本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

1、番木瓜（carica?papaya?l.）是番木瓜科番木瓜屬植物，原產(chǎn)熱帶美洲，自明清時(shí)期傳入中國，至今已在我國南方熱帶及亞熱帶地區(qū)多地種植，是一種用途廣泛的熱帶草本果樹，其果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值高、富含蛋白酶，既可做水果鮮食，又可作工業(yè)提取與加工，被廣泛應(yīng)用與食品、藥品等多個(gè)行業(yè)。

2、炭疽病是一種常見的植物病害，番木瓜炭疽病病原為炭疽菌（colletotrichumsp.），侵染植物后可使植物組織壞死，癥狀表現(xiàn)為深褐色凹陷病斑，莖葉與果實(shí)均可發(fā)病。番木瓜炭疽病是番木瓜重要采后病害，造成番木瓜產(chǎn)量下降、果實(shí)病變等問題，對番木瓜產(chǎn)業(yè)有極大危害，因而番木瓜品種的炭疽病抗性對番木瓜引種、生產(chǎn)和布局十分重要。番木瓜不同的品種具備不同的炭疽病抗性，在引種和作物布局工作上需要對此進(jìn)行考慮，而依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征對番木瓜種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分較為困難，因而不同炭疽病抗性品種的分子生物學(xué)鑒別方法十分重要。

3、分子鑒定技術(shù)是一種基于生物基因組差異進(jìn)行分子水平信息鑒定的技術(shù)，相比于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征鑒定的主觀性、復(fù)雜性，分子鑒定技術(shù)可以將物種間的區(qū)別以序列數(shù)據(jù)的形式可觀化、簡單化，以更為高效地獲得更加可靠的鑒定結(jié)果。

4、葉綠體基因組（cpdna）分子標(biāo)記在植物科學(xué)領(lǐng)域中具有重要意義，特別是在系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化生物學(xué)、物種鑒定、種群遺傳學(xué)以及生態(tài)學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等方面。葉綠體基因組通常是單一的環(huán)形分子，大小在120-160?kb范圍內(nèi)，包含一系列編碼光合作用、電子傳遞和其他生物合成途徑的基因，其具有高度的遺傳穩(wěn)定性、低重組率和母體遺傳特性。這些特點(diǎn)使得葉綠體基因組成為高效和可靠的分子標(biāo)記，能夠提供高解析度的信息，特別適用于解析疏遠(yuǎn)親緣關(guān)系的植物和評(píng)估種群結(jié)構(gòu)、基因流以及歷史動(dòng)態(tài)。通過比較不同物種或種群的葉綠體基因組，研究人員可以更深入地了解植物如何適應(yīng)各種生態(tài)環(huán)境以及背后的演化機(jī)制，從而為生物多樣性保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

5、本研究對番木瓜多個(gè)品種的葉綠體基因組測序、組裝、分析，獲取了在炭疽病抗性方面具有差異的多個(gè)番木瓜品種的葉綠體基因組差異位點(diǎn)，以此開發(fā)分子標(biāo)記探針，區(qū)分番木瓜炭疽病不同抗性的品種。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針，所述dna探針的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

2、其中，所述dna探針上標(biāo)記有示蹤標(biāo)記。

3、其中，所述示蹤標(biāo)記為同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記。

4、其中，所述非同位素標(biāo)記為酶或有色基團(tuán)。

5、其中，所述番木瓜炭疽病抗性品種為大青、紅妃和臺(tái)農(nóng)，所述番木瓜炭疽病非抗性品種為廣蜜、紅鈴、桂熱和瓊海黃。

6、一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的方法，包括如下步驟：

7、s1提取待測植物的葉綠體基因組dna，所述待測植物為番木瓜，所述番木瓜品種選自大青、紅妃、臺(tái)農(nóng)、廣蜜、紅鈴、桂熱和瓊海黃；

8、s2以該植物的葉綠體基因組為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，使用前述的dna探針檢測葉綠體特異性基因是否存在；

9、s3若葉綠體特異性基因不存在，則判斷該植物為番木瓜炭疽病抗性品種，所述番木瓜炭疽病抗性品種為大青、紅妃和臺(tái)農(nóng)。

10、一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的試劑盒，試劑盒包括前述的dna探針。

11、本發(fā)明根據(jù)番木瓜各品種的葉綠體基因組序列對齊結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異位點(diǎn)，其中60?kb附近區(qū)域存在一段差異位點(diǎn)。通過這一個(gè)位點(diǎn)，我們可以區(qū)分不同炭疽病抗性的番木瓜品種，為分子標(biāo)記的理想位點(diǎn)。我們截取了差異位點(diǎn)的上下游約250?bp的序列作為參考序列選取同源序列設(shè)計(jì)引物，番木瓜各品種樣品的dna作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在7個(gè)模板中均能擴(kuò)增出單一明亮、與預(yù)期大小一致的條帶，證明對葉綠體基因組序列分析得到的差異位點(diǎn)片段存在且可進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定。

12、對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測序，并將測序結(jié)果進(jìn)行比對，比對結(jié)果證實(shí)在此位點(diǎn)存在一個(gè)8?bp的差異位點(diǎn)能夠?qū)⒉煌烤也】剐缘姆竟掀贩N區(qū)分開，依據(jù)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了寡核苷酸熒光探針，可應(yīng)用rpa（recombinase?polymerase?amplification）等分子生物學(xué)方法對番木瓜葉片組織進(jìn)行檢測，通過是否存在熒光信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)其分子鑒定，以此能夠高效區(qū)分番木瓜不同炭疽病抗性的品種。

技術(shù)特征：

1.一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針，其特征在于，所述dna探針的核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針，其特征在于，所述dna探針上標(biāo)記有示蹤標(biāo)記。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針，其特征在于，所述示蹤標(biāo)記為同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針，其特征在于，所述非同位素標(biāo)記為酶或有色基團(tuán)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的dna探針，其特征在于，所述番木瓜炭疽病抗性品種為大青、紅妃和臺(tái)農(nóng)，所述番木瓜炭疽病非抗性品種為廣蜜、紅鈴、桂熱和瓊海黃。

6.一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的方法，其特征在于，包括如下步驟：

7.一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的試劑盒，其特征在于，試劑盒包括如權(quán)利要求1-5任一所述的dna探針。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種區(qū)分番木瓜炭疽病抗性品種的DNA探針、試劑盒及方法，DNA探針的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。根據(jù)番木瓜各品種的葉綠體基因組序列對齊結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了多個(gè)差異位點(diǎn)，其中60?kb附近區(qū)域存在一段差異位點(diǎn)。通過這一個(gè)位點(diǎn)，我們可以區(qū)分不同炭疽病抗性的番木瓜品種，為分子標(biāo)記的理想位點(diǎn)。我們截取了差異位點(diǎn)的上下游約250?bp的序列作為參考序列選取同源序列設(shè)計(jì)引物，番木瓜各品種樣品的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在7個(gè)模板中均能擴(kuò)增出單一明亮、與預(yù)期大小一致的條帶，證明對葉綠體基因組序列分析得到的差異位點(diǎn)片段存在且可進(jìn)行擴(kuò)增和鑒定，依據(jù)該位點(diǎn)設(shè)計(jì)了寡核苷酸熒光探針。

技術(shù)研發(fā)人員：孔華,郭靜遠(yuǎn),郝志剛,郭安平,賈瑞宗,郭運(yùn)玲,徐嘉擎,于鋮儇
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/5