專利名稱:一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種提高光滑球擬酵母(7^"/0戸& g/Wrato)抵御高滲透壓脅迫的方法，屬于代謝控制策略優(yōu)化發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及一種在r g/Wrato內(nèi)過量表達(dá)來源于L /ac^中編碼形成水的NADH氧化酶wox基因。提高了與水形成途徑相關(guān)的酶活，使胞內(nèi)的水含量升高，保護(hù)細(xì)胞在高滲條件下的生長和功能。
背景技術(shù)：
NADH氧化酶直接將NADH氧化成NAD+并將02還原成H20。研究結(jié)果表明這個(gè)酶的表達(dá)會導(dǎo)致NADH/NAD+的比例急劇下降，并顯著的提高細(xì)胞對抗氧脅迫的能力。另外，NADH可以將02直接還原成水，不需要經(jīng)過電子傳遞鏈，提高了形成水的效率，增加了胞內(nèi)水含量，增強(qiáng)了細(xì)胞在高滲條件下的生長和功能。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過在光滑球擬酵母r g/"6mto表達(dá)形成水的NADH氧化酶，顯著降低了 NADH/NAD+的比例，提高了與水形成途徑相關(guān)的酶活，使胞內(nèi)水含量升高。在高滲條件下(3824mOsmobkg—i)r.g/a6ratoPD/wxE的菌體生長明顯提高。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法，利
用多重維生素營養(yǎng)缺陷型的丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)菌株光滑球擬酵母(7:
g/Wrato)CCTCC M202019為模式菌株，采用將來源于乳酸乳球菌(Z^ctococcws/acto)中編碼形成水的NADH氧化酶"ox基因過量表達(dá)于CCTCC M202019中，獲得了一株NADH氧化酶活性為34.8 l>mg" protein的重組菌7: g/WratoPDwojcE，在7: g/Wrato中表達(dá)"ox基因，顯著降低了 NADH/NAD+的比例，提高了與水形成途徑相關(guān)的酶活，使胞內(nèi)的含水量升高，在3824mOsmoHcg"高滲條件下r. g/"6ratoPD"o^E的菌體生長明顯提高，表明通過控制水的生成途徑提高酵母細(xì)胞滲透適應(yīng)性，通過過量表達(dá)NADH氧化酶，保護(hù)光滑球擬酵母(rora/o戸^y g/a6rato)抵御高滲透壓脅迫。1、菌株
原菌(模式菌株)光滑球擬酵母(7:g/a6rato)CCTCCM202019，煙酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(Bi)、吡哆醇(Pdx)四種維生素營養(yǎng)缺陷型，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低，為江南大學(xué)選育菌株，該菌種已申請中國專利，申請?zhí)枮?2113142.2，公開號為CN1392246A。工程菌在光滑球擬酵母(7:g/Wrato) CCTCCM 202019細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)
來源于乳酸乳球菌(丄a"ococc^ /ac&)中編碼形成水的NADH氧化酶"ox基因，構(gòu)建工程菌r g/a6rato PD"ojcE。
2、 培養(yǎng)基
種子和斜面培養(yǎng)基(g'L"):葡萄糖30，蛋白胨10， KH2P04 1， MgS04'7H200.5;瓊脂20 (斜面培養(yǎng)基)，pH5.5。
基本發(fā)酵培養(yǎng)基(L):葡萄糖100g， NH4S04 7g， MgS04'7H20 0.8g， KH2P045g， CH3COONa5g， pH5.0。
3、 搖瓶培養(yǎng)
將3CTC、 200rpm下培養(yǎng)24h的種子以10%的接種量分別轉(zhuǎn)入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于3(TC、 200rpm條件下培養(yǎng)48h，按實(shí)驗(yàn)要求添加不同濃度的煙酸、維生素B!、維生素Bs、生物素Bio。
細(xì)胞千重的測定取一定量的菌懸液置于10 mL容量瓶中，加2 mL鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，加入去離子水定容至10 mL，搖勻，用UV 7500型可見分光光度計(jì)，于660nm處比色測OD值，用細(xì)胞干重標(biāo)準(zhǔn)曲線算得細(xì)胞干重。
本發(fā)明的有益效果原菌和工程菌在滲透壓升高到2947 mOsmol'kg"時(shí)菌體量都有明顯下降。然而，在高滲條件下，工程菌r.g/"6ratoPDwoxE在發(fā)酵終點(diǎn)的菌體量高于原菌，分別提高17.5°/。 (2018 mOsmol'kg'1) ， 33.2% (2947mOsmol'kg")和71.80/0 (3824 mOsmol.kg")。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
在光滑球擬酵母？: 細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)來源于乳酸乳球菌中編碼形成水的NADH氧化酶m x基因，構(gòu)建工程菌T g/a6rato PDmojcE。發(fā)酵48 h，在滲透壓分別為2018 mOsmol'kg"， 2947 mOsmol'kg_1和3824 mOsmol'kg-1的條件下，最終菌體濃度分別為7.2 g丄'1， 5.8 g丄'1， 2.3 g丄—1，相比對照分別提高18.0 % (2018mOsmol.kg")， 34.9 % (2947 mOsmol.kg")和76.9 % (3824 mOsmol'kg-1)。
對照實(shí)施例
本發(fā)明所用的菌種光滑球擬酵母73 g/^)rato，先轉(zhuǎn)斜面在3(TC培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，然后挑取單菌落用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，最后搖瓶發(fā)酵48h，溫度30°C，轉(zhuǎn)速200rpm。滲透壓分別為2018 mOsmol'kg"， 2947 mOsmol'kg"和3824mOsmol'kg-1，最終菌體濃度分別是6.1 g丄"(2018 mOsmol'kg-1), 4.3 g丄"(2947mOsmol.kg")和1.3 g七-1 (3824 mOsmol'kg-1^
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權(quán)利要求
1、一種提高光滑球擬酵母抵御高滲透壓脅迫的方法，其特征是利用多重維生素營養(yǎng)缺陷型的丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)菌株光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCCM202019為模式菌株，采用將來源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中編碼形成水的NADH氧化酶nox基因過量表達(dá)于CCTCC M202019中，獲得了一株NADH氧化酶活性為34.8U·mg-1 protein的重組菌T.glabrata PDnoxE，在T.glabrata中表達(dá)nox基因，顯著降低了NADH/NAD+的比例，提高了與水形成途徑相關(guān)的酶活，使胞內(nèi)的含水量升高，在3824mOsmol·kg-1高滲條件下T.glabrata PDnoxE的菌體生長明顯提高，表明通過控制水的生成途徑提高酵母細(xì)胞滲透適應(yīng)性，通過過量表達(dá)NADH氧化酶，保護(hù)光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)抵御高滲透壓脅迫。
專利摘要
一種提高光滑球擬酵母(Torulopsis glabrata)抵御高滲透壓脅迫的方法，屬于代謝控制策略優(yōu)化發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明采用將來源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中編碼形成水的NADH氧化酶nox基因過量表達(dá)于丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)菌株T.glabrata中，獲得了一株NADH氧化酶活性為34.8U·mg^-1 protein的重組菌T.glabrata PDnoxE。在T.glabrata中表達(dá)nox基因，顯著降低了NADH/NAD⁺的比例，提高了與水形成途徑相關(guān)的酶活，使胞內(nèi)的含水量升高。在高滲條件下(3824mOsmol·kg^-1)T.glabrata PDnoxE的菌體生長明顯提高。結(jié)果表明可以通過控制水的生成途徑提高酵母細(xì)胞滲透適應(yīng)性。
文檔編號C12N1/19GKCN101591670SQ200910027522
公開日2009年12月2日 申請日期2009年5月11日
發(fā)明者劉立明, 堵國成, 沙 徐, 堅(jiān) 陳 申請人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan