專利名稱:一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法。
背景技術(shù)：
石蒜屬(Lycoris Herb.)植物是石蒜科(Amaryllidaceae)中的一個(gè)重要屬，為多 年生草本植物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，其在全世界約有20多種，主要分布于東亞的暖溫帶 至亞熱帶。石蒜中含有大量生物堿。國(guó)外科學(xué)家在20世紀(jì)初就提取分離出大量生物 堿。如Lycorine (石蒜堿)，tazettine (多花水仙堿)，homolycorine (高石蒜堿)，力口可 拉敏(lycoramine)，石蒜倫堿(lycorenine)，偽石蒜堿(pseudlycorine)，去甲普魯維因 (norpluviine),表力口蘭力口敏(epigalanthamine)，維他廷(vittatine)，普魯維因(pluviine)， 小星蒜堿(hippeastrine)等生物堿。
我國(guó)科技相對(duì)落后，到了 20世紀(jì)50年代才開(kāi)展石蒜生物堿的研究，也取得了一 定成果。如洪山海、馬廣恩等對(duì)我國(guó)石蒜也進(jìn)行了植物化學(xué)及藥理方面的研究，并從中 分離出新的化合物紫花石蒜堿(squamigerine)。
現(xiàn)代藥理研究和臨床表明，石蒜生物堿具有多種生物活性和療效加蘭他敏是 治療老年期癡呆癥、小兒麻痹后遺癥及重癥肌無(wú)力的特效藥，對(duì)癡呆患者和腦器質(zhì)性病 變引起的記憶障礙亦有改善作用；石蒜堿具有抗阿米巴原蟲、抗癌、降壓、催吐、祛 痰、解痙，比嗎啡強(qiáng)5倍的鎮(zhèn)痛作用、比阿司匹林也有更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用。其衍生物石 蒜堿內(nèi)銨鹽用于治療消化道癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、頭頸部癌、惡性淋巴瘤等，其中 對(duì)胃癌、卵巢癌療效較好；力可拉敏用于脊髓灰質(zhì)炎后遺癥性癱瘓，腦血管意外所致的 偏癱，坐骨神經(jīng)炎；多花水仙堿具有擬膽堿樣作用，對(duì)吉田肉瘤的生長(zhǎng)具有很好抑制作 用。
目前，現(xiàn)有技術(shù)中以石蒜為原料，經(jīng)過(guò)煩瑣的提取分離純化步驟，只生產(chǎn)一種 石蒜生物堿單體產(chǎn)品而廢棄富含其它寶貴活性成分的生物堿，沒(méi)有充分利用石蒜資源， 并且生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)率收率不高、產(chǎn)品遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到藥用級(jí)的高純度要求。中國(guó)專利文獻(xiàn)
“一種石蒜氫溴酸加蘭他敏酸水浸提生物堿提取方法及工藝”(公開(kāi)號(hào)CN1569856，公開(kāi) 日為2005.01.26)中大量使用酸提取，生產(chǎn)過(guò)程中使用大量酸堿，排放大量廢酸廢堿，嚴(yán) 重污染環(huán)境，不利于產(chǎn)業(yè)化；“從石蒜粗提物中分離高純度加蘭他敏的方法”(公開(kāi)號(hào) CN1490319,
公開(kāi)日為2004.04.21)中的工藝中大量使用有機(jī)溶劑，生產(chǎn)安全系數(shù)低，成 本高，工業(yè)化生產(chǎn)受到限制；中國(guó)專利文獻(xiàn)“從石蒜或雪花蓮屬原料中提取加蘭他敏的 方法”(公開(kāi)號(hào)CN1696131，
公開(kāi)日為2005.11.16)中所用儀器價(jià)格昂貴、處理量小、需 要高級(jí)技術(shù)人員才能操作，不適宜放大生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化受到限制；并且大多數(shù)工藝都只得 到單一產(chǎn)品，造成資源浪費(fèi)。如“從石蒜粗提物中分離高純度加蘭他敏的方法”、“從 石蒜粗提物中分離高純度加蘭他敏的方法”、“一種石蒜氫溴酸加蘭他敏樹脂吸附除雜 方法及工藝”和“從石蒜屬植物中提取力可拉敏的工藝方法”等專利文獻(xiàn)。[0006]總之，現(xiàn)有以石蒜為原料生產(chǎn)生物堿的方法存在以下不足產(chǎn)品單一、步驟煩 瑣、周期長(zhǎng)、產(chǎn)品收得率不高、安全系數(shù)低、成本高、石蒜資源利用率不高和環(huán)境污染 嚴(yán)重，以及不易產(chǎn)業(yè)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，該方法產(chǎn) 品收得率高，可以同時(shí)得到多種產(chǎn)品，并且環(huán)境污染低。
本發(fā)明提供的從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，其步驟包括
(1)在切碎后的石蒜屬植物中加入體積為2 10倍量的水，再加入復(fù)合纖維素 酶，復(fù)合纖維素酶與石蒜屬植物的質(zhì)量百分比為0.1 0.5%，調(diào)節(jié)pH值至5 8，在溫 度20 60°C下酶解2 24小時(shí)，再將酶解后石蒜屬植物細(xì)胞破碎，過(guò)濾，得到提取液；
(2)濃縮上述提取液，得到提取物濃縮液，該濃縮液的比重在20°C測(cè)量時(shí)為 1.05 1.15 ；
(3)按pH值分步對(duì)上述提取物濃縮液進(jìn)行萃?。?br>(4)將萃取各步得到的產(chǎn)物以粗產(chǎn)品比填料為1 60 1 5的量分別進(jìn)行柱層 析，再進(jìn)行洗脫；
(5)將柱層析分離得到的相同組分合并，反復(fù)重結(jié)晶，得到多種高純度單體。
本發(fā)明方法對(duì)上述技術(shù)方案進(jìn)行了下述優(yōu)化，
步驟(1)中復(fù)合纖維素酶的組分及質(zhì)量比為纖維素酶40-50 %，果膠酶 30-40%,半纖維素酶20-30%。
步驟(3)按下述過(guò)程進(jìn)行萃取
第一步萃取將提取物濃縮液的pH調(diào)至5 7，加入0.5 3倍體積有機(jī)溶劑 進(jìn)行萃取1 4次，合并有機(jī)溶劑相，減壓回收有機(jī)溶劑得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取將第一步萃取得到的水相調(diào)pH值至7 10，加入0.5 3倍體積 有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取1 4次，合并有機(jī)溶劑相，減壓回收有機(jī)溶劑得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取將第二步萃取得到的水相調(diào)pH值至10 11，加入0.5 3倍體積 有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取1 4次，合并有機(jī)溶劑相，減壓回收有機(jī)溶劑得第三步萃取產(chǎn)物；
萃取用的有機(jī)溶劑為氯仿、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醚和異戊醇中的一 種。
步驟(4)中，柱層析分離用的載體為大孔樹脂、硅藻土、碳18填料、硅膠或氧 化鋁中的一種；層析柱分離用的洗脫液為水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯和乙 醚中的一種或幾種混合。
步驟(5)中重結(jié)晶用的溶劑為水、甲醇、乙醇、氯仿、乙醚、正丙醇和異丙醇 中的一種或幾種混合。
本發(fā)明方法具有以下技術(shù)效果
(1)提取率高，生產(chǎn)步驟簡(jiǎn)單采用生物酶解技術(shù)將植物細(xì)胞壁部分分解，再 利用高速機(jī)械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分與 溶劑充分接觸，使有效成分快速溶解轉(zhuǎn)移，在極短時(shí)間內(nèi)達(dá)到內(nèi)外溶解平衡，既大幅度 提高植物中生物堿的溶出，又避免高溫提取時(shí)的雜質(zhì)溶出，提高生產(chǎn)過(guò)程中的濾過(guò)速度和純化效果，簡(jiǎn)化后續(xù)分離純化步驟。本發(fā)明與傳統(tǒng)提取方法比較，使用酸堿和有機(jī)溶 劑的量大大減少，因而對(duì)環(huán)境無(wú)污染、成本低。
(2)本發(fā)明采用的分段萃取技術(shù)，與以往工藝產(chǎn)品單一不同，根據(jù)pH的不同將 提取物分成3段，至少得到3種主要產(chǎn)品，綜合利用石蒜，大大提高了經(jīng)濟(jì)作物石蒜的價(jià)值。
(3)本發(fā)明產(chǎn)品純度高加蘭他敏純度達(dá)到99.5%、力可拉敏純度達(dá)到99%以 上，多花水仙堿純度可達(dá)99%，達(dá)到藥用要求，或可制備藥用其衍生物。
具體實(shí)施方式
下面舉例加以說(shuō)明，這些實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明方法的進(jìn)一步詳細(xì)描述，并不意 味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。
實(shí)施例1
(1)提取
取10kg干石蒜片，30kg水溶液，于多功能提取罐中，調(diào)pH在6-7之間，溫度為 室溫，加入纖維素酶13.5g、果膠酶9.6g、半纖維素酶6.9g，酶解8小時(shí)，酶解結(jié)束后， 采用機(jī)械破碎技術(shù)將植物組織搗碎，過(guò)濾，濾液在真空度為0.08-0.09MPa、70°C濃縮， 得到1.3L比重為1.10(20°C時(shí))的提取物濃縮液。
機(jī)械破碎技術(shù)可以是組織搗碎勻漿技術(shù)、固體樣品粉碎技術(shù)、高壓細(xì)胞破碎技 術(shù)或閃式提取技術(shù)。
(2)萃取
第一步萃取調(diào)提取物濃縮液的pH至6.5，加入乙醚進(jìn)行2次萃取，用量分別 為1.3L、0.65L,合并乙醚相減壓回收乙醚，得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取第一步萃取的水相調(diào)pH值至8.5-9.5，乙酸乙酯萃取5次，每次用 量為0.5L，合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取第二步萃取分出的水相調(diào)pH值至10.5-11，乙醚萃取兩次，用量 分別為0.6L、0.4L,合并乙醚相減壓回收乙醚得第三步萃取產(chǎn)物；
(3)分離精制
第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH 8.0，乙酸乙酯按1 1比 例第三步萃取次，合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比硅膠1 20上柱，石油 醚乙酸乙酯(10 1-1 10)梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，甲醇-氯仿重 結(jié)晶，烘干得1.8g多花水仙堿。
第二步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比碳18為1 10上柱，分別以水，30% 甲醇、60%甲醇、純甲醇、乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘 干得11.2g加蘭他敏。
第三步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比硅藻土為1 50上柱，以石油醚、乙 酸乙酯、丙酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得 13.7g力可拉敏。
實(shí)施例2
(1)提取[0042]取10kg干石蒜片，40kg水溶液，于多功能提取罐中，調(diào)pH在5-6之間，溫度為 40加入纖維素酶8.4g、果膠酶6.6g、半纖維素酶5g，酶解2小時(shí)后使用組織搗碎勻漿 破碎樣品，過(guò)濾，濾液在真空度為0.08-0.09MPa、77°C濃縮，得到1.2L比重為1.07 (20°C 時(shí))的提取物濃縮液。
(2)萃取
第一步萃取調(diào)提取物濃縮液的pH至5.0，加入正丁醇進(jìn)行3次萃取，用量分 別為0.6L、0.4L、0.4L,合并正丁醇相，減壓回收正丁醇，得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取第一步萃取的水層調(diào)pH值至9.0-9.5，氯仿第三步萃取次，用量分 別為0.6L、0.4L、0.4L,合并氯仿相減壓回收氯仿，得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取第二步萃取的水層調(diào)pH值至10.0-10.5，異戊醇萃取6次，用量分 都為0.4L，合并異戊醇相減壓回收異戊醇，得第三步萃取產(chǎn)物；
(3)分離精制
第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，氫氧化鈉堿化至pH 8.5，乙酸乙酯按1 1第 三步萃取次，合并乙酸乙酯相減壓回收，以產(chǎn)品比大孔樹脂1 60上柱，水，25%、 50%, 75%乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醚重結(jié)晶，烘干得1.6g多花水 仙堿。
第二步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 10上柱，分別以石油醚， 氯仿、無(wú)水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得7.8g加蘭他敏。
第三步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 40上柱，以石油醚、丙 酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得15.6g力可拉 敏。
實(shí)施例3
(1)提取
取10kg干忽地笑片，100kg水溶液，調(diào)pH在7-8之間，溫度為55度，加入纖 維素酶21.15g、果膠酶13.95g、半纖維素酶9.9g，酶解24小時(shí)，使高剪切閃式提取器 破碎樣品10分鐘，過(guò)濾，濾液在真空度為0.08-0.09MPa，77°C濃縮，得到2.1L比重為 1.05(20°C時(shí))的提取物濃縮液。
(2)萃取
第一步萃取調(diào)提取物濃縮液的pH至6.0，加入乙酸乙酯進(jìn)行4次萃取，每次 用量為0.6L，合并乙酸乙酯相，減壓回收乙酸乙酯得第一步萃取產(chǎn)物；
第二步萃取第一步萃取的水相調(diào)pH值至9.3-9.8，氯仿萃取二次，用量為0.8L 和0.6L，合并氯仿相，減壓回收氯仿，得第二步萃取產(chǎn)物；
第三步萃取第二步萃取的水相調(diào)pH值至10.7-10.9，乙醚萃取三次，用量均為 0.6L，合并乙醚相，減壓回收乙醚，得第三步萃取產(chǎn)物；
(3)分離精制
第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH9.0，乙酸乙酯3次萃取， 合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比氧化鋁1 45上柱，石油醚、乙酸乙酯、 甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇-水重結(jié)晶，烘干得4.5g多花水仙堿。
第二步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 35上柱，分別以石油醚， 氯仿、無(wú)水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得13.7g加蘭他敏。
第三步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 30上柱，以石油醚、丙 酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得11.6g力可拉 敏。
權(quán)利要求
1. 一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，所述活性生物堿為多花水仙堿、加 蘭他敏和力可拉敏，該方法的步驟包括(1)在切碎后的石蒜屬植物中加入體積為2 10倍量的水，再加入復(fù)合纖維素酶，復(fù) 合纖維素酶與石蒜屬植物的質(zhì)量百分比為0.1 0.5%，調(diào)節(jié)pH值至5 8，在溫度20 60°C下酶解2 24小時(shí)，再將酶解后石蒜屬植物細(xì)胞破碎，過(guò)濾，得到提取液；復(fù)合纖 維素酶的組分及質(zhì)量比為纖維素酶40-50%、果膠酶30-40%、半纖維素酶20-30%;(2)濃縮上述提取液，得到提取物濃縮液，該濃縮液的比重在20°C測(cè)量時(shí)為1.05 1.15 ；(3)按pH值分步對(duì)上述提取物濃縮液進(jìn)行萃取，萃取過(guò)程為第一步萃取將提取物濃縮液的pH調(diào)至5 7，加入0.5 3倍體積有機(jī)溶劑進(jìn)行 萃取1 4次，合并有機(jī)溶劑相，減壓回收有機(jī)溶劑得第一步萃取產(chǎn)物；第一步萃取采用 的有機(jī)溶劑為乙醚、正丁醇或乙酸乙酯；第二步萃取將第一步萃取得到的水相調(diào)pH值至7 10，加入0.5 3倍體積有機(jī) 溶劑進(jìn)行萃取1 4次，合并有機(jī)溶劑相，減壓回收有機(jī)溶劑得第二步萃取產(chǎn)物；第二步 萃取采用的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯或氯仿第三步萃取將第二步萃取得到的水相調(diào)pH值至10 11，加入0.5 3倍體積有 機(jī)溶劑進(jìn)行萃取1 4次，合并有機(jī)溶劑相，減壓回收有機(jī)溶劑得第三步萃取產(chǎn)物；第三 步萃取采用的有機(jī)溶劑為乙醚或異戊醇(4)多花水仙堿按照下述方式A1-A3中的一種進(jìn)行分離(A1)第一步萃取產(chǎn)物加少量水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH 8.0，乙酸乙酯按1 1比例 萃取3次，合并乙酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比硅膠1 20上柱，石油醚乙 酸乙酯按10 1-1 10梯度洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，甲醇-氯仿重結(jié)晶， 烘干得到多花水仙堿；(A2)第一步萃取產(chǎn)物加水溶解，氫氧化鈉堿化至pH 8.5，乙酸乙酯按1 1萃取3 次，合并乙酸乙酯相減壓回收，以產(chǎn)品比大孔樹脂1 60上柱，水、25%、50%, 75% 乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醚重結(jié)晶，烘干得到多花水仙堿；(A3)第一步萃取產(chǎn)物加水溶解，碳酸氫鈉堿化至pH9.0，乙酸乙酯3次萃取，合并乙 酸乙酯相減壓回收乙酸乙酯，以產(chǎn)品比氧化鋁1 45上柱，石油醚、乙酸乙酯、甲醇分 別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇-水重結(jié)晶，烘干得到多花水仙堿； 加蘭他敏按照下述方式B1-B3中的一種進(jìn)行分離(B1)第二步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比碳18為1 10上柱，分別以水、30%甲 醇、60%甲醇、純甲醇、乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干 得到加蘭他敏；(B2)第二步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 10上柱，分別以石油醚、氯 仿、無(wú)水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得到加蘭他敏；(B3)第二步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比硅膠為1 35上柱，分別以石油醚、氯 仿、無(wú)水乙醇洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，乙醇重結(jié)晶，烘干得到加蘭他敏； 力可拉敏按照下述方式C1-C3中的一種進(jìn)行分離(C1)第三步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比硅藻土為1 50上柱，以石油醚、乙酸乙 酯、丙酮、甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得到力 可拉敏；(C2)第三步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 40上柱，以石油醚、丙酮、 甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得到力可拉敏；(C3)第三步萃取產(chǎn)物加水溶解，以產(chǎn)品比氧化鋁為1 30上柱，以石油醚、丙酮、 甲醇分別洗脫，薄層跟蹤檢測(cè)，合并相同組分，正丙醇重結(jié)晶，烘干得到力可拉敏； (5)將柱層析分離得到的相同組分合并，反復(fù)重結(jié)晶，得到多種高純度單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于重結(jié)晶用的溶劑為水、甲醇、乙醇、 氯仿、乙醚、正丙醇和異丙醇中的一種或幾種混合。
專利摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從石蒜屬植物中提取活性生物堿的方法，采用酶法與現(xiàn)代機(jī)械破壁技術(shù)結(jié)合提取石蒜生物堿，達(dá)到在溫和條件下高效高產(chǎn)率提取石蒜中的生物堿，減小其它雜質(zhì)的溶出，減小提取液粘度利于后續(xù)分離純化的處理；并根據(jù)石蒜生物堿堿性強(qiáng)弱不同，使用分段萃取技術(shù)同步得到多種石蒜生物堿粗產(chǎn)品，再經(jīng)過(guò)柱層析和反復(fù)重結(jié)晶得到高純度的石蒜生物堿單體(加蘭他敏、石蒜堿、力可拉敏、多花水仙堿)。本發(fā)明路線簡(jiǎn)單、無(wú)污染、周期短、產(chǎn)品收得率高、安全系數(shù)高、成本低、產(chǎn)品多樣，提高了石蒜綜合利用度，同時(shí)降低了石蒜深加工的生產(chǎn)成本，工業(yè)化大生產(chǎn)可行性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12P17/18GKCN101157947 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200710053207
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2007年9月13日
發(fā)明者余龍江, 崔永明, 廖娜, 張明, 敖明章, 江喜敏 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué), 恩施市錦華生物工程有限責(zé)任公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),