專利名稱:一種rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及細(xì)胞培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。具體而言，本發(fā)明為一種利用無血清無蛋白培養(yǎng)基對重組人白細(xì)胞介素-12工程細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的方法，利用該方法培養(yǎng)重組人白細(xì)胞介素-12工程細(xì)胞，可獲得高產(chǎn)量、高活性的重組人白細(xì)胞介素-12。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素-12 (Human Interleukin 12，hIL-12)是一種異二聚體細(xì)胞因子，由 P35和p40兩個亞單位通過多對二硫鍵連接組成。hIL-12又稱為NK細(xì)胞刺激因子(NKSF)， 具有強(qiáng)烈的抗腫瘤和抗病毒效益，這種效應(yīng)是由機(jī)體的自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells, NK細(xì)胞)介導(dǎo)的，hIL-12還在細(xì)胞毒性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、B細(xì)胞的發(fā)育分化和成熟活化中起重要作用，被譽(yù)為免疫系統(tǒng)行使抗病毒、抗腫瘤的核心調(diào)控因子，機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。這一系列的生物學(xué)功能使人們認(rèn)識到hIL-12有可能在臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。目前，重組人白細(xì)胞介素-12 (Recombinant Human Interleukin 12， rhIL-12)作為一種藥物已經(jīng)進(jìn)入抗腫瘤、抗病毒性疾病和過敏性哮喘的臨床試驗階段，但其規(guī)?；a(chǎn)仍存在一定的困難。因此，通過體外培養(yǎng)獲得高產(chǎn)量、高活性的rhIL-12已成為亟需解決的問題。由于IL-12結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使其無法在E. coli中獲得表達(dá)，必須采用真核表達(dá)體系來獲取重組蛋白。IL-12(p70)分子是由p40和p35兩個不同的亞基組成的異二聚體分子，P40和p35兩個亞基分別由兩個染色體上兩個不同的基因編碼，只有在同一細(xì)胞內(nèi)同時產(chǎn)生才能得到有生物學(xué)活性的二聚體。P40和p35兩個亞基的天然表達(dá)嚴(yán)重不平衡，胞漿中P40的生成大于p35，分泌的p40易于形成二聚體，對IL-12的活性有抑制作用。由于兩條鏈在胞內(nèi)的不平衡表達(dá)，從而很難獲取高表達(dá)rhIL-12的工程細(xì)胞株。此外， rhIL-12在制備過程中極易失活，導(dǎo)致回收率極低，從而限制了產(chǎn)量。目前，用于真核表達(dá)的細(xì)胞主要有酵母細(xì)胞、COS細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、CHO細(xì)胞。前三者因較難直接分泌重組蛋白或不能持續(xù)表達(dá)蛋白產(chǎn)物或培養(yǎng)成本較高，實際應(yīng)用中難以獲得大量產(chǎn)品。CHO細(xì)胞表達(dá)體系， 避免了上述體系的不足，外源蛋白易于分泌到培養(yǎng)基中，能正確組裝多亞基蛋白，外源基因整合穩(wěn)定，能完成翻譯后修飾，能以懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達(dá)到高密度，培養(yǎng)規(guī)模易于放大，已成為表達(dá)外源基因的最佳宿主之一。因此，CHO細(xì)胞成為rhIL-12生產(chǎn)的首選載體。綜合上述原因，經(jīng)過幾年的努力，我們成功建立了高效表達(dá)rhIL-12蛋白的重組CHO細(xì)胞(rhIL-12工程細(xì)胞)，獲得了國家發(fā)明專利(中國專利號zl.03131567.4)，為rhIL-12 工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
無血清培養(yǎng)基為不含人或動物血清的培養(yǎng)基，但可能包含個別蛋白或大量蛋白組分，主要用于一些需要在無血清條件下生長的特殊類型的細(xì)胞及用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的工程細(xì)胞的培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基是工程細(xì)胞培養(yǎng)的重要工具，使細(xì)胞培養(yǎng)在一套限定的條件下進(jìn)行，避免了血清中復(fù)雜成分對后續(xù)研究及臨床使用的干擾及影響。使用無血清培養(yǎng)基對工程細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(1).增加產(chǎn)物的確定性；( .產(chǎn)物性能更加一致；C3).容易進(jìn)行純化和下游加工；(4).細(xì)胞功能的精確評估；( .增強(qiáng)生長和/或產(chǎn)量；(6).生理反應(yīng)性的較好對照；(7).增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測。重組細(xì)胞的培養(yǎng)是基因工程藥物研究與開發(fā)的主要環(huán)節(jié)之一。研究人員一直致力于建立易于操作、產(chǎn)量高、產(chǎn)物活性高、成本低的工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法，其中生物反應(yīng)器在大規(guī)模培養(yǎng)中占重要地位。生物反應(yīng)器按細(xì)胞培養(yǎng)方式不同可分為三類懸浮培養(yǎng)用生物反應(yīng)器、貼壁培養(yǎng)用生物反應(yīng)器、包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)用生物反應(yīng)器不需要使用微載體，細(xì)胞在反應(yīng)器中不貼壁，懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中生長，如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。貼壁培養(yǎng)用生物反應(yīng)器需要使用微載體，微載體懸浮于反應(yīng)器的細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞貼附在微載體上生長， 如攪拌反應(yīng)器(微載體培養(yǎng))、中空纖維反應(yīng)器等。包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器使用多孔載體或微囊，細(xì)胞被截留在載體中或包埋于微囊中，如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。美國NBS (New Brunswick Scientific Co.，inc)公司產(chǎn)生的生物反應(yīng)器就是一種包埋培養(yǎng)用生物反應(yīng)器，其優(yōu)點在于能最大程度降低攪拌剪切力對細(xì)胞的傷害，細(xì)胞容易培養(yǎng)生長，既可以用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，又可用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。
為了減少臨床應(yīng)用風(fēng)險以及便于下游純化過程考慮，我們將rhIL-12工程細(xì)胞在含10%血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐漸減少培養(yǎng)基中的血清含量，最后到無血清培養(yǎng)，進(jìn)行了多種探索，最終選定了 CD CHO無血清培養(yǎng)基作為生產(chǎn)用培養(yǎng)基，rhIL-12工程細(xì)胞能夠在限定化學(xué)成分的⑶CHO無血清培養(yǎng)基中生長并高分泌IL-12，建立了工程細(xì)胞的三級種子庫并經(jīng)中國藥品生物制品檢定所復(fù)檢合格(報告編號SH201000431)。同時我們探索了 rhIL-12工程細(xì)胞從靜止培養(yǎng)放大到發(fā)酵罐規(guī)模培養(yǎng)的方法，建立了 rhIL-12工程細(xì)胞株大規(guī)模無血清培養(yǎng)的工藝流程。在本發(fā)明之前，一些研究人員分別進(jìn)行了將P40和p35的基因分別插入同一種載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(戴燕，陳慰峰.人重組白細(xì)胞介素12在CHO細(xì)胞中的表達(dá).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1998，25 (3) =254-258)，或?qū)40和p35的基因融合構(gòu)建IL-12單鏈真核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)(張梅，司履生，金莉等.重組人單鏈白細(xì)胞介素12 融合基因的構(gòu)建、真核表達(dá)及生物學(xué)活性測定.中華血液學(xué)雜志，2000，21 (12) =636-640), 或?qū)⑥D(zhuǎn)染了 hIL-12的載體細(xì)胞的進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(劉錳，鄭珊珊.重組人細(xì)胞介素12基因在CH0-dhfr_細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá).免疫學(xué)雜志，1996，12 (4) :215-219)，但均未能實現(xiàn)載體細(xì)胞在大規(guī)模的無血清培養(yǎng)情況下高效表達(dá)rhIL-12。應(yīng)用本發(fā)明所建立的工藝對rhIL-12 工程細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)上清經(jīng)Wfestern blot鑒定，在40kD和35kD處出現(xiàn)表達(dá)條帶。無血清培養(yǎng)上清具有促進(jìn)NKG細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力，與國際標(biāo)準(zhǔn)品相比較其活性在(4-6) X106IU/mg之間，rhIL-12(p70)的含量可達(dá)到5mg/L以上，可以連續(xù)灌流60 天。以2臺7.5L發(fā)酵罐同時工作計算，每月可生產(chǎn)約含3000mg rhIL_12(p70)蛋白的無血清培養(yǎng)上清，可滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供了篩選rhIL-12工程細(xì)胞的加壓培養(yǎng)基、生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基及穩(wěn)定的rhIL-12工程細(xì)胞株大規(guī)模培養(yǎng)工藝。
具體而言，本發(fā)明一方面提供一種rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，包括下述步驟
將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞接種于無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為含有終濃度分別為0. 8-1. 2mM的丙酮酸鈉、0. 075-0. 125mM的次黃嘌呤、 0. 012-0. 020mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 5-0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的胞嘧啶核苷、0. 5-0. 9mg/L的尿嘧啶核苷、0. 4-0. 8mg/L的L-谷氨酰胺、0. 4-0. 8mg/L的L-天冬酰胺、1. 5-2. Omg/L的L-脯氨酸、0. 08-0. 125mM的非必需氨基酸的CD CHO液體培養(yǎng)基?？捎糜诒景l(fā)明的rhIL-12工程細(xì)胞可以根據(jù)任何本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建和培養(yǎng)，也可通過2003年5月27日提交的申請?zhí)枮?3131567. 4，公開號為CN1467^2A 的中國專利申請說明書的描述獲得。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法在發(fā)酵罐中進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選地維持所述培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛葹榇蠹s 10mmol/Lo
在本發(fā)明的另一個實施方案中，優(yōu)選地維持所述培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛仍趌Ommol/L 以上，并且控制乳酸濃度在20mmol/L以下。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述rhIL-12工程細(xì)胞可以通過加壓培養(yǎng)基篩選獲得。優(yōu)選地，所述加壓培養(yǎng)基為含有終濃度分別為1. OmM的丙酮酸鈉、0. ImM的次黃嘌呤、
0.016mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 7mg/L的腺嘌呤核苷、0. 7mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 7mg/L的胞嘧啶核苷、0. 7mg/L的尿嘧啶核苷、0. 6mg/L的L-谷氨酰胺、0. 6mg/L的L-天冬酰胺、
1.7mg/L的L-脯氨酸、0. ImM的非必需氨基酸、500 μ M的甲硫氨酸亞砜、800mg/L的G418的 CD CHO液體培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法中，優(yōu)選地還包括灌流培養(yǎng)的步驟。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括收集與保存所述培養(yǎng)基上清中的 rhIL-12的步驟。所述保存可以是-20°C保存。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還包括進(jìn)一步純化的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的rhIL-12含量可以在5mg/L以上，其中rhIL_12中p40 和p35的比例約為1 1。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明提供一種rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，包括下述步驟
1)工程細(xì)胞的靜止培養(yǎng)從工作細(xì)胞庫中復(fù)蘇rhIL-12工程細(xì)胞一支，接種于加
壓培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
2)工程細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞接種于培養(yǎng)袋中
培養(yǎng)；
3)發(fā)酵罐中工程細(xì)胞的無血清培養(yǎng)
3. 1)在發(fā)酵罐中加入生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基，接種細(xì)胞；
3. 2)灌流培養(yǎng)接種細(xì)胞后隨時監(jiān)測溶氧、葡萄糖、乳酸及氨離子濃度的變化，根據(jù)耗氧速率、葡萄糖消耗、乳酸濃度、氨離子濃度及rhIL-12蛋白產(chǎn)生量的變化進(jìn)行灌流， 流量為0. 5-1. 5個罐體積；
3. 3)無血清培養(yǎng)上清的收集與保存以灌流方式添加生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基的同時，收集培養(yǎng)上清于適當(dāng)容器中，-20°C保存；
5[0022]3. 4)無血清培養(yǎng)上清中的rhIL-12的濃度及活性檢測使用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12的濃度，使用Wfestern blot方法鑒定培養(yǎng)上清中p40和p35表達(dá)的平衡情況，并檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12蛋白的活性，即促進(jìn)NKG細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力。
本發(fā)明另一方面還提供一種rhIL-12工程細(xì)胞無血清無蛋白培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為含有終濃度分別為0. 8-1. 2mM的丙酮酸鈉、0. 075-0. 125mM的次黃嘌呤、0. 012-0. 020mM 的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 5-0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的鳥嘌呤核苷、 0. 5-0. 9mg/L的胞嘧啶核苷、0. 5-0. 9mg/L的尿嘧啶核苷、0. 4-0. 8mg/L的L-谷氨酰胺、 0. 4-0. 8mg/L的L-天冬酰胺、1. 5-2. Omg/L的L-脯氨酸、0. 08-0. 125mM的非必需氨基酸的 CD CHO液體培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法如下所述
1.篩選rhIL-12工程細(xì)胞的加壓培養(yǎng)基⑶CHO液體培養(yǎng)基，含丙酮酸鈉 (0. ImM)、次黃嘌呤(0. ImM)、胸腺嘧啶脫氧核苷(0. 016mM)、腺嘌呤核苷(0. 7mg/L)、鳥嘌呤核苷(0. 7mg/L)、胞嘧啶核苷(0. 7mg/L)、尿嘧啶核苷(0. 7mg/L)、L-谷氨酰胺(0. 6mg/ L)、L-天冬酰胺(0. 6mg/L)、L-脯氨酸(1. 7mg/L)、非必需氨基酸(0. ImM)、甲硫氨酸亞砜 (500 μ Μ)、G418 (800mg/L)。括號內(nèi)為該物質(zhì)的終濃度。
2.適合rhIL-12工程細(xì)胞生長并高分泌IL-12的無血清無蛋白培養(yǎng)基⑶CHO 液體培養(yǎng)基，含丙酮酸鈉(0.8-1.2mM)、次黃嘌呤(0.075-0. 125mM)、胸腺嘧啶脫氧核苷 (0. 012-0. 020mM)、腺嘌呤核苷(0. 5-0. 9mg/L)、鳥嘌呤核苷(0. 5-0. 9mg/L)、胞嘧啶核苷 (0. 5-0. 9mg/L)、尿嘧啶核苷(0. 5-0. 9mg/L)、L-谷氨酰胺(0. 4-0. 8mg/L)、L-天冬酰胺 (0. 4-0. 8mg/L)、L-脯氨酸(1. 5-2. Omg/L)、非必需氨基酸(0. 08-0. 125mM)。括號內(nèi)為該物質(zhì)的終濃度。
3. rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝流程
3. 1工程細(xì)胞的靜止培養(yǎng)從工作細(xì)胞庫中(液氮罐)復(fù)蘇rhIL-12工程細(xì)胞一支，并以(1-2) XlO5Ail的密度接種于加壓培養(yǎng)基中，使用250ml培養(yǎng)瓶，37°C，5% 0)2，培養(yǎng)。
3. 2工程細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞經(jīng)無菌Hanks 洗滌(800rpm，10min,25°C )兩遍后，以(2-5) X 104/ml的密度接種于裝有2000ml生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基的10升大小的培養(yǎng)袋中。37°C,5.0% CO2, CO2流速0. 12-0. 18L/min, 6-10rpm/6°，培養(yǎng)。
3. 3發(fā)酵罐中工程細(xì)胞的無血清培養(yǎng)
3. 3. 1發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定使用滅菌蒸餾水將發(fā)酵罐沖洗干凈后，加入5L無菌PBS 溶液，校正PH電極，接通各種氣體導(dǎo)管，攪拌速度150rpm，將套層充滿水，待機(jī)器運(yùn)行平穩(wěn)后，12rC、20min高壓滅菌。再次校正pH電極，將PBS溶液泵出，加入5L生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基，50rpm，37°C、通壓縮空氣，運(yùn)行對小時后。校正溶氧電極，以終濃度為(3-5) X 105/ml 接種細(xì)胞，調(diào)整參數(shù)轉(zhuǎn)速為50rpm-120rpm、溫度為36°C _37°C，溶氧為30% _60%、pH值為 6. 90-7. 20，溫度采用PID自動控制模式，氣體控制采用溶氧_pH聯(lián)動控制模式。
3. 3. 2灌流培養(yǎng)接種細(xì)胞后隨時監(jiān)測溶氧、葡萄糖、乳酸及氨離子濃度的變化， 根據(jù)耗氧速率、葡萄糖消耗、乳酸濃度、氨離子濃度及rhIL-12(p70)蛋白產(chǎn)生量等的變化進(jìn)行灌流，流量為0. 5-1. 5個罐體積。[0033]3. 4無血清培養(yǎng)上清的收集與保存以灌流方式添加生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基的同時，收集培養(yǎng)上清于適當(dāng)容器中，12000g,4°C，離心30分鐘，將離心后上清裝入IOOOml 培養(yǎng)基瓶中，-20°C保存，待純化。
3. 5無血清培養(yǎng)上清中的rhIL-12 (p70)的濃度及活性檢測使用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12 (p70)的濃度，使用flfestern blot方法鑒定培養(yǎng)上清中p40和p35表達(dá)的平衡情況，并檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12蛋白的活性，即促進(jìn)NKG細(xì)胞產(chǎn)生IFN- γ的能力。


圖1. rhIL-12工程細(xì)胞在無血清無蛋白培養(yǎng)基中的基本形態(tài)Q00X)。
圖2. rhIL-12工程細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的生長速率。
圖3.rhIL_12工程細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中產(chǎn)生rhIL_12(p70)蛋白的能力。
圖4. rhIL-12工程細(xì)胞在不同無血清培養(yǎng)基中產(chǎn)生IL_12(p70)蛋白的能力。
注rhIL_12工程細(xì)胞在⑶CHO培養(yǎng)基中rhIL_12(p70)蛋白分泌量明顯高于其他無血清培養(yǎng)基，ρ < 0. 05。
圖5. rhIL-12工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋中的增殖速度。
圖6.rhIL-12工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋中產(chǎn)生rhIL-12(p70)蛋白的能力。
圖7.發(fā)酵罐中殘?zhí)菨舛扰c培養(yǎng)上清中rhIL_12(p70)蛋白濃度的關(guān)系。
圖8.發(fā)酵罐中殘?zhí)菨舛扰c乳酸濃度的關(guān)系。
圖9.發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中rhIL_12(p70)蛋白濃度、乳酸濃度、氨離子濃度和攝氧率的變化。
圖10.發(fā)酵罐培養(yǎng)上清中rhIL-12蛋白p35、p40亞基的表達(dá)情況。
具體實施方式
實施例無血清懸浮狀態(tài)生長的rhIL-12工程細(xì)胞的篩選，適于rhIL-12工程細(xì)胞生長的加壓培養(yǎng)基、生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基的選擇及穩(wěn)定的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝的建立
一、材料
rhIL-12工程細(xì)胞(根據(jù)中國專利公開號CN1467^2A的描述獲得)，原培養(yǎng)基為含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基。DMEM液體培養(yǎng)基、CHO III A液體培養(yǎng)基、CD CHO A液體培養(yǎng)基、⑶CHO液體培養(yǎng)基及SFM液體培養(yǎng)基均購自hvitrogen公司；HyQ SFX-CHO 無血清培養(yǎng)基購自Hyclone公司。100X非必需氨基酸、100X丙酮酸鈉及100XHT購自 Invitrogen公司；腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷和胸腺嘧啶核苷購自 BioBASic公司；L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺和L-脯氨酸購自Sigma公司；新生牛血清(超級)購自上海依科賽生物制品有限公司；0. 22 μ m孔徑的無菌濾器購自Millipore公司；二甲基亞砜、胰蛋白酶購自上海生工生物工程有限公司；G418購自^witrogen公司；甲硫氨酸亞砜購自Sigma公司；Human IL-12 (p70) ELISA檢測試劑盒和Human IFN- y ELISA檢測試劑盒購自Bender公司。
二、主要儀器設(shè)備[0050]微量移液器購自法國Gilson公司，78-1型磁力加熱攪拌器購自江蘇安普電子工程有限公司。凈化工作臺購自山東省濟(jì)南市空氣凈化消毒設(shè)備廠，AvantiTM J-20XP型離心機(jī)購自Beckman公司，超低溫冰箱(_70°C )購自Harris Manufacturing CO.公司，CO2培養(yǎng)箱購自Thermc^orme公司，酶標(biāo)儀購自BIO-RAD公司。波浪式生物反應(yīng)器O/10型)及培養(yǎng)袋購自美國Wave Biotech公司；7. 5L發(fā)酵罐購自美國NBS公司。
三、實驗方法與結(jié)果
1.完全DMEM液體培養(yǎng)基的配制取DMEM液體培養(yǎng)基1000ml，分別加入下列物質(zhì)，括號內(nèi)為該物質(zhì)的終濃度丙酮酸鈉(l.OmM)、次黃嘌呤(0. ImM)、胸腺嘧啶脫氧核苷 (0. 016mM)、腺嘌呤核苷(0. 7mg/L)、鳥嘌呤核苷(0. 7mg/L)、胞嘧啶核苷(0. 7mg/L)、尿嘧啶核苷(0. 7mg/L)、L-谷氨酰胺(0. 6mg/L)、L_ 天冬酰胺(0. 6mg/L)、L_ 脯氨酸(1. 7mg/L)、非必需氨基酸(0. ImM)、新生牛血清(10%，ν/ν)。
2.加壓培養(yǎng)基的配制?、荂HO液體培養(yǎng)基1000ml，分別加入下列物質(zhì)，括號內(nèi)為該物質(zhì)的終濃度丙酮酸鈉(1. OmM)、次黃嘌呤(0. ImM)、胸腺嘧啶脫氧核苷(0. 016mM)、 腺嘌呤核苷(0. 7mg/L)、鳥嘌呤核苷(0. 7mg/L)、胞嘧啶核苷(0. 7mg/L)、尿嘧啶核苷 (0. 7mg/L)、L-谷氨酰胺(0. 6mg/L)、L-天冬酰胺(0. 6mg/L)、L-脯氨酸(1. 7mg/L)、非必需氨基酸(0. ImM)、甲硫氨酸亞砜(500 μ Μ)、G418 (800mg/L)。
3.生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基(I、II、III)的配制?、荂HO液體培養(yǎng)基 1000ml，分別加入下列物質(zhì)，括號內(nèi)為該物質(zhì)的終濃度丙酮酸鈉(0. 8-1. 2mM)、次黃嘌呤 (0. 075-0. 125mM)、胸腺嘧啶脫氧核苷(0. 012-0. 020mM)、腺嘌呤核苷(0. 5-0. 9mg/L)、鳥嘌呤核苷(0. 5-0. 9mg/L)、胞嘧啶核苷(0. 5-0. 9mg/L)、尿嘧啶核苷(0. 5-0. 9mg/L)、L_谷氨酰胺(0. 4-0. 8mg/L)、L-天冬酰胺(0. 4-0. 8mg/L)、L-脯氨酸(1. 5-2. Omg/L)、非必需氨基酸 (0. 08-0. 125mM)。
4.無血清懸浮狀態(tài)生長的rhIL-12工程細(xì)胞的篩選
4. 1實驗方案逐步降低用于rhIL-12工程細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基中的血清含量，由 10%到5%再到1 %，每種血清濃度培養(yǎng)12-14天，期間視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代，之后使用 ⑶CHO加壓培養(yǎng)基按不同比例(由50%到75%再到100% )代替DMEM培養(yǎng)基，每種比例維持培養(yǎng)12-14天，期間視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代，待rhIL-12工程細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長后使用有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選。
4. 2結(jié)果通過無血清馴化培養(yǎng)，rhIL-12工程細(xì)胞可以在⑶CHO加壓培養(yǎng)基中生長傳代并分泌rhIL-12蛋白；利用克隆化篩選的方法共得到10個克隆，命名為 C3. 14. 1-C3. 14. 10，最終確定C3. 14. 6克隆細(xì)胞分泌rhIL-12的量及活性均優(yōu)于C3. 14克隆細(xì)胞，C3. 14. 6克隆細(xì)胞在CD CHO加壓培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)見圖1所示，細(xì)胞的生長速率及產(chǎn)生IL-12蛋白的能力見圖2、圖3所示。
5.生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基的篩選分別使用含無血清無蛋白培養(yǎng)基CD CHO液體培養(yǎng)基，含丙酮酸鈉(0. 8-1. 2mM)、次黃嘌呤(0. 075-0. 125mM)、胸腺嘧啶脫氧核苷 (0. 012-0. 020mM)、腺嘌呤核苷(0. 5-0. 9mg/L)、鳥嘌呤核苷(0. 5-0. 9mg/L)、胞嘧啶核苷 (0. 5-0. 9mg/L)、尿嘧啶核苷(0. 5-0. 9mg/L)、L-谷氨酰胺(0. 4-0. 8mg/L)、L-天冬酰胺 (0. 4-0. 8mg/L)、L-脯氨酸(1. 5-2. Omg/L)、非必需氨基酸(0. 08-0. 125mM)的 CHO III A 液體培養(yǎng)基、CD CHO A液體培養(yǎng)基、CD CHO液體培養(yǎng)基、SFM液體培養(yǎng)基及HyQ SFX-CHO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)rhIL-12工程細(xì)胞，接種細(xì)胞密度為lX105/ml，37°C、5% CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)7 天，每天吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于ELISA檢測rhIL-12的含量并檢測其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，CHO III A液體培養(yǎng)基、CD CHO A液體培養(yǎng)基、CD CHO液體培養(yǎng)基、SFM液體培養(yǎng)基及HyQ SFX-CHO無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)上清中均有IL-12產(chǎn)生，使用CD CHO培養(yǎng)基培養(yǎng)時，CH0-IL12 細(xì)胞培養(yǎng)上清中rhIL-12蛋白含量最高(圖4)。各種培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的rhIL-12蛋白的生物活性均在5.0X106IU/mg左右，培養(yǎng)7天后細(xì)胞活率均在90%以上，無明顯差異。⑶CHO 培養(yǎng)基為化學(xué)成分限定的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中不包含有蛋白、水解產(chǎn)物或未知結(jié)構(gòu)的組分，所有的成分均有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。與無血清培養(yǎng)基和無蛋白、未限定成分的培養(yǎng)基相比，由于不含動物來源的成分，減低了含有對人類健康不利的風(fēng)險因子的可能性，而且其培養(yǎng)效果超過了須添加血清的普通培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基，因此結(jié)合培養(yǎng)基成本、下游純化和工業(yè)化生產(chǎn)的要求，最終選擇CD CHO培養(yǎng)基作為rhIL-12工程細(xì)胞的無血清無蛋白培養(yǎng)基。
6.穩(wěn)定的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝的建立
6. 1使用生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基I培養(yǎng)(優(yōu)選值)
6. 1. 1生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基I :是含有終濃度分別為1. OmM的丙酮酸鈉、0. ImM的次黃嘌呤、0. 016mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 7mg/L的腺嘌呤核苷、0. 7mg/L的鳥嘌呤核苷、 0. 7mg/L的胞嘧啶核苷、0. 7mg/L的尿嘧啶核苷、0. 6mg/L的L-谷氨酰胺、0. 6mg/L的L-天冬酰胺、1. 7mg/L的L-脯氨酸、0. ImM的非必需氨基酸的⑶CHO液體培養(yǎng)基。
6. 1. 2細(xì)胞復(fù)蘇與靜止培養(yǎng)從工作細(xì)胞庫中(液氮罐)復(fù)蘇rhIL-12工程細(xì)胞一支(編號WCB-171)，放入37°C水浴中不斷晃動，使其融化，之后使用75%乙醇消毒后開啟，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入無菌離心管中，加入20ml⑶CHO培養(yǎng)基，800rpm，10min離心細(xì)胞，棄去上清液，重復(fù)洗滌一次。使用25ml加藥⑶CHO培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至250ml 無菌培養(yǎng)瓶中，使用臺盼蘭染色，顯微鏡下計數(shù)總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞活率，結(jié)果為92%，之后37°C，5% CO2培養(yǎng)，每2-3天傳代一次。
6. 1. 3工程細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞經(jīng)無菌 Hanks洗滌(800rpm，10min，25°C )兩遍后，以2X104/ml的密度接種于裝有2000ml生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基I的10升大小的培養(yǎng)袋中。37°C,5.0% CO2, CO2流速0. 12-0. 18L/min, 6-10rpm/6°，培養(yǎng)。工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋中的擴(kuò)增情況及rhIL-12蛋白的分泌情況如下
a.細(xì)胞增殖能力分析細(xì)胞計數(shù)觀察rhIL-12工程細(xì)胞增殖的時效關(guān)系，每天由培養(yǎng)袋取少量細(xì)胞，計數(shù)并檢測細(xì)胞活率，連續(xù)培養(yǎng)7天，結(jié)果表明，rhIL-12工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋的培養(yǎng)條件下具有較快的增殖速度(圖5)，并且細(xì)胞活率均在90%以上。
b.rhIL-12細(xì)胞產(chǎn)生蛋白的能力每天由培養(yǎng)袋中取少量細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測 rhIL-12蛋白的含量及其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，隨培養(yǎng)時間的延長，rhIL-12蛋白的含量逐漸增加(圖6)，其活性一直穩(wěn)定在(5. 0-6. 5) X 106IU/mg左右。
6. 1. 4發(fā)酵罐中工程細(xì)胞的無血清培養(yǎng)
6. 1.4. 1發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定使用滅菌蒸餾水將發(fā)酵罐沖洗干凈后，加入5L無菌PBS 溶液，校正PH電極，接通各種氣體導(dǎo)管，攪拌速度150rpm，將套層充滿水，待機(jī)器運(yùn)行平穩(wěn)后，12rC、20min高壓滅菌。再次校正pH電極，將PBS溶液泵出，加入5L生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基，50rpm，37°C、通壓縮空氣，運(yùn)行對小時后。校正溶氧電極，以終濃度為(3-5) X 105/ml 接種細(xì)胞，調(diào)整參數(shù)轉(zhuǎn)速為50rpm-120rpm、溫度為36°C _37°C，溶氧為30% _60%、pH值為6. 90-7. 20，溫度采用PID自動控制模式，氣體控制采用溶氧_pH聯(lián)動控制模式。
6. 1. 4. 2灌流培養(yǎng)接種細(xì)胞后隨時監(jiān)測溶氧、葡萄糖、乳酸及氨離子濃度的變化，根據(jù)耗氧速率、葡萄糖消耗、乳酸濃度、氨離子濃度及rhIL-12(p70)蛋白產(chǎn)生量等的變化進(jìn)行灌流，流量為0. 5-1. 5個罐體積。通過對培養(yǎng)過程的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛葘ε囵B(yǎng)上清中IL-12的濃度的影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛冗^高和過低時，培養(yǎng)上清中IL-12的濃度都較低，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛葹閘Ommol/L左右時，培養(yǎng)上清中IL-12的表達(dá)量為最高(圖7)。隨著培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛鹊慕档停樗岬臐舛入S之上升(圖8)，氨離子的濃度也略有上升。因此，根據(jù)殘?zhí)菨舛群腿樗釢舛日{(diào)整灌流量、葡萄糖及碳酸氫鈉等的添加，維持發(fā)酵罐中的殘?zhí)菨舛仍趌Ommol/L以上，控制乳酸的濃度在20mmol/L以下，以提高 rhIL-12蛋白的表達(dá)量。培養(yǎng)過程中rhIL-12蛋白濃度、乳酸濃度、氨離子濃度和攝氧率的變化如圖9所示。
6. 1. 5無血清培養(yǎng)上清的收集與保存在灌流生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基I的同時，收集培養(yǎng)上清于適當(dāng)容器中，12000g，4°C，離心30分鐘，將離心后上清裝入IOOOml培養(yǎng)基瓶中，-20°C保存，待純化，整個培養(yǎng)過程持續(xù)65天，共收集培養(yǎng)上清300L。
6. 1. 6無血清培養(yǎng)上清中的rhIL-12 (p70)的濃度及活性檢測使用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12 (p70)的濃度，300L培養(yǎng)上清中rhIL-12 (p70)的平均濃度為5. 8mg/ L ；使用Western blot方法鑒定培養(yǎng)上清中p40和p35表達(dá)的平衡情況，結(jié)果表明，無血清培養(yǎng)上清中P40和p35均有表達(dá)，并且比例接近1 1(圖10)；同時檢測培養(yǎng)上清中IL-12 蛋白的活性，以NIBSC標(biāo)準(zhǔn)品(WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品)為對照，應(yīng)用NKG細(xì)胞IFN- γ誘生法，測定無血清培養(yǎng)上清中rhIL-12的活性，結(jié)果表明，不同批次的rhIL-12比活均在4. OX IO6IU/ mg以上。
6. 2使用生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基II培養(yǎng)(下限值)
6. 2. 1生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基II 是含有終濃度分別為0. SmM的丙酮酸鈉、0. 075mM 的次黃嘌呤、0. 012mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 5mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 5mg/L的胞嘧啶核苷、0. 5mg/L的尿嘧啶核苷、0. 4mg/L的L-谷氨酰胺、0. 4mg/L的 L-天冬酰胺、1. 5mg/L的L-脯氨酸、0. OSmM的非必需氨基酸的⑶CHO液體培養(yǎng)基。
6. 2. 2細(xì)胞復(fù)蘇與靜止培養(yǎng)實驗方法同6. 1. 2。
6. 2. 3工程細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞經(jīng)無菌 Hanks洗滌(800rpm，10min，25°C )兩遍后，以2X104/ml的密度接種于裝有2000ml生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基II的10升大小的培養(yǎng)袋中。37°C,5.0% CO2, CO2流速0. 12-0. 18L/min, 6-10rpm/6°，培養(yǎng)。工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋中的擴(kuò)增情況及rhIL-12蛋白的分泌情況如下
a.細(xì)胞增殖能力分析細(xì)胞計數(shù)觀察rhIL-12工程細(xì)胞增殖的時效關(guān)系，每天由培養(yǎng)袋取少量細(xì)胞，計數(shù)并檢測細(xì)胞活率，連續(xù)培養(yǎng)7天，結(jié)果表明，rhIL-12工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋的培養(yǎng)條件下具有較快的增殖速度(圖5)，并且細(xì)胞活率均在90%以上。
b.rhIL-12細(xì)胞產(chǎn)生蛋白的能力每天由培養(yǎng)袋中取少量細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測 rhIL-12蛋白的含量及其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，隨培養(yǎng)時間的延長，rhIL-12蛋白的含量逐漸增加(圖6)，其活性一直穩(wěn)定在(5. 0-6. 5) X 106IU/mg左右。
6. 2. 4發(fā)酵罐中工程細(xì)胞的無血清培養(yǎng)
6. 2. 4. 1發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定使用滅菌蒸餾水將發(fā)酵罐沖洗干凈后，加入5L無菌PBS
10溶液，校正PH電極，接通各種氣體導(dǎo)管，攪拌速度150rpm，將套層充滿水，待機(jī)器運(yùn)行平穩(wěn)后，121°C、20min高壓滅菌。再次校正pH電極，將PBS溶液泵出，加入5L生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基11，50印!11，371、通壓縮空氣，運(yùn)行對小時后。校正溶氧電極，以終濃度為(3- XlO5Ail 接種細(xì)胞，調(diào)整參數(shù)轉(zhuǎn)速為50rpm-120rpm、溫度為36°C _37°C，溶氧為30% _60%、pH值為 6. 90-7. 20，溫度采用PID自動控制模式，氣體控制采用溶氧_pH聯(lián)動控制模式。
6. 2. 4. 2灌流培養(yǎng)接種細(xì)胞后隨時監(jiān)測溶氧、葡萄糖、乳酸及氨離子濃度的變化，根據(jù)耗氧速率、葡萄糖消耗、乳酸濃度、氨離子濃度及rhIL-12(p70)蛋白產(chǎn)生量等的變化進(jìn)行灌流，流量為0. 5-1. 5個罐體積。通過對培養(yǎng)過程的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛葘ε囵B(yǎng)上清中IL-12的濃度的影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛冗^高和過低時，培養(yǎng)上清中IL-12的濃度都較低，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛葹閘Ommol/L左右時，培養(yǎng)上清中IL-12的表達(dá)量為最高(圖7)。隨著培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛鹊慕档?，乳酸的濃度隨之上升(圖8)，氨離子的濃度也略有上升。因此，根據(jù)殘?zhí)菨舛群腿樗釢舛日{(diào)整灌流量、葡萄糖及碳酸氫鈉等的添加，維持發(fā)酵罐中的殘?zhí)菨舛仍趌Ommol/L以上，控制乳酸的濃度在20mmol/L以下，以提高 rhIL-12蛋白的表達(dá)量。培養(yǎng)過程中rhIL-12蛋白濃度、乳酸濃度、氨離子濃度和攝氧率的變化如圖9所示。
6. 2. 5無血清培養(yǎng)上清的收集與保存在灌流生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基II的同時，收集培養(yǎng)上清于適當(dāng)容器中，12000g, 4°C，離心30分鐘，將離心后上清裝入IOOOml培養(yǎng)基瓶中，-20°C保存，待純化，整個培養(yǎng)過程持續(xù)65天，共收集培養(yǎng)上清310L。
6. 2.6無血清培養(yǎng)上清中的1^11^-12( 70)的濃度及活性檢測使用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12(p70)的濃度，300L培養(yǎng)上清中rhIL_12(p70)的平均濃度為 5. 75mg/L ；使用Wfestern blot方法鑒定培養(yǎng)上清中p40和p35表達(dá)的平衡情況，結(jié)果表明， 無血清培養(yǎng)上清中P40和p35均有表達(dá)，并且比例接近1 1(圖10)；同時檢測培養(yǎng)上清中IL-12蛋白的活性，以NIBSC標(biāo)準(zhǔn)品(WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品)為對照，應(yīng)用NKG細(xì)胞IFN- γ 誘生法，測定無血清培養(yǎng)上清中rhIL-12的活性，結(jié)果表明，不同批次的rhIL-12比活均在 4. 0X106IU/mg 以上。
6. 3使用生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基III培養(yǎng)(上限值)
6. 3. 1生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基III 是含有終濃度分別為1. 2mM的丙酮酸鈉、0. 125mM 的次黃嘌呤、0. 020mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 9mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 9mg/L的胞嘧啶核苷、0. 9mg/L的尿嘧啶核苷、0. 8mg/L的L-谷氨酰胺、0. 8mg/L的 L-天冬酰胺、2. 0mg/L的L-脯氨酸、0. 125mM的非必需氨基酸的⑶CHO液體培養(yǎng)基。
6. 3. 2細(xì)胞復(fù)蘇與靜止培養(yǎng)實驗方法同6. 1. 2。
6. 3. 3工程細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞經(jīng)無菌 Hanks洗滌(800rpm，10min，25°C )兩遍后，以2X104/ml的密度接種于裝有2000ml生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基III的10升大小的培養(yǎng)袋中。37°C,5.0% CO2, CO2流速0. 12-0. 18L/min, 6-10rpm/6°，培養(yǎng)。工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋中的擴(kuò)增情況及rhIL-12蛋白的分泌情況如下
a.細(xì)胞增殖能力分析細(xì)胞計數(shù)觀察rhIL-12工程細(xì)胞增殖的時效關(guān)系，每天由培養(yǎng)袋取少量細(xì)胞，計數(shù)并檢測細(xì)胞活率，連續(xù)培養(yǎng)7天，結(jié)果表明，rhIL-12工程細(xì)胞在培養(yǎng)袋的培養(yǎng)條件下具有較快的增殖速度(圖5)，并且細(xì)胞活率均在90%以上。
b.rhIL-12細(xì)胞產(chǎn)生蛋白的能力每天由培養(yǎng)袋中取少量細(xì)胞培養(yǎng)上清，檢測rhIL-12蛋白的含量及其生物學(xué)活性。結(jié)果表明，隨培養(yǎng)時間的延長，rhIL-12蛋白的含量逐漸增加(圖6)，其活性一直穩(wěn)定在(5. 0-6. 5) X 106IU/mg左右。
6. 3. 4發(fā)酵罐中工程細(xì)胞的無血清培養(yǎng)
6. 3. 4. 1發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)定使用滅菌蒸餾水將發(fā)酵罐沖洗干凈后，加入5L無菌PBS 溶液，校正PH電極，接通各種氣體導(dǎo)管，攪拌速度150rpm，將套層充滿水，待機(jī)器運(yùn)行平穩(wěn)后，121°C、20min高壓滅菌。再次校正pH電極，將PBS溶液泵出，加入5L生產(chǎn)用無血清培養(yǎng)基111，50印!11，371、通壓縮空氣，運(yùn)行對小時后。校正溶氧電極，以終濃度為(3- XlO5Ail 接種細(xì)胞，調(diào)整參數(shù)轉(zhuǎn)速為50rpm-120rpm、溫度為36°C _37°C，溶氧為30% _60%、pH值為 6. 90-7. 20，溫度采用PID自動控制模式，氣體控制采用溶氧_pH聯(lián)動控制模式。
6. 3. 4. 2灌流培養(yǎng)接種細(xì)胞后隨時監(jiān)測溶氧、葡萄糖、乳酸及氨離子濃度的變化，根據(jù)耗氧速率、葡萄糖消耗、乳酸濃度、氨離子濃度及rhIL-12(p70)蛋白產(chǎn)生量等的變化進(jìn)行灌流，流量為0. 5-1. 5個罐體積。通過對培養(yǎng)過程的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛葘ε囵B(yǎng)上清中IL-12的濃度的影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛冗^高和過低時，培養(yǎng)上清中IL-12的濃度都較低，當(dāng)培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛葹閘Ommol/L左右時，培養(yǎng)上清中IL-12的表達(dá)量為最高(圖7)。隨著培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛鹊慕档?，乳酸的濃度隨之上升(圖8)，氨離子的濃度也略有上升。因此，根據(jù)殘?zhí)菨舛群腿樗釢舛日{(diào)整灌流量、葡萄糖及碳酸氫鈉等的添加，維持發(fā)酵罐中的殘?zhí)菨舛仍趌Ommol/L以上，控制乳酸的濃度在20mmol/L以下，以提高 rhIL-12蛋白的表達(dá)量。培養(yǎng)過程中rhIL-12蛋白濃度、乳酸濃度、氨離子濃度和攝氧率的變化如圖9所示。
6. 3. 5無血清培養(yǎng)上清的收集與保存在灌流生產(chǎn)用無血清無蛋白培養(yǎng)基II的同時，收集培養(yǎng)上清于適當(dāng)容器中，12000g, 4°C，離心30分鐘，將離心后上清裝入IOOOml培養(yǎng)基瓶中，-20°C保存，待純化，整個培養(yǎng)過程持續(xù)64天，共收集培養(yǎng)上清^5L。
6. 3. 6無血清培養(yǎng)上清中的rhIL_12(p70)的濃度及活性檢測使用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中rhIL-12(p70)的濃度，300L培養(yǎng)上清中rhIL_12(p70)的平均濃度為 5. 70mg/L ；使用Wfestern blot方法鑒定培養(yǎng)上清中p40和p35表達(dá)的平衡情況，結(jié)果表明， 無血清培養(yǎng)上清中P40和p35均有表達(dá)，并且比例接近1 1(圖10)；同時檢測培養(yǎng)上清中IL-12蛋白的活性，以NIBSC標(biāo)準(zhǔn)品(WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品)為對照，應(yīng)用NKG細(xì)胞IFN- γ 誘生法，測定無血清培養(yǎng)上清中rhIL-12的活性，結(jié)果表明，不同批次的rhIL-12比活均在 4. 0X106IU/mg 以上。
使用本發(fā)明建立的工藝流程培養(yǎng)rhIL-12工程細(xì)胞，培養(yǎng)上清中rhIL_12蛋白的含量可達(dá)5mg/L以上，蛋白活性在4. 0X106IU/mg以上，rhIL-12的含量、活性均可滿足下游純化及臨床應(yīng)用的要求，特別是無血清無蛋白培養(yǎng)基的應(yīng)用可以減少純化的步驟和成本、 降低臨床應(yīng)用的風(fēng)險，為IL-12蛋白的理論研究及臨床應(yīng)用提供了技術(shù)保障。
權(quán)利要求
1.一種rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，包括下述步驟將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞接種于無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為含有終濃度分別為0. 8-1. 2mM的丙酮酸鈉、0. 075-0. 125mM的次黃嘌呤、 0. 012-0. 020mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 5-0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的胞嘧啶核苷、0. 5-0. 9mg/L的尿嘧啶核苷、0. 4-0. 8mg/L的L-谷氨酰胺、0. 4-0. 8mg/L的L-天冬酰胺、1. 5-2. Omg/L的L-脯氨酸、0. 08-0. 125mM的非必需氨基酸的⑶CHO液體培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中所述培養(yǎng)在發(fā)酵罐中進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中維持所述培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛葹閘Ommol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3中任意一項所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中維持所述培養(yǎng)基中的殘?zhí)菨舛仍趌Ommol/L以上，并且控制乳酸濃度在20mmol/L以下。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-4中任意一項所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法， 其中所述rhIL-12工程細(xì)胞通過加壓培養(yǎng)基篩選獲得，所述加壓培養(yǎng)基為含有終濃度分別為1. OmM的丙酮酸鈉、0. ImM的次黃嘌呤、0. 016mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 7mg/L的腺嘌呤核苷、0. 7mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 7mg/L的胞嘧啶核苷、0. 7mg/L的尿嘧啶核苷、0. 6mg/L的 L-谷氨酰胺、0. 6mg/L的L-天冬酰胺、1. 7mg/L的L-脯氨酸、0. ImM的非必需氨基酸、500 μ M 的甲硫氨酸亞砜、800mg/L的G418的CD CHO液體培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1-5中任意一項所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中包括灌流培養(yǎng)的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1-6中任意一項所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中包括收集與保存所述培養(yǎng)基上清中的rhIL-12的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1-7中任意一項所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中通過所述方法獲得的rhIL-12含量在5mg/L以上。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1-8中任意一項所述的rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，其中通過所述方法獲得的rhIL-12中p40和p35的比例為1:1。
10.一種rhIL-12工程細(xì)胞無血清無蛋白培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基為含有終濃度分別為 0. 8-1. 2mM的丙酮酸鈉、0. 075-0. 125mM的次黃嘌呤、0. 012-0. 020mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0. 5-0. 9mg/L的腺嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的鳥嘌呤核苷、0. 5-0. 9mg/L的胞嘧啶核苷、.0.5-0. 9mg/L的尿嘧啶核苷、0. 4-0. 8mg/L的L-谷氨酰胺、0. 4-0. 8mg/L的L-天冬酰胺、.1.5-2. 0mg/L的L-脯氨酸、0. 08-0. 125mM的非必需氨基酸的CD CHO液體培養(yǎng)基。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供了一種rhIL-12工程細(xì)胞大規(guī)模無血清培養(yǎng)方法，包括下述步驟將處于對數(shù)生長期的rhIL-12工程細(xì)胞接種于無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基為含有終濃度分別為0.8-1.2mM的丙酮酸鈉、0.075-0.125mM的次黃嘌呤、0.012-0.020mM的胸腺嘧啶脫氧核苷、0.5-0.9mg/L的腺嘌呤核苷、0.5-0.9mg/L的鳥嘌呤核苷、0.5-0.9mg/L的胞嘧啶核苷、0.5-0.9mg/L的尿嘧啶核苷、0.4-0.8mg/L的L-谷氨酰胺、0.4-0.8mg/L的L-天冬酰胺、1.5-2.0mg/L的L-脯氨酸、0.08-0.125mM的非必需氨基酸的CD CHO液體培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供在本發(fā)明的方法中使用的培養(yǎng)基。利用本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法可獲得高產(chǎn)量、高活性的重組人白細(xì)胞介素-12。
文檔編號C12N5/10GKCN102268407SQ201110208009
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月20日
發(fā)明者孫汭, 田志剛, 程民, 費保珍, 鄭曉東, 魏海明 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan