選地，加入所述無水碳酸鈉調(diào)節(jié)所述反應(yīng)的ph為8.5-9.0，例如可以是8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0等。

34、優(yōu)選地，步驟(3)所述反應(yīng)在混合溶劑存在下進(jìn)行，所述混合溶劑包括水和醇類溶劑的組合。

35、優(yōu)選地，所述醇類溶劑包括甲醇。

36、優(yōu)選地，所述水和醇類溶劑的體積比為(1.5-2.5)：1，例如可以是1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1或2.5:1等。

37、需要說明的是，本發(fā)明對(duì)于混合溶劑的用量沒有任何特殊的限制，本領(lǐng)域常用的用量范圍均適用。

38、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，步驟(3)所述反應(yīng)后還包括后處理的步驟；

39、所述后處理的方法包括使用高效液相色譜法進(jìn)行提純。

40、作為本本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料的制備方法具體包括如下步驟：

41、(1)將活化劑tcdi溶于n,n-二甲基甲酰胺，得到活化劑tcdi溶液；其中，活化劑tcdi的物質(zhì)的量和n,n-二甲基甲酰胺的體積比為2mmol：(3ml-4ml)；

42、將碳酸酐酶抑制劑(abs)溶于n,n-二甲基甲酰胺中，然后向其中加入三乙胺調(diào)節(jié)ph至8.5-9.0后，向其中緩慢加入活化劑tcdi溶液，在25℃下進(jìn)行活化反應(yīng)12-15h，得到活化碳酸酐酶抑制劑；其中，碳酸酐酶抑制劑的物質(zhì)的量和n,n-二甲基甲酰胺的體積比為1mmol：(2ml-3ml)，活化劑tcdi和碳酸酐酶抑制劑的摩爾比為(2.0-2.5)：1；

43、

44、(2)通過標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成方法制備短肽：即2-氯三苯甲基氯樹脂(1.10mmol/g)和具有由叔丁氧基羰基保護(hù)側(cè)鏈氨基，以及fmoc保護(hù)主鏈氨基的各類d型氨基酸反應(yīng)制得；通過氮?dú)庠跓o水二氯甲烷(dcm)中鼓泡30分鐘使樹脂溶脹，然后用5ml干燥的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)洗滌三次，加入第一個(gè)fmoc保護(hù)的磷酸化d?y(2eqv.fmoc-d-tyr(h2po3)-oh)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)的混合溶液(1ml?dmf)，并通過在溶液中鼓泡使樹脂與氨基酸c-末端反應(yīng)40分鐘，然后用dmf?5ml洗滌樹脂三次，然后將封閉溶液(體積比為16:3:1的dcm/meoh/dipea)加入樹脂中以淬滅樹脂中未反應(yīng)的位點(diǎn)并鼓泡40分鐘，反應(yīng)完成后通過dmf洗滌樹脂三次隨后在樹脂中加入5ml體積分?jǐn)?shù)為20％的哌啶并鼓泡30分鐘，將保護(hù)基團(tuán)fmoc從樹脂上切下，然后將樹脂在dmf中洗滌五次，然后加入第二個(gè)fmoc保護(hù)的氨基酸(2eqv.fmoc-gly-oh)，將dipea(1ml)與苯并三氨唑-n,n,n',n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)(2eqv.)一起溶解在dmf中并與樹脂上的裸露的氨基反應(yīng)，隨后加入第三個(gè)fmoc保護(hù)的氨基酸(2eqv.fmoc-d-lys-boc-oh)，重復(fù)這些偶聯(lián)和去保護(hù)步驟加入最后兩個(gè)fmoc保護(hù)的氨基酸(fmoc-d-phe-oh，2eqv.)以及2-萘乙酸(2-nap，2eqv)以延長(zhǎng)肽鏈，這是標(biāo)準(zhǔn)的fmoc?spps方案；

45、每個(gè)步驟后，將樹脂用5mldmf洗滌3次，在最后的步驟中，用dmf(5ml?x5)，dcm(5mlx5)，甲醇(5ml?x5)和己烷(5ml?x5)洗滌樹脂，然后通過加入10毫升tfa反應(yīng)2小時(shí)，將多肽從樹脂中切下，并在在乙醚中沉淀；收集產(chǎn)物并用高效液相色譜hplc進(jìn)一步純化，完成短肽的制備。

46、(3)在堿性物質(zhì)和混合溶劑存在下，活化碳酸酐酶抑制劑和短肽在18-37℃下反應(yīng)12-20h，得到所述靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料；

47、

48、其中，活化碳酸酐酶抑制劑和短肽的摩爾比為(1.2-1.5)：1。

49、第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料的應(yīng)用，所述靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料用于制備治療腫瘤的藥物。

50、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述腫瘤包括乏氧腫瘤。

51、作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述乏氧腫瘤包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、卵巢癌、腦部膠質(zhì)瘤、口腔癌中的至少一種。

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

53、本發(fā)明通過對(duì)靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得該靶向乏氧腫瘤細(xì)胞膜阻礙外泌體逃逸的自組裝納米材料可在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周圍空間形成水凝膠、阻止外泌體影響免疫系統(tǒng)、抑制腫瘤生長(zhǎng)，為治療腫瘤藥物的開發(fā)提供了新思路。