一株近平滑假絲酵母重組菌高效制備(s)-苯基乙二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一株近平滑假絲酵母重組菌高效制備(5)-苯基乙二醇的方法，構(gòu)建(5)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中的表達質(zhì)粒，實現(xiàn)(5)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中的原位表達，高效制備(5)-苯基乙二醇的方法，本發(fā)明涉及基因工程手段構(gòu)建(5)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母的重組菌，高效制備(5)-苯基乙二醇的方法及其應(yīng)用，屬于生物催化不對稱轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]手性化合物在醫(yī)藥、農(nóng)藥、激素、食品添加劑等精細化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如光學純苯基乙二醇不僅是液晶材料中不可缺少的重要手性添加劑，而且是制備具有光學活性的醫(yī)藥、農(nóng)藥和功能材料的重要中間體。
[0003]氧化還原酶催化的不對稱還原反應(yīng)常用于手性化合物的制備。目前常用的氧化還原酶大部分來源于重組大腸桿菌。然而在大腸桿菌中重組表達后的氧化還原酶功能由于缺乏后期的蛋白后修飾，催化轉(zhuǎn)化手性化合物的效率不盡如人意。
[0004]本實驗室前期已經(jīng)利用(5)-羰基還原酶II的大腸桿菌重組菌催化不對稱轉(zhuǎn)化制備(5)-苯基乙二醇。(5)-羰基還原酶II在大腸桿菌中異源表達后，利用大腸桿菌全細胞不對稱轉(zhuǎn)化2-羥基苯乙酮，獲得的(5)-苯基乙二醇的光學純度和得率分別只有89.1%和82.6%ο在此基礎(chǔ)上，從近平滑假絲酵母{C.parapsi1sis)基因組中調(diào)取目的基因同時構(gòu)建近平滑假絲酵母中的表達質(zhì)粒PCP，在原有的(5)-羰基還原酶II在近平滑假絲酵母中本底表達的水平上，通過同源重組將目的基因scrll整合入近平滑假絲酵母基因組，增強了(5)-羰基還原酶II的催化功能。通過優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件，近平滑假絲酵母重組菌株催化底物2-羥基苯乙酮，產(chǎn)物(5)-苯基乙二醇光學純度和產(chǎn)率均達到99.9%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]( I)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明目的在于根據(jù)已經(jīng)獲得的近平滑假絲酵母parapsilosis) (5)-羰基還原酶II基因(GenBank access1n N0.GQ411433)，通過將整合入近平滑假絲酵母基因組，構(gòu)建(5)-羰基還原酶II的近平滑假絲酵母重組菌株。利用該重組菌催化2-羥基苯乙酮高效制備具有光學活性的(5)-苯基乙二醇，該重組菌不對稱還原2-羥基苯乙酮制備光學活性(5)-苯基乙二醇，產(chǎn)物的光學純度和產(chǎn)率高達99.9%，為利用新型重組酵母菌株高效制備手性化合物提供了有效途徑。
[0006](2)技術(shù)方案
一株不對稱轉(zhuǎn)化制備(5)-苯基乙二醇的原位表達(5)-羰基還原酶II的近平滑假絲酵母重組菌，其分類命名為近平滑假絲酵母菌/(5)-羰基還原酶II (C parapsilosispCP-scrll)，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號:CCTCC NO:M2015107。
[0007]一、基因組的獲得
野生型近平滑假絲酵母(C parapsilosis) CCTCC NO:M203011生長培養(yǎng)基YI3D組成質(zhì)量百分為:葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。將近平滑假絲酵母菌接種于培養(yǎng)基裝液量為30%的250 mL搖瓶中于28°C、200 r/min振蕩培養(yǎng)16-18 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體于12，000r/min離心5 min，用生理鹽水洗滌兩次后收集細胞。利用基因組DNA提取試劑盒GenomicDNA Mini Preparat1n Kit (Takara 公司)提取基因組。
[0008]二、scr II基因的調(diào)取
從近平滑假絲酵母中調(diào)取目的基因的同時，將目的基因中酶切位點Kpn I序列(GGTACC)同義突變?yōu)镚GCACA。
[0009]以近平滑假絲酵母基因組為PCR反應(yīng)模板，利用含有Sac I和Kpn I限制性酶切位點的引物SCRIkfec I_F1和SCRll_Kpn I_R1，以及Kpn I突變點引物Mutjf/7/7 I_F2和}k\X_Kpn I—R2:
合成兩端引物:
SCRII_5ac I_F1: 5? -ttcgggagct catgcaccac caccaccacc acggcgaaat cgaatcttatt-3’ {Sac I)，
SCRI\_Kpn I_R1: 5’ -cggggtaccc tatggacaag tgtaaccacc a_3’ {Kpn I)，
突變引物:
}kvX_Kpn I_F2: 5’ -atgtcgggca caattgttaa tgt_3’，
Wut_Kpn I_R2: 5’ -acattaacaa ttgtgcccga cat-3’，
采用SOE-PCR的方法，將突變位點引入，將第523~525的GGT改為GGC，第526~528的ACC改為ACA，具體方法如下:
PCR 反應(yīng)體系:ddH20 24.5 yL，DNA 聚合酶 0.5 H I, Mut_Kpn I_F2 引物 5 yL，Mut_Kpn I_R2 引物 5 μ L，5Xbuffer 10 yL。
[0010]上游cDNA片段及下游cDNA片段的獲得:以近平滑假絲酵母基因組為模板，分別以引物 SCRII—fec I_F1 和 Mutjf/?/? I_R2，引物 SCRIIj^/? I_R1 和 Wut—Kpn I_F2 進行 PCR 反應(yīng)，PCR 條件為:98°C熱變性 10 s ； 980C 10 s，52°C 15 s，72°C I min。經(jīng)過 5-10 個循環(huán)后，取出PCR反應(yīng)液，然后再加入引物SAT1_1和URA3t_2各I μ L，再進行25個循環(huán)，最后72°C再延伸10 min，獲得scrll, ^crII基因全長為840 bp。
[0011]三、近平滑假絲酵母表達載體PCP的構(gòu)建
質(zhì)粒PCP包含以下幾個元件:啟動子基因姻Z辦和JCT7/7，終止子基因和URAJt(同時作為下游同源臂)以及表達盒上游同源臂基因_3p和抗性基因說71。
[0012]表達載體pCP是由pUC57為起始模板構(gòu)建而來，表達質(zhì)粒全長4.5 Kb，采用重疊延伸和酶切連接的方法構(gòu)建:
載體PCP構(gòu)建引物設(shè)計:
URA3p_l: 5’ -ccggaattcg tattgcaaac aaacg-3’ (EcoR I)，
URA3p_2: 5’ -cgcatccatt cagatcttgt atgaagacgg ca_3’ {Bgl II)，
MAL2p_l: 5， -gtcttcatac aagatctgaa tggatgcggg-3， {Bgl II)，
MAL2p_2: 5， -attgacatga gctcccgcgg aatagttgta gta_3， {Sac I)，
ACTlt_l: 5’ -caccactagg gtaccgagtg aaattct-3’ {Kpn I)，ACTlt_2: 5’ -gtcttcctgc agattttatg atggaat-3’ (Pst I)，
ACTlp_l: 5’ -aaaatctgca ggaagaccgt ccaac-3’ (Pst I)，
ACTlp_2: 5’ -tttaagctta tctgcggccg caccgttatc gataactaaa-3’， (Not I)，SAT1_1: 5， -cgataacggt gcggccgcat gaaaatttcg gtga-3， (Not I)，
SAT1_2: 5’ -gattaaatat tcggatcctt aggcgtcatc ct-3’ {BanR I)，
URA3t_l: 5’ -gatgacgcct aaggatccga atatttaatc at_3’ {BanR I)，
URA3t_2: 5’ -atcccaagct taacgatcaa gagaaa-3’ {Hind III)，
表達載體PCP全長4.5 Kb，采用重疊延伸和酶切連接的方法構(gòu)建:
將序列經(jīng)TA克隆，連接到載體PMD19-T上，得到T- 質(zhì)粒。使用引物SAT1_1和URA3t_2，以saii和araJi片段為模板，經(jīng)過重疊延伸PCR擴增得到satl-ura3t。
[0013]將質(zhì)粒及片段分別用限制性內(nèi)切酶Not I Η?η? III進行雙酶切，經(jīng)膠回收后，將片段連接到T- 質(zhì)粒上，得到T-ASU質(zhì)粒。
[0014]將T-ASU質(zhì)粒及pUC57質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶I和V1l III進行雙酶切，酶切片段經(jīng)膠回收后，將片段連接到pUC57質(zhì)粒上，得到pUC57_ASU質(zhì)粒。
[0015]使用引物URA3p_l和MAL2p_2為引物，以araJ/?和搬7辦片段為模板，經(jīng)過重疊延伸PCR擴增得到ura3p_mal2p。
[0016]將ura3pual2p六後Bi pUC57_ASU質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶&oR I和5^1進行雙酶切，經(jīng)膠回收后，將ura3p-mal2p片段連接到pUC57_ASU質(zhì)粒上，得到pUC57_UMASU質(zhì)粒。
[0017]將actIt六啟及pUC57-UMASU質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Pst I進行雙酶切，經(jīng)膠回收后，將片段連接到PUC57-UMASU質(zhì)粒上，得到大腸桿菌和近平滑假絲酵母中的穿梭表達載體pCP。
[0018]四、重組質(zhì)粒pCP-scrll的構(gòu)建將目的基因MrII及表達載體pCP分別用限制性內(nèi)切酶Sac I和Kpn I進行雙酶切:按照水、緩沖液、質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內(nèi)離心2 s使液體集中于管底，37°C金屬浴I h，在管中加入1/10體積的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收并濃縮。
[0019]酶切反應(yīng)體系組成:10XQuickCutBuffer 5 μ L，DNA 20 μ L, Sac I 1.0μ L, Kpn I 1.0 μ L，ddH20將體系補足50 yL，37°C水浴I h，在管中加入1/10體積的1XQuickCut Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶切反應(yīng)。
[0020]基因^crII與載體pCP的連接:
反應(yīng)體系組成如下:載體 pCP 1.5 yL，基因μ L, 1XLigat1n buffer
I UL, T4 ligase 0.5 μ L，將混合連接液置于16°C培養(yǎng)箱中連接12-16 h。
[0021]重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(ikcAericA coll) JM109:
在每管的100 μ LA.co7i JM109感受態(tài)細胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30 min。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90 S?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中冷卻2 min。每管中加入7