專利名稱:一種三嗪類除草劑殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種三嗪類除草劑殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域：
，是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
二、技術(shù)背景化學(xué)農(nóng)藥的使用大大地促進(jìn)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)挽回了大量因病蟲草害等原因造成的損失，并極大地提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的勞動(dòng)效率和機(jī)械化程度，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)代化進(jìn)程中起了不可估量的作用。但同時(shí)農(nóng)藥都是一些有毒有害化學(xué)物質(zhì)，它們進(jìn)入生態(tài)環(huán)境后，不僅殺死了對(duì)人類有害的生物，同時(shí)也對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的危害。農(nóng)藥的大量使用引起農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響了人民的身體健康及農(nóng)產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。隨著人們生活水平的提高和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，全社會(huì)對(duì)農(nóng)藥殘留帶來的直接危害和潛在影響亦愈來愈關(guān)注，人們迫切需要無農(nóng)藥殘留污染的清潔的綠色農(nóng)產(chǎn)品。但從目前我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形式和人口狀況來看，以停止農(nóng)藥使用降低農(nóng)業(yè)產(chǎn)量為代價(jià)的無公害生產(chǎn)模式是行不通的，農(nóng)藥作為控制病蟲害的有效手段還將繼續(xù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮巨大的作用。如何能解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的這個(gè)兩難問題就成為各個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室和實(shí)際應(yīng)用研究都表明利用微生物來降解消除土壤中的農(nóng)藥殘留“庫(kù)”容量，從而降低糧食、蔬菜、茶葉等農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留，提高農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值是可行的?，F(xiàn)有技術(shù)中本課題組已擁有降解菌的發(fā)明專利(ZL96106317.3，公開號(hào)CN1145408A，
公開日1997年3月19日)，該專利是一株芽胞桿菌J5，能有效地降解甲胺磷，但該菌株降解譜窄，僅能降解甲胺磷一種農(nóng)藥，從而使用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，開發(fā)研制出一種新型的農(nóng)藥殘留降解菌劑，使用本菌劑可以使阿特拉津、西瑪津、特丁津等有三嗪類除草劑的殘留量降低90％以上。具有較廣的降解譜，生產(chǎn)和使用成本較低。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。
技術(shù)方案 下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明提供一種消除有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌，其菌株BTAH1是一株革蘭氏染色反應(yīng)陽(yáng)性菌(2004年3月17日已寄存于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)1113)，經(jīng)鑒定屬微小桿菌屬(分類地位屬于Exiguobaterium sp.)。主要生物學(xué)特性為G+，菌體為不規(guī)則桿狀，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，無鞭毛，兼性厭氣；接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性；能水解淀粉，還原硝酸鹽，能以阿特拉津?yàn)槲ㄒ惶荚?、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無機(jī)化合物。該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為AY205564。利用葡萄糖、乳糖、果糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、半乳糖。最適生長(zhǎng)溫度30℃。該菌還能以阿特拉津、西瑪津、特丁津?yàn)槲ㄒ惶荚催M(jìn)行生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)條件下阿特拉津的降解率達(dá)98％以上(圖1)。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
使用上述有機(jī)磷農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種—搖瓶種—種子罐—生產(chǎn)罐—產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)。
本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施步驟為1)將有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌BTAH1的試管種接種于1/10LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.8％，(NH4)2SO41％，K2HPO40.2％，MgSO40.05％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。
3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同。
在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35℃，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液即為菌劑。
有益效果使用該發(fā)明生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑具有生產(chǎn)使用成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。降解菌BTAH1具有較廣的降解譜，能使土壤中阿特拉津的殘留量降低95％以上(圖2)，并對(duì)西瑪津、特丁津也有一定的降解效果。大大降低了生產(chǎn)和使用過程中的工作量，降低了生產(chǎn)和使用成本。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量符合綠色食品要求。
田間試驗(yàn)表明，用本發(fā)明生產(chǎn)的降解菌劑直接施用于土壤，可使作物中農(nóng)藥殘留量降低95％以上(圖3)。本發(fā)明成功地解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)和除草劑藥害問題，既充分發(fā)揮了化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲草害防治中的高效快速的作用，又可以生產(chǎn)出無毒無公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
四、


圖1降解菌BTAH1在搖瓶中對(duì)阿特拉津的降解情況圖2不同濃度的降解菌BTAH1在土壤中對(duì)阿特拉津的降解情況圖3阿特拉津和降解菌BTAH1的使用對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響五具體實(shí)施方式
以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。
將本發(fā)明的微生物有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的降解菌BTAH1的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測(cè)定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml肉湯培養(yǎng)基1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.8％，(NH4)2SO41％，K2HPO40.2％，MgSO40.05％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完畢后121℃高壓濕熱滅菌，冷卻至33℃后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1∶0.8。將到達(dá)對(duì)數(shù)期的種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后的生產(chǎn)罐1.1kg/cm2的壓力下，121℃高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至35℃以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30-35℃，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1∶0.8-1.0，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。
發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
1、搖瓶降解實(shí)驗(yàn)在以阿特拉津(1000mg/L)為唯一氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，按5％的接種BTAH1，于30℃振蕩培養(yǎng)，由圖1中可以看出，在接種后第68小時(shí)，吸收峰就開始下降，培養(yǎng)基中的阿特拉津已經(jīng)被降解了1/3左右，到126小時(shí)已經(jīng)被完全降解。
2、土壤降解實(shí)驗(yàn)土壤降解試驗(yàn)初始阿特拉津濃度為50mg/Kg土，分為三組施用104個(gè)/克土的降解菌，記為T1，施用106個(gè)/克土的降解菌，記為T2，施用108個(gè)/克土的降解菌，記為T3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2)，60天后，所有處理均可以降解95％以上的阿特拉津；7天以后，T3中95％的阿特拉津已經(jīng)被降解。通過阿特拉津敏感作物藥害消除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖3)，使用108個(gè)/克土的降解菌處理7天后的土壤再種植敏感作物小麥，已經(jīng)基本不發(fā)生藥害現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陽(yáng)性的微小桿菌屬(Exiguobacterium sp.)的菌株BTAH1，2004年3月17日寄存于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.1113，主要生物學(xué)特性為G+，菌體為不規(guī)則桿狀，大小0.7～1.2×2.0～4.0μm，無鞭毛，兼性厭氣；接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陰性；能水解淀粉，還原硝酸鹽，能以阿特拉津進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無機(jī)化合物，該菌株16S rDNA的Genbank登陸號(hào)為AY205564。
2.一種用權(quán)利要求
1所述的農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑，是通過以下方法生產(chǎn)而成1)試管種接種于1/10 LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.8％，(NH4)2SO41％，K2HPO40.2％，MgSO40.05％，NaCl 0.01％，CaCO30.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5；3)種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30-35℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。
專利摘要
本發(fā)明提供一種消除三嗪除草劑殘留的降解菌劑，所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陽(yáng)性菌BTAH1，經(jīng)鑒定為微小桿菌屬(Exiguobacterium sp.)。主要生物學(xué)特性為G
文檔編號(hào)C12N1/20GKCN1584018SQ200410044952
公開日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月7日
發(fā)明者李順鵬, 胡江, 崔中利, 代先祝, 何健 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan