本發(fā)明屬于固定化酶，具體涉及一種磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近幾十年來(lái)，有機(jī)磷農(nóng)藥由于其優(yōu)異的殺蟲功效被廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和畜牧業(yè)中。有機(jī)磷化合物的多余和不合理的使用，對(duì)環(huán)境和食物鏈造成了巨大的危害。開發(fā)高效、環(huán)保的凈化解決方案是一項(xiàng)長(zhǎng)期挑戰(zhàn)。處理有機(jī)磷污染物的方法包括堿水解、焚燒和填埋處理。然而這些方法效率低下，會(huì)產(chǎn)生有毒的副產(chǎn)品。生物酶法安全、高效、綠色環(huán)保、操作條件溫和，顯示出潛在的應(yīng)用前景。目前酶法降解去除環(huán)境中的有機(jī)磷化合物越來(lái)越受到關(guān)注。然而，由于游離酶的生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性低和可重用性差，實(shí)際應(yīng)用受到限制。固定化酶可以提高酶的穩(wěn)定性和重用性。目前已有多種支撐材料用于固定化有機(jī)磷水解酶，如尼龍，纖維素，碳納米管，金屬有機(jī)框架，和氧化石墨烯等。然而，這些固定化酶雖然提高了酶的穩(wěn)定性，但是降低了酶的催化活性。2012年，戈鈞的團(tuán)隊(duì)意外發(fā)現(xiàn)了以cu2+為無(wú)機(jī)成分，酶為有機(jī)組分通過(guò)自組裝的形式會(huì)形成花狀納米復(fù)合材料。當(dāng)一種酶被用作雜化納米花的有機(jī)成分時(shí)，它表現(xiàn)出比游離酶更高的酶活性和穩(wěn)定性。從那時(shí)起，包括漆酶、脂肪酶、辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶等在內(nèi)的多種酶已被報(bào)道用于制備雜化納米花，并顯示出良好的催化能力。雜化納米花的大比表面積、降低的傳質(zhì)限制以及納米酶分子的協(xié)同作用被認(rèn)為是其具有良好性能的原因。目前，各種酶類，還有dna，蛋白質(zhì)和植物提取物作為有機(jī)組分用來(lái)合成雜化納米花催化劑。但傳統(tǒng)雜化納米花的合成存在機(jī)械強(qiáng)度低、制備時(shí)間長(zhǎng)、有效重復(fù)使用次數(shù)低、分離過(guò)程繁瑣等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中需要解決。一般來(lái)說(shuō)，酶-無(wú)機(jī)雜化納米花的可重復(fù)使用性差與其機(jī)械強(qiáng)度較弱有關(guān)，雜化納米花在使用或離心回收過(guò)程中花瓣結(jié)構(gòu)容易破碎。

2、因此，如何亟需開發(fā)一種有效的合成方法來(lái)提高雜化納米花體系的魯棒性，同時(shí)保持高的催化活性和高效的回收性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所制備的磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的催化活性高、機(jī)械強(qiáng)度好，具備高效的回收性。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：

4、(1)制備磁性復(fù)合微球：將fe3o4分散于tris-hcl緩沖液中，得到磁粉懸液，再加入鹽酸多巴胺和聚乙烯亞胺，經(jīng)超聲、振蕩孵育后，得到磁性復(fù)合微球fe3o4-pda@pei；

5、(2)制備磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花：將磷酸三酯酶酶液加入磷酸鹽緩沖溶液中，再加入cocl2溶液和磁性復(fù)合微球fe3o4-pda@pei進(jìn)行孵育完成自組裝，然后加入戊二醛溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花。

6、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述tris-hcl緩沖液的濃度為10-50mmol/l，ph為7.0-10.0；所述tris-hcl緩沖液的用量為確保fe3o4的濃度為40-60g/l。

7、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述鹽酸多巴胺與fe3o4的質(zhì)量比為1：5；所述聚乙烯亞胺與fe3o4的質(zhì)量比為1：5。

8、進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述超聲的功率為50-200w，時(shí)間為3-9min；所述振蕩孵育的溫度為20-35℃，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，時(shí)間為4-8h。

9、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述磷酸三酯酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述磷酸三酯酶的比酶活為6.45u/mg；所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10-40mmol/l，ph為7.0-10.0；所述磷酸三酯酶在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.1-0.15mg/ml；所述cocl2在磷酸鹽緩沖液中的濃度為2-5mmol/l；所述磁性復(fù)合微球fe3o4-pda@pei在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.5-2g/l。

10、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述超聲孵育的溫度為35-40℃，時(shí)間為2-12h。

11、進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述戊二醛在磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.1-0.15％；所述反應(yīng)的時(shí)間為0.5-2.5h。

12、一種所述制備方法制備的磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花。

13、一種所述磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的應(yīng)用，所述磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥。

14、進(jìn)一步地，所述有機(jī)磷農(nóng)藥包括甲基對(duì)硫磷、殺螟磷、毒死蜱、乙硫磷。

15、本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

16、本發(fā)明提供了一種磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的制備方法，將多巴胺和聚乙烯亞胺修飾的磁性納米顆粒和磷酸三酯酶雜化納米花結(jié)合，隨后通過(guò)戊二醛交聯(lián)，得到的磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花可以快速的和反應(yīng)液分離，更好的重復(fù)利用，且具有更好的ph穩(wěn)定性與溫度穩(wěn)定性。通過(guò)磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的高比表面積，以及鈷離子的激活作用，顯著提升酶活性。

17、本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化了磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的制備條件，得到磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花最佳制備條件為：磷酸三酯酶濃度為0.1mg/ml，co2+濃度為2mmol/l，磁性復(fù)合微球的質(zhì)量為0.5mg，孵育溫度為37℃，戊二醛濃度為0.1％以及固定化時(shí)間為6h時(shí)，在最佳條件下制備的磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的酶活能夠達(dá)到游離酶的298％。

18、本發(fā)明制備的磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花在溫度，ph和有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性都明顯高于游離酶。室溫儲(chǔ)存30天，游離酶的活性基本消失，而磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的相對(duì)活性為84.8％。此外，磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花在重復(fù)使用五次后仍能保持90.32％的相對(duì)活性。

19、本發(fā)明將磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花應(yīng)用到甲基對(duì)硫磷，殺螟磷，毒死蜱和乙硫磷的降解實(shí)驗(yàn)中。當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥濃度為100mg/l，酶濃度0.02mg/ml，溫度40℃，反應(yīng)時(shí)間1h。磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花對(duì)四種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率分別為99％，96％，92％和85％，均明顯高于游離酶。

技術(shù)特征：

1.一種磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述tris-hcl緩沖液的濃度為10-50mmol/l，ph為7.0-10.0；所述tris-hcl緩沖液的用量為確保fe3o4的濃度為40-60g/l。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述鹽酸多巴胺與fe3o4的質(zhì)量比為1：5；所述聚乙烯亞胺與fe3o4的質(zhì)量比為1：5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述超聲的功率為50-200w，時(shí)間為3-9min；所述振蕩孵育的溫度為20-35℃，轉(zhuǎn)速為150-250rpm，時(shí)間為4-8h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述磷酸三酯酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；所述磷酸三酯酶的比酶活為6.45u/mg；所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度為10-40mmol/l，ph為7.0-10.0；所述磷酸三酯酶在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.1-0.15mg/ml；所述cocl2在磷酸鹽緩沖液中的濃度為2-5mmol/l；所述磁性復(fù)合微球fe3o4-pda@pei在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.5-2g/l。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述超聲孵育的溫度為35-40℃，時(shí)間為2-12h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述戊二醛在磷酸鹽緩沖溶液的濃度為0.1-0.15％；所述反應(yīng)的時(shí)間為0.5-2.5h。

8.一種權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述制備方法制備的磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花。

9.一種權(quán)利要求8所述磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花的應(yīng)用，其特征在于，所述磷酸三酯酶-交聯(lián)磁性雜化納米花用于降解有機(jī)磷農(nóng)藥。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述有機(jī)磷農(nóng)藥包括甲基對(duì)硫磷、殺螟磷、毒死蜱、乙硫磷。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種磷酸三酯酶?交聯(lián)磁性雜化納米花及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明中磷酸三酯酶?交聯(lián)磁性雜化納米花的制備方法是將磷酸三酯酶加入到磷酸鹽緩沖溶液中，然后加入CoCl<subgt;2</subgt;溶液和合成的磁性復(fù)合微球Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;?PDA@PEI，放置在一定溫度下孵育，隨后添加戊二醛進(jìn)行反應(yīng)，得到磷酸三酯酶?交聯(lián)磁性雜化納米花。本發(fā)明所制備的磷酸三酯酶?交聯(lián)磁性雜化納米花的活性較高，對(duì)甲基對(duì)硫磷、殺螟磷、毒死蜱和乙硫磷具有優(yōu)異的降解性能，并且回收方便，具有良好的酸堿穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，重復(fù)使用仍具備較高活性。本發(fā)明所制備的磷酸三酯酶?交聯(lián)磁性雜化納米花的催化活性高、機(jī)械強(qiáng)度好，具備高效的回收性。

技術(shù)研發(fā)人員：張梁,陳劍雄,辛瑜,郝夢(mèng)瑤,顧正華,郭自濤,朱瑞
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19