專利名稱:一種gfp膜型表達的載體及轉(zhuǎn)染該載體的陽性細胞的分選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及外源目的基因表達陽性細胞的篩選，特別涉及一種GFP(綠色熒光蛋白)膜型表達作為分選標記的真核表達載體，以及利用該載體的進行轉(zhuǎn)染細胞分選的方法。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)代生物技術(shù)中，利用質(zhì)粒或病毒載體將外源基因?qū)胨拗骷毎?，在宿主細胞中擴增、轉(zhuǎn)錄、翻譯從而使外源基因高效表達是一項非常重要的技術(shù)；不管是通過外源基因的導(dǎo)入改變宿主細胞原有的生物學(xué)行為，還是利用宿主細胞表達具有生物學(xué)活性的外源蛋白都有著十分廣泛的應(yīng)用。但該項技術(shù)有一個關(guān)鍵的瓶頸，就是轉(zhuǎn)染效率不高的問題。
一般而言，隨細胞系和轉(zhuǎn)染試劑的不同，轉(zhuǎn)染效率也各不相同，但總體都偏低。由于轉(zhuǎn)染效率的低下，目的基因轉(zhuǎn)染宿主細胞后，不表達外源基因的野生型宿主細胞仍然占大部分；這樣的異質(zhì)性細胞群體對于需要研究的特定細胞而言，大大影響了實驗結(jié)果的科學(xué)性。因而，在基因轉(zhuǎn)染操作完成后，如何從數(shù)量巨大的細胞群中檢測并分選出為數(shù)極少的目的基因轉(zhuǎn)染陽性的細胞、提高轉(zhuǎn)染效率，就成為建立真核細胞表達系統(tǒng)的一個關(guān)鍵。
目前篩選轉(zhuǎn)染陽性細胞常用的方法是在真核表達載體中加入一段藥物抗性基因， 通過在細胞培養(yǎng)體系中加入相應(yīng)的細胞毒性藥物產(chǎn)生選擇壓力進行篩選，例如普遍應(yīng)用的新霉素抗性基因(neor)。其原理在于氨基糖苷類抗生素新霉素及其類似物G418可以通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成從而殺死野生型細胞。真核表達載體上攜帶的neo基因編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，其蛋白產(chǎn)物能夠分解新霉素和G418，可以使轉(zhuǎn)染了目的載體的陽性細胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長。與此原理類似的還有^ocin 抗性選擇、Hygromycine抗性選擇、Puromycine抗性選擇等。
上述的藥物抗性基因篩選技術(shù)雖然可以有效的去除未導(dǎo)入質(zhì)粒的野生型細胞，擴大了基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用范圍，但仍存在不足之處。具體說來，對于瞬時轉(zhuǎn)染而言，盡管抗性基因的表達和目的基因的表達是同步的，但在瞬時表達的較短時間(數(shù)天)內(nèi)，細胞毒性的抗生素還不能夠有效的殺死野生型細胞，轉(zhuǎn)染后的異質(zhì)性細胞群仍不能滿足大多數(shù)實驗的要求；進行抗性篩選往往是要獲得可以長期表達目的基因的穩(wěn)定細胞株，這時由于質(zhì)粒的抗性基因與目的基因分別屬于不同啟動子控制下的兩個轉(zhuǎn)錄本，其整合到宿主細胞基因組的過程是隨機的，因而兩個基因不一定同時整合到基因組，即使整合到同一個細胞的基因組中，由于基因插入的位置影響，兩個基因并不一定同時表達，因此通過抗性基因選擇壓力的方法對轉(zhuǎn)染細胞進行篩選時，最終所獲得的轉(zhuǎn)染細胞其實是抗性基因穩(wěn)定表達的細胞，而研究者所關(guān)心的目的基因表達水平卻成為隨機數(shù)。而且，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞傳代次數(shù)的增加，同時表達抗性基因和目的基因的細胞負荷較只表達抗性基因的細胞負荷要大一些，在細胞群中占的比例將進一步下降(除外目的基因可以促進細胞增殖的個別特殊情況)。這種方案既耗時效率又低，要分選出表達了目的基因的細胞株通常需耗費一個甚至幾個月的時間，而最終獲得的細胞株很有可能仍然是異質(zhì)性細胞群。
所以，為了解決如何獲得高純度表達外源基因的宿主細胞的問題，除了開發(fā)新的轉(zhuǎn)染試劑提高轉(zhuǎn)染效率外，近年來有越來越多的技術(shù)應(yīng)用于如何分選轉(zhuǎn)染了目的基因的陽性細胞。利用轉(zhuǎn)染細胞所獲得的某些特性，比如轉(zhuǎn)染細胞表達特異性染色或熒光蛋白，通過流式細胞儀來進行分選。
綠色熒光蛋白(GFP)來源于維多利亞多管發(fā)光水母，經(jīng)基因工程改造后的突變型 GFP蛋白在488nm激光照射下會發(fā)出綠色熒光，其發(fā)射峰在509nm，處于可見光譜的綠色區(qū)域。GFP作為一種篩選標記，在現(xiàn)有商品化的真核表達載體中一般位于兩處，一是在多克隆位點(MCS)處，目的基因插入MCS后與GFP形成融合表達，即成熟蛋白的N端或C端帶有GFP 標簽；第二種情況是GFP位于核糖體進入位點(IRES)后，轉(zhuǎn)錄成雙順反子，GFP游離表達于細胞質(zhì)內(nèi)部。一般而言，GFP作為篩選標記可以通過流式細胞術(shù)分選出轉(zhuǎn)染陽性的細胞群， 但是普通的流式細胞儀不能進行分選操作，流式分選依賴于昂貴的大型專業(yè)儀器設(shè)備(如 BD公司的FACS Aria型)，所需費用較高且對細胞有一定的損傷，使其推廣應(yīng)用受到限制。
近年來，利用細胞表面的特定蛋白分子，通過抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)來分選某種類型細胞的方法在生命科學(xué)研究和臨床實踐中有著越來越廣泛的應(yīng)用。例如軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院裴雪濤等人的發(fā)明“含有CD34標志基因用于轉(zhuǎn)染細胞分選的載體的構(gòu)建及其應(yīng)用”(公開號CN1712535A)。利用⑶34分子作為篩選標志，可以分選出同時表達目的基因和 CD34分子的轉(zhuǎn)染陽性細胞，但該方案仍然存在影響其廣泛應(yīng)用的弊端CD34分子是哺乳動物細胞的天然蛋白，表達于多種細胞表面，如造血干/祖細胞，以CD34作為標簽蛋白分子， 其應(yīng)用范圍就受到局限。CD34分子可以與CD62L分子發(fā)生特異性相互作用，轉(zhuǎn)染細胞異位表達CD34會對部分細胞學(xué)實驗造成干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種GFP膜型表達的載體，以及轉(zhuǎn)染該載體的陽性細胞的分選方法，克服上述轉(zhuǎn)染效率低、耐藥細胞假陽性高、分選技術(shù)存在局限的缺陷， 簡化傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染細胞篩選過程，提高轉(zhuǎn)染細胞的分選效率。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
一種GFP膜型表達的載體，包括多克隆位點，多克隆位點之后依次連接有核糖體進入位點和編碼綠色熒光蛋白的序列，構(gòu)成多克隆位點與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子； 在核糖體進入位點與編碼綠色熒光蛋白的序列之間插入編碼信號肽的序列，在編碼綠色熒光蛋白的序列終止密碼子之前加入編碼疏水性跨膜區(qū)的序列。
所述的信號肽的序列如SEQ. ID. NO. 1所示；所述的疏水性跨膜區(qū)序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
所述的編碼信號肽的序列如SEQ. ID. NO. 3所示；所述的編碼疏水性跨膜區(qū)的序列如 SEQ. ID. NO. 4 所示。
GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染細胞后的陽性轉(zhuǎn)染細胞的分選方法，，包括以下步驟
1)在GFP膜型表達載體的多克隆位點插入外源目的基因，構(gòu)成外源目的基因與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子；然后在GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞后，收集待分離的細胞制成單細胞懸浮液；[0016]2)將抗GFP單克隆抗體與二抗磁珠混合均勻，使抗GFP單克隆抗體結(jié)合到二抗磁珠的表面；
3)在制成的單細胞懸浮液加入結(jié)合了抗GFP單克隆抗體的二抗磁珠，充分混勻， 使結(jié)合了抗GFP單克隆抗體的二抗磁珠與GFP膜型表達的陽性轉(zhuǎn)染的細胞結(jié)合；
4)在磁場作用下，將結(jié)合了二抗磁珠的陽性轉(zhuǎn)染的細胞與未結(jié)合二抗磁珠的細胞分離；收集結(jié)合了二抗磁珠的陽性轉(zhuǎn)染的細胞，并將磁珠與陽性轉(zhuǎn)染的細胞分離，得到純化的陽性轉(zhuǎn)染的細胞。
所述的二抗磁珠是磁珠通過連接DNA與能夠識別抗GFP單克隆抗體的抗體相連接。
所述的抗GFP單克隆抗體為鼠源性抗體，二抗磁珠是磁珠通過連接DNA與人抗小鼠的單抗連接。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果
1、本發(fā)明提供的GFP膜型表達的載體，綠色熒光蛋白表達后在信號肽的引導(dǎo)下穿出細胞膜，并在疏水性跨膜區(qū)的作用下固著于細胞膜表面，成為陽性轉(zhuǎn)染細胞新的篩選標簽——膜型GFP(mGFP)；而同時由于目的基因插入多克隆位點之后將會與綠色熒光蛋白基因形成轉(zhuǎn)錄雙順反子，實現(xiàn)目的基因和膜型GFP的共表達，這樣膜型GFP就成為了目的基因被表達的陽性轉(zhuǎn)染細胞的表面分子標記。也即，克隆入目的基因的GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染細胞成功之后，會在細胞表面形成獨特的篩選標簽——膜型GFP，而沒有轉(zhuǎn)染成功的則不會形成。
而通過針對GFP單克隆抗體的特異性結(jié)合、免疫磁珠吸附進行分選細胞，并且由于表達的特異性和抗原抗體識別反應(yīng)的特異性，這樣能夠保證所篩選的重組細胞目的基因和GFP篩選標簽陽性表達的一致性；尤其是膜型GFP作為細胞表面分子標記，在篩選的時候只是細胞表面的抗原抗體識別，能夠簡化篩選步驟，實現(xiàn)陽性細胞的快速富集。
2、常用的真核細胞沒有內(nèi)源性GFP基因，除非外源轉(zhuǎn)染，否則不表達膜型GFP分子，膜型GFP作為鑒定或選擇標記不會造成假陽性結(jié)果；而且，真核細胞上不存在可以與 GFP高親和力結(jié)合的天然配體蛋白分子，不會影響表達GFP細胞的生物學(xué)行為，減少了實驗操作對結(jié)果的干擾。
3、本發(fā)明利用基因工程方法使GFP通過跨膜區(qū)序列固定于細胞膜表面，該序列為 29個疏水性氨基酸構(gòu)成，插入細胞膜脂質(zhì)雙層從而將GFP分子固定于細胞膜外表面，并不含有胞質(zhì)區(qū)部分，所以不會轉(zhuǎn)導(dǎo)外界信號而影響細胞的生物學(xué)行為。
4、外源目的基因插入MCS后與mGFP轉(zhuǎn)錄成為一條雙順反子mRNA，綠色熒光蛋白的氨基端連接有信號肽序列，羧基端連接有疏水性氨基酸的跨膜區(qū)序列，細胞轉(zhuǎn)染該表達載體后可以在膜上表達GFP蛋白，同時還可以表達外源目的基因。在同一個啟動子下分別表達兩段基因的開放讀框，使得外源目的基因的表達和細胞表面新標志的表達具有良好的相關(guān)性，而這種相關(guān)性保證了分選出的表達膜標志mGFP的細胞同時也是表達目的基因的細胞。
5、本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)染GFP膜型表達載體的細胞分選方法，通過GFP抗原抗體特異性結(jié)合、免疫磁珠吸附、磁場分選結(jié)合磁珠的陽性細胞的流程，簡化了篩選步驟，可以快速有效富集陽性細胞，而避免了抗生素長期篩選的缺陷，還能夠提高轉(zhuǎn)染陽性細胞的篩選比率，是一種可以高效分選出轉(zhuǎn)染陽性細胞的技術(shù)手段。
一般而言，普通哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染效率在20%左右，即轉(zhuǎn)染后的細胞群中有大約20%的細胞表達目的基因；而通過本技術(shù)的分選，富集陽性細胞，使陽性細胞比例上升到95%以上。


圖1是本發(fā)明構(gòu)建的膜型GFP表達載體pIRES-mGFP的質(zhì)粒圖譜；
圖2是轉(zhuǎn)染膜型GFP表達載體的細胞分選方法的流程示意圖。
具體實施方式
本發(fā)明構(gòu)建了一種GFP膜型表達的載體，在多克隆位點之后依次連接有核糖體進入位點和編碼綠色熒光蛋白的序列，構(gòu)成多克隆位點與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子，使得綠色熒光蛋白與插入多克隆位點的目的基因共表達；而且在編碼綠色熒光蛋白的序列終止密碼子之前加入編碼疏水性跨膜區(qū)的序列；20個疏水性氨基酸的信號肽序列(leading sequence, LS)如 SEQ. ID. NO. 1 所示,作為跨膜區(qū)(transmembrane sequence, TM)的 29 個疏水性氨基酸的序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
這樣使得與目的基因共表達的綠色熒光蛋白在信號肽的引導(dǎo)下穿出細胞膜，并在疏水性跨膜區(qū)的作用下固著于細胞膜表面，成為陽性轉(zhuǎn)染細胞新的篩選標簽——膜型GFP。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)染GFP膜型表達載體的細胞分選方法，不僅簡化了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染細胞篩選煩瑣又耗時的過程，而且提高了轉(zhuǎn)染細胞的分選效率，在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)袕V泛的應(yīng)用。
一種膜型表達綠色熒光蛋白作為分選標記的真核表達載體，編碼綠色熒光蛋白的序列位于核糖體進入位點之后，構(gòu)建成多克隆位點與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子，在核糖體進入位點與編碼綠色熒光蛋白的序列之間插入
下面對GFP膜型表達的載體做詳細說明
首先，選擇綠色熒光蛋白(GFP)作為細胞表面標志分子。GFP作為細胞膜表面標志，有以下幾方面的優(yōu)點1. GFP對細胞毒性極低，瞬時和穩(wěn)定表達均不影響細胞的存活與生物學(xué)行為，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的諸多研究領(lǐng)域；2. GFP三維結(jié)構(gòu)是典型的β 桶形，包含β折疊和α螺旋，將熒光基團包含在其中，具有良好的防淬滅結(jié)構(gòu)，可以耐受較長時間的操作；3. GFP受激發(fā)后發(fā)出明亮的綠色熒光，轉(zhuǎn)染細胞可以通過熒光顯微鏡、板式熒光定量儀或流式細胞儀等多種儀器定性定量的檢測；4.常用的真核細胞沒有內(nèi)源性 GFP基因，除非外源轉(zhuǎn)染，否則不表達GFP分子，作為鑒定或選擇標記不會造成假陽性結(jié)果； 5.在真核細胞上不存在可以與GFP高親和力結(jié)合的天然配體蛋白分子，不會影響表達GFP 細胞的生物學(xué)行為，減少了實驗操作對結(jié)果的干擾。
其次，通過在IRES與GFP之間插入信號肽序列(leading sequence, LS)，在GFP 終止密碼子前加入跨膜區(qū)(transmembrane sequence, TM)序列，該基因工程操作使得GFP 表達后穿出并錨定于細胞膜外側(cè)表面，成為轉(zhuǎn)染細胞新的篩選標簽-膜型GFP，稱為mGFP。 TM序列僅插入細胞膜脂質(zhì)雙層，不含胞質(zhì)區(qū)部分，不會傳遞細胞外信號而影響細胞的生物學(xué)行為。[0038]由于IRES序列的作用，外源目的基因插入MCS后與mGFP轉(zhuǎn)錄成為一條雙順反子 mRNA，在同一個啟動子下分別表達兩段基因的開放讀框(ORF)。因此，宿主細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染操作后，如果膜上表達GFP標簽蛋白，則一定會表達外源目的基因。這樣的基因工程改建，可以使得外源目的基因的表達和細胞表面新標志的表達具有良好的相關(guān)性，而這種相關(guān)性保證了分選出的表達膜標志mGFP的細胞同時也是表達目的基因的細胞。
下面以PIRES2-AcGFPl載體到如圖1所示的PIRES2_mGFP載體的構(gòu)建為實施例， 說明綠色熒光蛋白作為分選標記的真核表達載體的構(gòu)建過程。
pIRES2-AcGFP載體到pIRES2_mGFP載體的構(gòu)建步驟
①化學(xué)合成編碼信號肽與跨膜區(qū)序列的核苷酸，5’端添加BstXI位點，3’端添加 XbaI位點，兩者中間設(shè)計加入BamHI、KpnI, EcoRI, HindIII四種酶切位點(即從5’端到 3，端為BstXI-LS-(BamHI、KpnI, EcoRI, HindIII)-TM-Xbal)，序列以 T-A 克隆方式插入 pUC57-T-simple載體，命名為pUC-LSTM，其中編碼信號肽的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，編碼跨膜區(qū)序列的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
②以pIRES2_AcGFP載體(Clontech公司，貨號63M35)為模板，設(shè)計引物擴增出 GFP,并在GFP片段兩端添加BamHI和HindIII位點，酶切后連入上述pUC_LSTM載體，命名為 pUC-LGT ；
③用BstXI和XbaI酶從上述pUC_LGT載體中切出LS-GFP-TM，并酶切 pIRES-AcGFP，分別膠回收片段和載體；
④連接LS-GFP-TM和切除GFP的pIRES-AcGFP載體，構(gòu)建成功載體pIRES2_mGFP。
通過上述基因工程操作，原有的pIRES2_AcGFP載體改構(gòu)成為表達膜型GFP蛋白的 pIRES2-mGFP 載體。
參見圖2，轉(zhuǎn)染GFP膜型表達載體的細胞分選方法，包括以下步驟
1)通過基因工程方法，將需要研究的目的基因核酸片段插入到上述載體的多克隆位點處，構(gòu)建表達外源目的基因的GFP膜型表達載體；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法或是磷酸鈣介導(dǎo)法或是電穿孔法等方法將構(gòu)建成功的表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，24 48小時后收集轉(zhuǎn)染細胞，制成單細胞懸浮液；
2)將抗GFP單克隆抗體與二抗磁珠混合均勻，使抗GFP單克隆抗體結(jié)合到二抗磁珠的表面；
3)在制成的單細胞懸浮液加入結(jié)合了抗GFP單克隆抗體的二抗磁珠，充分混勻， 使二抗磁珠與陽性轉(zhuǎn)染的細胞表面表達的膜型GFP結(jié)合；
4)利用外界磁場分選出表達膜型GFP的轉(zhuǎn)染陽性細胞，再利用剪切緩沖液 (Releasing Buffer)作用，使表達膜型GFP的轉(zhuǎn)染陽性細胞與免疫磁珠分離，從而得到分選純化的轉(zhuǎn)染陽性細胞。
下面對該方法做詳細說明。主要的商品化試劑和器材抗鼠二抗磁珠 CELLection Pan Mouse IgG Kit 試劑盒(Dynal 公司，貨號 115-31D)；磁架，用來提供外界磁場，采用Dynal MPC-S型磁架(Dynal公司，貨號120-20D) ；RPMI1640細胞培養(yǎng)基 (Hyclone公司)；新生牛血清(四季青公司)；牛血清白蛋白BSA(Sigma公司)；垂直混合儀(寧波新芝公司HS-3型)。
白行配制試劑=PBS緩沖液0. 15mol/L, pH 7. 4 ；Bufferl 含質(zhì)量/體積比為0. 1% BSA的PBS緩沖液；Buffer2 含有體積比為的新生牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基；特異性結(jié)合GFP的鼠源性單克隆抗體FMU-GFP. 5。
1、轉(zhuǎn)染細胞的收集
利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法或是磷酸鈣介導(dǎo)法或是電穿孔法等方法將構(gòu)建成功的表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，24 48小時后收集轉(zhuǎn)染細胞，制成單個細胞懸浮液。
如果宿主細胞是懸浮培養(yǎng)細胞，則1200rpm，5min離心，棄上清，用適當體積的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀；如果是貼壁培養(yǎng)的細胞，需要吸盡培養(yǎng)基，用0. 25%胰酶-0. 02% EDTA-PBS緩沖液進行消化，使細胞變?yōu)閼腋顟B(tài)，然后1200rpm，5min離心，棄上清，用適當體積的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，制成單個細胞懸浮液。
2)抗GFP的單克隆抗體與二抗磁珠的結(jié)合
取100 μ 1 二抗磁珠混懸液(含4Χ IO7個磁珠)，加入Iml Bufferl充分洗滌后， 于磁架上靜置lmin，吸棄上清，加入Iml Bufferl混勻；再加入2 μ g單抗FMU-GFP. 5，置于垂直混勻儀上4°C顛倒混勻30 60min ；于磁架上靜置lmin，吸棄上清，再用BufTerl洗滌 2次。
抗GFP的單克隆抗體可以是商品化試劑或者白行制備，商品化試劑包括Sigma在內(nèi)的多家生物技術(shù)公司都有商品化的單克隆抗體提供。
本發(fā)明的實施例選擇FMU-GFP. 5單抗，該單抗的制備方法免疫原采用的是原核表達的重組GFP蛋白，免疫Balb/c小鼠，取脾細胞與Sp2/0骨髓瘤細胞融合，經(jīng)間接 ELISA法篩選、有限稀釋法克隆化得到可以結(jié)合GFP蛋白的單克隆抗體。具體方法見已公開文獻:Ran Zhuang, Yuan Zhang, Rui Zhang, Chaojun Song, Kun Yang, Angang Yang, Boquan Jin.Purification of GFP fusion proteins with high purity and yield by monoclonal antibody-coupled affinity column chromatography. Protein Expression and Purification. 2008 ；59(1) : 138-143，本領(lǐng)域的研究人員可以方便的從上述文獻公開的實驗室索取FMU-GFP. 5單抗。本步驟所需抗GFP特異性單抗也可以從生物技術(shù)公司購買獲得，例如碧云天生物技術(shù)公司(產(chǎn)品貨號AG^1)。
3)加入結(jié)合有抗GFP單克隆抗體的二抗磁珠
抗GFP的單克隆抗體與二抗磁珠結(jié)合后加入到制成的單個細胞懸浮液中，在液相緩沖系統(tǒng)中，固相化的特異性結(jié)合GFP的GFP抗單克隆抗體可以高親和力的結(jié)合表達膜型 GFP的陽性轉(zhuǎn)染細胞。
4)利用外界磁場分選表達特定膜表面標志的細胞
1、用Bufferl調(diào)整轉(zhuǎn)染細胞密度為1X107，取Iml細胞懸液與結(jié)合有單抗的磁珠混勻，置垂直混勻儀上4°C顛倒混勻20min ；然后于磁架上靜置2min，吸棄上清以去除未結(jié)合磁珠的陰性細胞；加入Iml Bufferl混勻，于磁架上靜置lmin，吸棄上清，重復(fù)3次洗滌細胞，最后一次吸盡上清。
2、加入200μ 1于37°C預(yù)熱的Buffer2重懸細胞，加入4μ 1 DNase I溶液消化連接免疫磁珠與人抗小鼠單抗間的連接DNA(商品化試劑免疫磁珠上具有的連接抗體與磁珠的DNA鏈或連接DNA)，室溫下顛倒混勻15min，用移液器吸頭用力吹打混懸液5 10次以使免疫磁珠與陽性細胞解離。于磁架上靜置anin，吸棄上清，重復(fù)3次洗滌細胞。獲得的細胞即為高純度的轉(zhuǎn)染陽性細胞。[0065]實施例1 :pIRES2-mGFP_CDM6載體的構(gòu)建
將⑶2 基因插入如圖1所示的pIRES2_mGFP載體。⑶2 基因來源于 pEF-BOS-⑶2 載體，根據(jù)pIRES2-mGFP多克隆位點限制性酶切位點和⑶226的開放讀框 ORF基因序列，設(shè)計引物引入BioI和BamHI酶切位點，引物序列和高保真PCR反應(yīng)條件如下
Pl jgcctcgagat ggattatcct actttact 28 (下劃線為 XhoI 位點)
P2 :ggggatcctt aaactctagt ctttggtct 29 (下戈丨」線為 BamHI 位點)
100 μ 1 反應(yīng)體系包括pEF-B0S-CD226 質(zhì)粒 0. 1 μ 1，弓丨物 Pl 禾口 Ρ2 (10 μ Μ)各 5ul， dNTP (2. 5mM) 8ul，高保真 DNA 聚合酶 PrimerStar (TaKaRa 公司)0. 5 μ 1，5 X PCR Buffer 20ul，雙蒸水 81. 4μ 1。反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 5min ；94°C 變性 30sec ； 59°C 退火 45sec，72°C 延伸90sec ；35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0
PCR產(chǎn)物經(jīng)快速純化試劑盒提純后，采用BioI和BamHI進行雙酶切，再次進行快速純化；同時取pIRES2-mGFP用BioI和BamHI進行雙酶切，使用快速純化試劑盒提純。 酶切后的PCR產(chǎn)物和線性載體在T4DNA連接酶作用下連接，條件為16°C，過夜反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli，鋪Kan抗性LB平板，37°C過夜培養(yǎng)后挑取克隆進行鑒定，獲得質(zhì)粒 pIRES2-mGFP-CD226。
實施例2 :pIRES2-mGFP-CDM6載體轉(zhuǎn)染CHO細胞
用含有10%新生牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基在75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CHO細胞，至 80%匯合率，吸盡培養(yǎng)基，用0. 25%胰酶-0. 02% EDTA-PBS緩沖液進行消化，使細胞變?yōu)閼腋顟B(tài)，將細胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中，1200rpm，5min離心，棄上清，用適當體積的電穿孔緩沖液重懸細胞沉淀，然后1200rpm，5min離心棄上清，洗滌細胞2次，制成單個細胞懸浮液，計數(shù)細胞，將細胞重新懸浮于電穿孔緩沖液中，調(diào)整細胞終濃度為IX IO7個細胞/ml。取Iml 細胞懸液放入電轉(zhuǎn)杯中，加入50 μ g重組載體pIRES2-mGFP-⑶226，冰浴lOmin，電穿孔法轉(zhuǎn)染CHO細胞，電穿孔儀參數(shù)設(shè)置電壓300V，電量250 μ F。轉(zhuǎn)染后用適量的培養(yǎng)基稀釋細胞，G418選擇性培養(yǎng)48h，按前述方法收獲細胞。
實施例3 轉(zhuǎn)染陽性細胞的免疫磁珠分選
取IOOul 二抗磁珠混懸液(含4X IO7個磁珠)，加入Iml Bufferl充分洗滌，于磁架上靜置lmin，吸棄上清，加入Iml Bufferl混勻，加入2 μ g單抗FMU-GFP. 5，置于垂直混勻儀上顛倒混勻，4°C，30 60min。于磁架上靜置lmin，吸棄上清，再用Bufferl洗滌2次；
電穿孔轉(zhuǎn)染后CHO細胞常規(guī)培養(yǎng)48小時，使外源基因得以表達。吸盡培養(yǎng)基，用 0. 25%胰酶-0. 02% EDTA-PBS緩沖液進行消化，使細胞變?yōu)閼腋顟B(tài)，將細胞轉(zhuǎn)入15ml離心管中，1200rpm，5min離心，棄上清，用適當體積Bufferl洗滌細胞2次，并調(diào)整細胞密度為 IXlO70取Iml細胞懸液與結(jié)合有單抗的磁珠混勻，置垂直混勻儀上顛倒混勻，4°C，20min ； 然后于磁架上靜置2min，吸棄上清以去除未結(jié)合磁珠的陰性細胞。加入Iml Bufferl混勻， 于磁架上靜置lmin，吸棄上清，重復(fù)3次洗滌細胞，最后一次吸盡上清。
加入200ul于37°C預(yù)熱的Buffer2重懸細胞，8加入如1 DNase I溶液消化連接 DNA,以切斷磁珠與陽性細胞的連接，室溫下顛倒混勻15min，用移液器吸頭用力吹打混懸液 5-10次以使細胞與磁珠分離。于磁架上靜置aiiin，吸棄上清，重復(fù)3次洗滌細胞。獲得的細胞即為高純度的轉(zhuǎn)染陽性細胞，可直接進行下一步的分析或者加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種GFP膜型表達的載體，其特征在于，包括多克隆位點，多克隆位點之后依次連接有核糖體進入位點和編碼綠色熒光蛋白的序列，構(gòu)成多克隆位點與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子；在核糖體進入位點與編碼綠色熒光蛋白的序列之間插入編碼信號肽的序列，在編碼綠色熒光蛋白的序列終止密碼子之前加入編碼疏水性跨膜區(qū)的序列；所述的信號肽的序列如SEQ. ID. NO. 1所示；所述的疏水性跨膜區(qū)序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
2.如權(quán)利要求
1所述的GFP膜型表達的載體，其特征在于，所述的編碼信號肽的序列如 SEQ. ID. NO. 3所示；所述的編碼疏水性跨膜區(qū)的序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
3.權(quán)利要求
1所述的GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染細胞后的陽性轉(zhuǎn)染細胞的分選方法，其特征在于，包括以下步驟1)在GFP膜型表達載體的多克隆位點插入外源目的基因，構(gòu)成外源目的基因與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子；然后在GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞后，收集待分離的細胞制成單細胞懸浮液；2)將抗GFP單克隆抗體與二抗磁珠混合均勻，使抗GFP單克隆抗體結(jié)合到二抗磁珠的表面；3)在制成的單細胞懸浮液加入結(jié)合了抗GFP單克隆抗體的二抗磁珠，充分混勻，使結(jié)合了抗GFP單克隆抗體的二抗磁珠與GFP膜型表達的陽性轉(zhuǎn)染的細胞結(jié)合；4)在磁場作用下，將結(jié)合了二抗磁珠的陽性轉(zhuǎn)染的細胞與未結(jié)合二抗磁珠的細胞分離；收集結(jié)合了二抗磁珠的陽性轉(zhuǎn)染的細胞，并將磁珠與陽性轉(zhuǎn)染的細胞分離，得到純化的陽性轉(zhuǎn)染的細胞。
4.如權(quán)利要求
3所述的GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染細胞后的陽性轉(zhuǎn)染細胞的分選方法，其特征在于，所述的二抗磁珠是磁珠通過連接DNA與能夠識別抗GFP單克隆抗體的抗體相連接。
5.如權(quán)利要求
3所述的GFP膜型表達載體轉(zhuǎn)染細胞后的陽性轉(zhuǎn)染細胞的分選方法，其特征在于，所述的抗GFP單克隆抗體為鼠源性抗體，二抗磁珠是磁珠通過連接DNA與人抗小鼠的單抗連接。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種GFP膜型表達的載體及轉(zhuǎn)染該載體的陽性細胞的分選方法，所述的GFP膜型表達的載體，包括多克隆位點，多克隆位點之后依次連接有核糖體進入位點和編碼綠色熒光蛋白的序列，構(gòu)成多克隆位點與綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄雙順反子；在核糖體進入位點與編碼綠色熒光蛋白的序列之間插入編碼信號肽的序列，在編碼綠色熒光蛋白的序列終止密碼子之前加入編碼疏水性跨膜區(qū)的序列?？寺∪肽康幕虻腉FP膜型表達載體轉(zhuǎn)染細胞成功之后，會在細胞表面形成獨特的篩選標簽——膜型GFP，而沒有轉(zhuǎn)染成功的則不會形成。利益磁場分選結(jié)合磁珠的陽性細胞，簡化了篩選步驟，可以快速有效富集陽性細胞，是一種可以高效分選出轉(zhuǎn)染陽性細胞的技術(shù)手段。
文檔編號C12N5/07GKCN101985634 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010531802
公開日2012年6月13日 申請日期2010年11月4日
發(fā)明者莊然, 張圓, 張宇絲, 李琦, 金伯泉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),