專(zhuān)利名稱(chēng):一種降血壓肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降血壓肽，尤其是涉及一種采用全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵的降血壓肽的制備方法。
背景技術(shù)：
高血壓是一種高發(fā)病率、多并發(fā)癥的危險(xiǎn)疾病，正嚴(yán)重危害著人類(lèi)身體健康和生活質(zhì)量。高血壓發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)系統(tǒng)(RAS)調(diào)節(jié)機(jī)制失衡是高血壓發(fā)病的重要機(jī)制之一。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)在該調(diào)節(jié)系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)能通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性而達(dá)到抑制血壓升高的作用。但由于目前用于臨床治療的該類(lèi)藥物易產(chǎn)生不良反應(yīng)和毒副作用，因此尋找高效 和安全的ACEI成為抗高血壓藥物研究方向之一。降血壓肽(AHP)是一類(lèi)能夠降低人體血壓的多肽的總稱(chēng)，它是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的抑制劑，可通過(guò)抑制人體血管緊張素II的生成而達(dá)到降低血壓的目的。降血壓肽毒副作用低、降壓效果明顯、來(lái)源廣泛，已成為抗高血壓藥物研究的熱點(diǎn)之一。目前降血壓肽的制備主要采用酶解法，但由于特異性蛋白酶篩選繁瑣、分離純化工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低等問(wèn)題而無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)降血壓肽是克服上述困難進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的重要途徑，有廣闊應(yīng)用前景。
公開(kāi)號(hào)為CN101153310的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)一種復(fù)合酶解帶魚(yú)脊骨制備降血壓肽的方法，將帶魚(yú)脊骨粉碎后加水?dāng)噭?，調(diào)節(jié)pH，將溫度升高到30 45°C，加入彈性蛋白酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后將酶解液迅速升溫至90 100°C，保持10 15min后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，調(diào)酶解液pH為I. 5 3. O,加入胃蛋白酶,進(jìn)行酶解反應(yīng),而后反應(yīng)體系迅速升溫至90 100°C，保持10 15min后，再迅速冷卻至室溫終止反應(yīng)，離心后取上清液過(guò)濾、真空濃縮、冷凍干燥，得到粉狀降血壓肽。
公開(kāi)號(hào)為CN101168762的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)一種發(fā)酵法利用帶魚(yú)脊骨制備降血壓肽的方法，將蔗糖、粉碎后的帶魚(yú)脊骨、蛋白胨、K2HP04、MgSO4 · 7H20及水配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種地衣芽孢桿菌，經(jīng)培養(yǎng)得發(fā)酵液；發(fā)酵液離心后取上清液，將上清液過(guò)濾，濾液滅酶；滅酶后的濾液離心，離心上清液用活性碳脫色除味，得脫色除味后的濾液；將脫色除味后的濾液進(jìn)行超濾，得透過(guò)液，透過(guò)液真空濃縮后冷凍干燥，得到具有降血壓功能的肽粉。
公告號(hào)為CN1687444的發(fā)明專(zhuān)利提供一種利用酶-膜耦合技術(shù)制備紫菜降血壓肽的方法及用途。先對(duì)干紫菜進(jìn)行包括粉碎、脫脂、溶解與超聲作用的預(yù)處理，再對(duì)紫菜溶液采用蛋白酶解與膜分離耦合的技術(shù)進(jìn)行紫菜降血壓肽的制備與分離，最后通過(guò)過(guò)濾、濃縮與干燥得到粉狀的紫菜降血壓肽產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)成本較低，便于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)的降血壓肽的制備方法。[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是采用高密度發(fā)酵法，優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，采用乳糖誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，得到最佳發(fā)酵工藝條件。
本發(fā)明采用的大腸桿菌工程菌E. coli BL21/VLPVPR可購(gòu)自GE公司(法瑪西亞)，GE 公司的信息可參見(jiàn)網(wǎng)址http://show, bioon. com/consumables/show_product. asp id = 11364。
本發(fā)明包括以下步驟
I)工作種子液的制備配制固體平板培養(yǎng)基，將凍存的大腸桿菌工程菌E. coliBL21/VLPVP涂板后培養(yǎng)活化，再挑取單菌落接種入滅菌后種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)得活化菌種，即得工作種子液；
2)接種前準(zhǔn)備洗凈發(fā)酵罐，用pH7. O和pH10. 01標(biāo)準(zhǔn)液校正發(fā)酵罐的pH計(jì)探頭，然后將已配制好的經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中，高壓滅菌后冷卻，高壓過(guò)程中校正溶解氧DO為O % ；
3)接種，培養(yǎng)滅菌結(jié)束待冷卻到37°C后，在火焰圈的保護(hù)下加入消泡劑，以
I% 6%的接種量將工作種子液接種于發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為23 44°C，起始pH為6
7.5，校正相對(duì)溶氧水平(DO)達(dá)100% ;
4)補(bǔ)料在發(fā)酵過(guò)程中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使DO維持在溶氧為10 % 80%，培養(yǎng)I 4h后開(kāi)始補(bǔ)料；
5)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)VLPVPR重組蛋白階段停止補(bǔ)料后，開(kāi)始乳糖誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的條件為誘導(dǎo)溫度23 44°C，加入乳糖至終濃度0. I % 2%，誘導(dǎo)時(shí)間為5 8h ;
6)菌體收集將步驟5)的發(fā)酵液離心，取沉淀，用I XPBS緩沖液清洗，收集菌體；
7)獲得降血壓肽將步驟6)制得的菌體超聲破碎，離心，取上清液，即獲得降血壓肽；
8) SDS-PAGE電泳檢測(cè)GST融合蛋白表達(dá)量取獲得的降血壓肽進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色和脫色后觀察VLPVPR重組蛋白的表達(dá)情況。
在步驟I)中，所述固體平板培養(yǎng)基的配方最好為酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂10g/L，pH為7. 0，滅菌冷卻后加入氨芐青霉素至終濃度為IOOmg/L ;所述培養(yǎng)活化最好在37°C恒溫培養(yǎng)箱活化18 24h ;所述種子培養(yǎng)基的配方最好為酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化鈉5g/L，pH為7. 0，滅菌冷卻后加入氨芐青霉素至終濃度為100mg/L ;所述搖床培養(yǎng)最好在37°C 250rpm恒溫?fù)u床培養(yǎng)12h。
在步驟2)中，所述經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分比的含量為酵母粉0.5%
3.5%，蛋白胨0. 5% 3%，，葡萄糖0% 3%，NaCl 0. 5% 3%，其余為水；最好為酵母粉 3%，蛋白胨 2.5%，NaCl 0.5%，水 94%。
在步驟3)中，所述接種量最好為2%，培養(yǎng)溫度最好為37°C，起始pH最好為7.0，發(fā)酵罐可采用全自動(dòng)生物反應(yīng)器。
在步驟4)中，所述溶氧最好為40%，最好培養(yǎng)2h后開(kāi)始補(bǔ)料，所述補(bǔ)料的速度可為0. 5 I. 5mL/min,最好為lmL/min,補(bǔ)料的時(shí)間可為0. 5 2h,最好為lh。在發(fā)酵過(guò)程中，由于發(fā)酵罐配有PH探頭，可通過(guò)自動(dòng)泵入酸或堿來(lái)自動(dòng)控制pH值。
在步驟5)中，所述誘導(dǎo)溫度最好為37°C，加入乳糖最好至終濃度為2%，誘導(dǎo)時(shí)間最好為6h。[0023]在步驟7)中，所述離心最好12000r/min離心15min。
上述工藝流程下的發(fā)酵液中的GST融合蛋白表達(dá)量為27. 74% (質(zhì)量濃度)。
當(dāng)進(jìn)行IPTG (異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)誘導(dǎo)試驗(yàn)對(duì)比時(shí)，誘導(dǎo)條件為誘導(dǎo)溫度為37°C，加入IPTG至終濃度O. 5mmol/L,誘導(dǎo)4h。在上述工藝流程下的發(fā)酵液中的GST融合蛋白表達(dá)量為20. 15% (質(zhì)量濃度)。
與現(xiàn)有的降血壓肽的制備方法相比，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)
I)本發(fā)明采用的培養(yǎng)基原料價(jià)低易得，并用乳糖代替IPTG誘導(dǎo)劑，很大程度降低了該降血壓肽的生產(chǎn)成本。
2)高密度發(fā)酵有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。不僅可以減少培養(yǎng)體積，強(qiáng)化下游分離提取，而且可以縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資，從而降低生產(chǎn)成本，減少勞動(dòng)強(qiáng)度，能極大地提高產(chǎn) 品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。


圖I為培養(yǎng)條件對(duì)GST-AHP表達(dá)的影響。在圖I中，Mark為對(duì)照，I 16為實(shí)驗(yàn)號(hào)。
圖2為誘導(dǎo)條件對(duì)GST-AHP表達(dá)的影響。在圖2中，Mark為對(duì)照，I 16為實(shí)驗(yàn)號(hào)。
圖3為比較不同誘導(dǎo)劑對(duì)GST-AHP表達(dá)的影響。在圖3中，I 8為實(shí)驗(yàn)號(hào)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例I (優(yōu)化培養(yǎng)條件)
選用L16(44)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1，將活化菌種按不同的接種量轉(zhuǎn)接至經(jīng)過(guò)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至0D_為I. 5時(shí)，加IPTG至終濃度
0.4mmOl/L，3(TC誘導(dǎo)5h，取樣進(jìn)行結(jié)果分析。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，正交實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見(jiàn)表2。
表I培養(yǎng)條件因素水平表
因素培養(yǎng)溫度(°C)pH裝液量(％)接種量(％)
水平I2365I
水平 2306.5102
水平 3377204
水平 4_44_JS_30_6_
表2培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種降血壓肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)工作種子液的制備配制固體平板培養(yǎng)基，將凍存的大腸桿菌工程菌E.coli BL21/VLPVPR涂板后培養(yǎng)活化，再挑取單菌落接種入滅菌后種子培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)得活化菌種，即得工作種子液；所述固體平板培養(yǎng)基的配方為酵母提取物10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂10g/L，pH為7. O,滅菌冷卻后加入氨芐青霉素至終濃度為100mg/L ;所述種子培養(yǎng)基的配方為酵母提取物10g/L,胰蛋白胨16g/L,氯化鈉5g/L, pH為7. O,滅菌冷卻后加入氨芐青霉素至終濃度為100mg/L ； 2)接種前準(zhǔn)備洗凈發(fā)酵罐，用pH7.O和pHlO. Ol標(biāo)準(zhǔn)液校正發(fā)酵罐的pH計(jì)探頭，然后將已配制好的經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中，高壓滅菌后冷卻，高壓過(guò)程中校正溶解氧DO為0% ;所述經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基，按質(zhì)量百分比的含量為酵母粉O. 5% 3. 5%，蛋白胨O.5% 3%，，葡萄糖0% 3%，NaCl O. 5% 3%，其余為水； 3)接種，培養(yǎng)滅菌結(jié)束待冷卻到37°C后，在火焰圈的保護(hù)下加入消泡劑，以1% 6%的接種量將工作種子液接種于發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為23 44°C，起始pH為6 7. 5，校正相對(duì)溶氧水平達(dá)100% ； 4)補(bǔ)料在發(fā)酵過(guò)程中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使DO維持在溶氧為10% 80%，培養(yǎng)I 4h后開(kāi)始補(bǔ)料；所述溶氧為40 %，培養(yǎng)2h后開(kāi)始補(bǔ)料，所述補(bǔ)料的速度為0. 5 I. 5mL/min，補(bǔ)料的時(shí)間為0. 5 2h ; 5)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)VLPVPR重組蛋白階段停止補(bǔ)料后，開(kāi)始乳糖誘導(dǎo)，誘導(dǎo)的條件為誘導(dǎo)溫度23 44°C，加入乳糖至終濃度0. I % 2%，誘導(dǎo)時(shí)間為5 8h ; 6)菌體收集將步驟5)的發(fā)酵液離心，取沉淀，用IXPBS緩沖液清洗，收集菌體； 7)獲得降血壓肽將步驟6)制得的菌體超聲破碎，離心，取上清液，即獲得降血壓肽； 8)SDS-PAGE電泳檢測(cè)GST融合蛋白表達(dá)量取獲得的降血壓肽進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)染色和脫色后觀察VLPVPR重組蛋白的表達(dá)情況。
2.如權(quán)利要求
I所述的一種降血壓肽的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養(yǎng)活化在37 °C恒溫培養(yǎng)箱活化18 24h。
3.如權(quán)利要求
I所述的一種降血壓肽的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述接種量為2%，培養(yǎng)溫度為37°C，起始pH為7.0。
4.如權(quán)利要求
I所述的一種降血壓肽的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述誘導(dǎo)溫度為37°C，加入乳糖至終濃度為2%，誘導(dǎo)時(shí)間為6h。
5.如權(quán)利要求
I所述的一種降血壓肽的制備方法，其特征在于在步驟7)中，所述離心為 12000r/min 離心 15min。
專(zhuān)利摘要
一種降血壓肽的制備方法，涉及一種降血壓肽。提供一種生產(chǎn)成本較低，便于進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)的降血壓肽的制備方法。配制固體平板培養(yǎng)基，將凍存的大腸桿菌工程菌涂板后培養(yǎng)活化，再挑取單菌落接種入滅菌后種子培養(yǎng)基中，得工作種子液；將培養(yǎng)基倒入發(fā)酵罐中；滅菌后冷卻，加入消泡劑，將工作種子液接種于發(fā)酵罐中，校正相對(duì)溶氧水平達(dá)100％；在發(fā)酵過(guò)程中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量使DO維持在溶氧為10％～80％，培養(yǎng)后補(bǔ)料；乳糖誘導(dǎo)，加入乳糖至終濃度0.1％～2％，將發(fā)酵液離心，取沉淀，用1×PBS緩沖液清洗，收集菌體；將菌體超聲破碎，離心，取上清液，即獲得降血壓肽。
文檔編號(hào)C12P21/02GKCN101608202 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200910112189
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2009年7月14日
發(fā)明者劉冬, 孫海燕, 唐旭蔚, 李艷, 楊劍, 周麗珍, 李世敏 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2),