本發(fā)明屬于基因工程，具體地說，涉及一種蒺藜苜蓿葉片發(fā)育蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物生物量是重要的生產(chǎn)性狀，葉片大小是評價植物生物量的重要指標，直接影響了植物的產(chǎn)量，而高生物產(chǎn)量是作物育種的關(guān)鍵目標性狀。葉片是植物進行光合作用的主要器官，葉片面積大小直接影響植物的光截獲能力，對植物生長發(fā)育以及產(chǎn)量性狀的建成具有重要作用。因此，研究葉片發(fā)育過程對于作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種具有重要意義。

2、豆科植物不僅是人類食物中蛋白質(zhì)的主要來源，也是重要的飼料和油料作物。蒺藜苜蓿（ medicago?truncatula）屬于豆科苜蓿屬一年生植物，是繼擬南芥和水稻基因組測序完成后又一個大規(guī)?；蚪M測序的植物。蒺藜苜蓿子葉出土后第一片真葉為單葉，繼續(xù)生長展開三出羽狀復(fù)葉，直至完成整個生命周期。這一過程需要細胞增殖和細胞擴張兩者間的平衡，同時還受到光照條件、植物激素和小分子rna的調(diào)控。在過去的研究中，已經(jīng)鑒定出許多基因組成了復(fù)雜了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與葉片生長發(fā)育及植株的形態(tài)建成。由于植物葉片生長發(fā)育的調(diào)控需要不同類型基因的協(xié)調(diào)完成，豆科植物葉片發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因的功能研究對于有效提升植物產(chǎn)量至關(guān)重要。因此，有必要提供一種植物葉片發(fā)育控制基因及其編碼的蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種蒺藜苜蓿葉片發(fā)育蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種蛋白質(zhì)，其來源于蒺藜苜蓿（ medicago? truncatula），名稱為mtpif4，所述mtpif4蛋白質(zhì)為a1）或a2）或a3）或a4）中任一種：

3、a1）氨基酸序列是seq?id?no.2所示的蛋白質(zhì)；

4、a2）在seq?id?no.2所示的蛋白質(zhì)的n端或/和c端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；

5、a3）將seq?id?no.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；

6、a4）與seq?id?no.2所示的氨基酸序列具有90%同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。

7、上述a2）所述的蛋白質(zhì)中，所述標簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化。所述標簽可為flag標簽、his標簽、mbp標簽、ha標簽、myc標簽、gst標簽和/或sumo標簽等。

8、上述a3）所述的蛋白質(zhì)中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過9個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過8個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過7個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過6個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過5個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過4個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過3個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過2個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加或不超過1個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

9、上述a4）所述的蛋白質(zhì)中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性?？墒褂脟H互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點測定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambdaratio分別設(shè)置為11，1和0.85（缺省值）并進行檢索1對氨基酸序列的同一性進行計算，然后即可獲得同一性的值（%）。所述同一性包括與本發(fā)明seq?id?no.2所示的氨基酸序列具有90%或更高，或91%或更高，或92%或更高，或93%或更高，或94%或更高，或95%或更高，或96%或更高，或97%或更高，或98%或更高，或99%或更高同源性的氨基酸序列。

10、上述a1）或a2）或a3）或a4）所述的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

11、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明又提供了與上述mtpif4蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。

12、本發(fā)明提供的與上述mtpif4蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為編碼上述mtpif4蛋白質(zhì)的核酸分子或含有所述核酸分子的表達盒、重組載體或重組微生物。

13、上述生物材料中，所述核酸分子為如下b1）或b2）所示的基因：

14、b1）seq?id?no.1或seq?id?no.3所示的dna分子；

15、b2）與b1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼上述mtpif4蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的dna分子。

16、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

17、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼mtpif4蛋白質(zhì)的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼mtpif4蛋白質(zhì)的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼mtpif4蛋白質(zhì)且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。

18、這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼seq?id?no.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。

19、上述75%或75%以上同一性，可為80%、85%、90%或95%以上的同一性。

20、上述生物材料中，所述表達盒是指能夠在宿主細胞中表達mtpif4蛋白質(zhì)的dna，該dna不但可包括啟動 mtpif4轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止 mtpif4轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動子及誘導(dǎo)型啟動子。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子（nos終止子）、花椰菜花葉病毒camv?35s終止子、tml終止子、豌豆rbcse9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子。

21、上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述重組載體可為利用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有 mtpif4基因表達盒的載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)（ti）質(zhì)粒基因（如胭脂堿合成酶基因 nos）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（ gus基因、螢光素酶基因等）、抗生素的標記基因（如賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的 nptii基因，賦予對除草劑膦絲菌素抗性的 bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的 hph基因，和賦予對氨甲喋呤抗性的 dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的epsps基因）或是抗化學(xué)試劑標記基因等（如抗除莠劑基因）、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

22、在一些實施方案中，所述重組載體可為重組質(zhì)粒35s: mtpif4cds-gfp。所述重組質(zhì)粒35s: mtpif4cds-gfp為將pcambia1300-35s:gfp載體的 kpni和 sali酶切位點之間的dna片段替換為序列表中seq?id?no.1所示的dna分子，且保持pcambia1300-35s:gfp載體的其他序列不變后得到的質(zhì)粒。

23、上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。所述重組微生物是指對目的微生物的基因進行操作和修飾，從而得到功能發(fā)生變化的重組微生物。如將上述重組載體導(dǎo)入目的微生物后得到的重組微生物。所述重組微生物可理解為不僅是指特定的重組微生物，而且也指這種細胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的親代細胞完全一致，但仍包括在重組微生物的范圍中。

24、在一些實施方案中，所述重組微生物為含有上述重組質(zhì)粒35s: mtpif4cds-gfp的農(nóng)桿菌eha105。

25、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了上述mtpif4蛋白質(zhì)或生物材料的新用途。

26、本發(fā)明提供了上述mtpif4蛋白質(zhì)或生物材料在如下1）-6）中的應(yīng)用：

27、1）調(diào)控植物葉片發(fā)育；

28、2）調(diào)控植物株高；

29、3）調(diào)控植物分枝數(shù)；

30、4）調(diào)控植物莖粗；

31、5）培育葉片變大和/或株高增加和/或分枝數(shù)增加和/或莖粗變粗的轉(zhuǎn)基因植物；

32、6）植物育種。

33、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物葉片發(fā)育包括調(diào)控植物葉片大小和/或葉片單個細胞大小和/或單個葉片所含細胞數(shù)。所述調(diào)控植物葉片發(fā)育的方式為正向調(diào)控，即：植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性提高，植物葉片變大、葉片單個細胞變大、單個葉片所含細胞數(shù)增加；植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性降低或缺失，植物葉片變小、葉片單個細胞變小、單個葉片所含細胞數(shù)減少。

34、在一些實施方案中，所述調(diào)控植物葉片發(fā)育為促進植物葉片發(fā)育，具體體現(xiàn)為當植物中 mtpif4基因表達量提高時，植物葉面積變大、葉片單個細胞面積變大、單個葉片所含細胞數(shù)增加。

35、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物株高的方式為正向調(diào)控，即：植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性提高，植物株高增加；植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性降低或缺失，植物株高降低。

36、在一些實施方案中，所述調(diào)控植物株高為增加植物株高，具體體現(xiàn)為即當植物中 mtpif4基因表達量提高時，植物株高增加。

37、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物分枝數(shù)的方式為正向調(diào)控，即：植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性提高，植物分枝數(shù)增加；植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性降低或缺失，植物分枝數(shù)降低。

38、在一些實施方案中，所述調(diào)控植物分枝數(shù)為增加植物分枝數(shù)，具體體現(xiàn)為即當植物中 mtpif4基因表達量提高時，植物主莖分枝數(shù)增加。

39、上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物莖粗的方式為正向調(diào)控，即：植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性提高，植物莖粗增加；植物中mtpif4蛋白質(zhì)含量和/或活性降低或缺失，植物莖粗降低。

40、在一些實施方案中，所述調(diào)控植物莖粗為增加植物莖粗，具體體現(xiàn)為即當植物中 mtpif4基因表達量提高時，植物主莖粗增加。

41、上述應(yīng)用中，所述植物育種的目的為培育葉片變大和/或株高增加和/或分枝數(shù)增加和/或莖粗變粗的植物品種。

42、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明最后提供了一種培育葉片變大和/或株高增加和/或分枝數(shù)增加和/或莖粗變粗的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

43、本發(fā)明提供的培育葉片變大和/或株高增加和/或分枝數(shù)增加和/或莖粗變粗的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括如下步驟：提高受體植物中mtpif4蛋白質(zhì)的含量和/或活性，得到葉片變大和/或株高增加和/或分枝數(shù)增加和/或莖粗變粗的轉(zhuǎn)基因植物。

44、上述方法中，所述葉片變大體現(xiàn)為所述轉(zhuǎn)基因植物的葉面積和/或葉片單個細胞面積和/或單個葉片所含細胞數(shù)大于所述受體植物。

45、上述方法中，所述提高受體植物中mtpif4蛋白質(zhì)的含量和/或活性的方法為在受體植物中過表達上述mtpif4蛋白質(zhì)。

46、進一步的，所述過表達的方法為將mtpif4蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w植物中。

47、更進一步的，所述蛋白質(zhì)的編碼基因序列如序列表中seq?id?no.1所示。

48、上述任一所述應(yīng)用或方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述 mtpif4基因轉(zhuǎn)化受體植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。

49、上述任一所述應(yīng)用或方法中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。

50、進一步的，所述雙子葉植物為豆科植物。

51、再進一步的，所述豆科植物為苜蓿屬植物。

52、更進一步的，所述苜蓿屬植物為苜蓿（如蒺藜苜蓿生態(tài)型r108）。

53、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得以下技術(shù)效果：

54、1、本發(fā)明在蒺藜苜蓿中克隆了一個可以促進細胞生長、增大葉片面積、促進分枝、增加植株高度和莖粗的基因，該基因首次在蒺藜苜蓿中被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控葉片發(fā)育、分枝、株高和莖粗，為牧草種質(zhì)資源創(chuàng)新研究工作提供研究基礎(chǔ)。

55、2、本發(fā)明中克隆的基因也可以為蒺藜苜蓿等豆科作物以及其他雙子葉植物的葉片發(fā)育的相關(guān)基因研究提供證據(jù)。

56、本發(fā)明首先從蒺藜苜蓿r108中經(jīng)過序列分析后克隆出與植物葉片發(fā)育相關(guān)的 mtpif4基因，然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將 mtpif4基因在蒺藜苜蓿中過表達，并且鑒定篩選出穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn) mtpif4蒺藜苜蓿株系，最后通過對轉(zhuǎn) mtpif4蒺藜苜蓿株系表型分析發(fā)現(xiàn)：與野生型r108相比，轉(zhuǎn) mtpif4蒺藜苜蓿株系出現(xiàn)明顯的葉片變大、主莖變粗、分枝數(shù)增多和株高增加的表型。本發(fā)明為研究 mtpif4基因在植物中調(diào)控葉片發(fā)育打下理論基礎(chǔ)。