專利名稱：一種突變型載體pEGFP-N1m的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種商業(yè)化質(zhì)粒PEGFP-Nl被改造為一種突變 型載體pEGFP-Nlm的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
參錄fe—力胃θ (Green Fluorescent Protein, GFP) ΜΨ^^ Aequorea victoria 的水母體內(nèi)產(chǎn)生的一種能夠發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。GFP是一種由238個氨基酸(分子量約 27KDa)組成的發(fā)光蛋白質(zhì)——aequorin，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光； GFP是典型的β桶形結(jié)構(gòu)，包含β折疊和α螺旋，將熒光基團包含在其中，嚴(yán)密的桶形結(jié) 構(gòu)保護著熒光基團，防止它被周圍環(huán)境淬滅，內(nèi)部面向桶形的側(cè)鏈誘導(dǎo)Ser65-Tyr66-Gly67 三肽環(huán)化，導(dǎo)致熒光基團形成(詳見參考文獻Zimmer M. Chem. Soc. Rev.，2009，38， 2823-32)。由于GFP與其他蛋白形成的融合蛋白幾乎不會影響其原本的蛋白活性或流動 性，也幾乎不會產(chǎn)生細(xì)胞毒性，故在細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)研究中，GFP作為一種重要的 報告基因(importer gene)被廣泛應(yīng)用。在應(yīng)用上，能夠使GFP與目的基因發(fā)生基因重組， 波長約490nm的紫外線激發(fā)下，用顯微鏡觀察綠色熒光的分布，因而可用于標(biāo)記活體生物 樣品。盡管野生型GFP能夠發(fā)出絢麗的熒光，但它還是有不少缺點，比如有兩個激發(fā)峰、 光穩(wěn)定性不好、在37°C時不能正確地折疊等等。1996年Remington小組最先在Science雜 志上發(fā)表了 GFP的S65T突變體晶體結(jié)構(gòu)后，人們更好地了解到GFP發(fā)光基團的組成以及與 周圍殘基的相互作用等。研究人員通過定點或隨機突變，不斷地改造這些殘基，得到了我們 今天使用的GFP衍生物。華裔科學(xué)家錢永健(Roger Y Tsien)于1994年開始改造GFP，并在 1995年完成了 GFP單點突變(S65T)。這個突變顯著提高了 GFP的光譜性質(zhì)，且熒光強度和 光穩(wěn)定性也大大增強。突變后的GFP激發(fā)波長轉(zhuǎn)移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，這和 常用的FITC濾光片匹配，提高了 GFP的應(yīng)用潛力。而F64L點突變則改善了 GFP在37°C的 折疊能力，這樣產(chǎn)生了增強型 GFP (Enhanced Green Fluorecence Protein, EGFP)，也就是 現(xiàn)在科研上所常用的EGFP。EGFP是一種優(yōu)化的突變型綠色熒光蛋白，其熒光比野生型的強 35倍，大大增強了其報告基因的敏感度，同時具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高效表達、無種系依賴性等特 點，更適用于細(xì)胞基因表達和蛋白定位檢測及細(xì)胞示蹤標(biāo)記。因此，EGFP在研究中常作為一 種重要的報告基因被應(yīng)用詳見參考文獻1) Zimmer M. Chem. Soc. Rev.，2009，38，2823-32 ； 2)Phillips GJ. FEMS Microbiol Lett，2001，204，9-18。pEGFP-m載體(質(zhì)粒圖譜見圖1)是一種商業(yè)化的真核細(xì)胞表達載體，攜帶有 EGFP蛋白的表達基因，可融合于目的蛋白的N端，穩(wěn)定、高效地在多種異源生物中表達且無 細(xì)胞毒性，在生物醫(yī)學(xué)研究中常作為一種重要的研究工具被使用。在實際應(yīng)用中，通常將 PEGFP-Nl載體與目的基因進行重組連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、表達融合蛋白，然 后觀察細(xì)胞是否表達綠色熒光蛋白、以及確定該融合蛋白的亞細(xì)胞定位。然而，在實際應(yīng)用過程中，由于融合蛋白表達序列中的第二個翻譯起始位點ATG在EGFP表達序列上的存在，有可能會在融合蛋白得到表達的同時，會另外表達出一個單 獨的EGFP蛋白，這種情況在文獻報道中已經(jīng)屢見不鮮(詳見參考文獻Jackson RJ, et al.NAT REV MOL CELL BIO.，2010，11，113-27)。例如，F(xiàn)GF-2 基因能夠表達出一種分子量 大小約為ISkDa的、特異性地定位于細(xì)胞核仁中的纖維原細(xì)胞生長因子；當(dāng)FGF-2基因的開 放閱讀框(open read frame, 0RF)被重組克隆到pEGFP-Nl載體上之后，研究其亞細(xì)胞的定 位情況時，除了如預(yù)期的在細(xì)胞核中表達融合蛋白外，還可以在細(xì)胞質(zhì)中觀察到額外表達 較弱的綠色熒光蛋白GFP ；這些結(jié)果通過蛋白表達檢測和共聚焦顯微鏡觀察均可以得到證 實，這明顯地影響了目的蛋白亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性(詳見參考文獻Sheng J，et al. J. Biol. Chem.，2004，279，40153-60)。又如，SARS_CoV3a 蛋白是存在于 SARS 病毒內(nèi)的 一種獨特蛋白，其大小為28kDa，主要定位于細(xì)胞質(zhì)的高爾基體；當(dāng)CoV3a蛋白的ORF被重 組克隆到pEGFP-Nl載體之后，同樣在細(xì)胞中其他部位也表達了額外的綠色熒光蛋白GFP， 這些都影響了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性(詳見參考文獻Yuan X，et al. Virus Res.，2005，109， 191-202)。此外，本室于2007年發(fā)表的相關(guān)研究結(jié)果表明對于一種成熟肽只有23aa的鉀 通道蝎毒素Bmkk2而言，當(dāng)其表達序列被克隆到pEGFP-m載體之后，很難得到融合蛋白；而 將EGFP蛋白的翻譯起始位點ATG突變后，則能夠明顯地提高融合蛋白的表達量(詳見參考 文獻Dai C, et al. CELL. M0L. BIOL. LETT.，2007，12，362-9)。這些實驗證據(jù)充分說明，當(dāng) 我們將能夠表達分子量接近或小于EGFP蛋白的ORF克隆進入pEGFP-Nl質(zhì)粒后，由于“滲漏 掃描”和“翻譯重起始”現(xiàn)象的存在詳細(xì)的分子機制參見文獻l)Poyry，ΤΑ, et al. Genes Dev.，2004，18,62-75 ；2)Jackson RJ,et al. NAT REV MOL CELL BIO.，2010，11，113-27 ；3) Kozak Μ. Gene, 2002，299，1-34],當(dāng)?shù)诙€翻譯起始位點ATG與前一個翻譯起始位點的距離 越為接近，就越容易使得核糖體從第二個ATG開始翻譯；而當(dāng)上游開放閱讀框較長或是上 游開放閱讀框含有穩(wěn)定的RNA 二級結(jié)構(gòu)時，重掃描和翻譯重起始發(fā)生的可能性會明顯地減 少。因此，為了改善pEGFP-Nl質(zhì)粒在被克隆進入較短的ORF后可能表達額外的EGFP 蛋白而影響融合蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果或影響融合蛋白的表達量這一缺陷，本發(fā)明通過定 點突變研究手段，將pEGFP-Nl質(zhì)粒上EGFP蛋白表達序列的Kozak序列進行了突變(采 用定點突變方式，將pEGFP-Nl質(zhì)粒中EGFP翻譯起始位點的Kozak序列CCACCATGG突變 為CCtCCcTGt)，得到了一種突變型載體pEGFP-Nlm。將該突變型載體與現(xiàn)有的商業(yè)化載體 PEGFP-Nl結(jié)合使用，可以明顯改善pEGFP-Nl載體在使用過程中的上述缺陷，提高了分子量 接近或小于EGFP的蛋白多肽在亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及提高融合蛋白的表達 效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建方法及 其應(yīng)用。本發(fā)明中所涉及的突變型載體pEGFP-Nlm，結(jié)合pEGFP-Nl —起應(yīng)用，能夠顯著提高 分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽在亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及提高融合蛋白 的表達效率。本發(fā)明所提供的突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建方法，包括如下步驟1)引物設(shè)計采用的上游引物序列為5’
-GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGG GCGAGG-3，，下游引物序列為5，-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3，；2) PCR定點突變以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，進行PCR反應(yīng)；3)回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物，常規(guī)方法進行酶切、連接和轉(zhuǎn)化；4)陽性克隆篩選以及測序鑒定，完成突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建。本發(fā)明選取分子量大于、等于或小于EGFP的、亞細(xì)胞定位已知的蛋白多肽的表達 序列，分別將這些表達序列克隆進入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm，構(gòu)建相應(yīng)的表達載體；通過 Western blot分析和共聚焦顯微鏡觀察方法，證實突變型載體pEGFP-Nlm可以顯著提高分 子量約等于或小于EGFP的蛋白多肽的亞細(xì)胞定位結(jié)果的準(zhǔn)確性以及提高融合蛋白的表達 效率。本發(fā)明中所得到的突變型載體pEGFP-Nlm，具有明顯改善分子量約等于或小于 EGFP蛋白的多肽分子在亞細(xì)胞定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，為該商業(yè)質(zhì)粒的進一步開發(fā)應(yīng)用提供了 重要的實驗數(shù)據(jù)。


圖1 pEGFP-Nl載體的模式圖(引自Clontech公司技術(shù)手冊)。圖2本發(fā)明中pEGFP-Nl載體上EGFP蛋白表達序列中Kozak序列的突變策略，即 將原Kozak序列CCACCATGG(圖1中的674-682位核苷酸序列)突變?yōu)镃CtCCcTGt。圖3利用pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm構(gòu)建的多種表達質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜。泳道1和 5 =DNA marker ；泳道 2 :KRAB-EGFP_N1 ；泳道 3 和 4 =KRAB-EGFP-Nlm ；泳道 6 =Tat-EGFP-Nl ； 泳道 7 :Tat-EGFP-mm。圖4 PK-EGFP融合蛋白的Western blot檢測圖譜。
圖5 PK-EGFP融合蛋白的共聚焦顯微鏡觀測。圖6融合蛋白KRAB-EGFP的Western blot檢測圖譜。圖7融合蛋白KRAB-EGFP的共聚焦顯微鏡觀察。圖8融合蛋白EGFP-Tat的共聚焦顯微鏡觀察。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明具體應(yīng)用方法。下列實施例中未注明具 體實驗條件的實驗方法，按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等編，《分子克隆實驗室手冊》 (New York Co Id Spring Harbor laboratory Press, 2002)中所述的實驗條件，或按照制 造廠商所建議的實驗條件。實施例1 突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建將pEGFP-Nl載體中EGFP核苷酸表達序列的翻譯起始位點ATG及其附近的Kozak 序列采用PCR定點突變技術(shù)進行突變(如圖2)，使其不能得到表達；只有當(dāng)插入帶有翻譯 起始位點ATG及Kozak序列的外源基因片段之后才會高效地表達出“靶基因-EGFP融合蛋白”。一、構(gòu)建突變型載體pEGFP-Nlm的引物設(shè)計與合成采用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5. O進行突變引物設(shè)計，上游引物序列為
55’ -GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGGGCGAGG-3’,下游引物序列為5，-CCTCGCCCTTGCTC AACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3’ (下劃線所標(biāo)注的序列即為定點突變的序列)。本發(fā)明中所用到的引物核苷酸序列均由深圳華大基因公司合成。二、PCR定點突變以本室保存的pEGFP-Nl質(zhì)粒(由本室購自Clontech公司)為模板，采用PCR定 點突變方法(采用上述引物)進行突變。構(gòu)建如下PCR反應(yīng)體系pEGFP-Nl 質(zhì)粒(0. 2 μ g/μ 1) 1 μ 1 ；MgSO4 (25mmol/L) 1 μ 1 ；dNTP(dGTP、dATP、 dTTP、dCTP 各 5mmol/L) 1 μ 1 ；國產(chǎn) K0D+DNA 聚合酶0. 5 μ 1 ； IOX K0D+DNA 聚合酶緩沖 液2. 5μ 1 ；上游引物(10ymol/L) 0. 25 μ 1 ；下游引物(10ymol/L) 0. 25 μ 1 ；無菌雙蒸 水18. 5 μ 1，反應(yīng)體積為25 μ 1。PCR 反應(yīng)循環(huán)為95°C IOmin ;(95°C 30s，58°C 30s，68°C 30s ；35 cycles) ；68°C 5min ； 16 °C 24h。用北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司的DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行 回收PCR產(chǎn)物，詳細(xì)的操作方法參照試劑盒說明。三、PCR產(chǎn)物和pEGFP-Nl質(zhì)粒酶切、片段連接和轉(zhuǎn)化按照常規(guī)分子克隆的方法，利用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對于上述PCR產(chǎn)物和 PEGFP-Nl質(zhì)粒進行酶切、產(chǎn)物回收和連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。四、陽性克隆篩選及測序驗證挑取陽性克隆，進行后續(xù)的質(zhì)粒提取、酶切反應(yīng)和PCR反應(yīng)鑒定，最后送交測序公 司進行測序驗證。將已鑒定好的質(zhì)粒送交華大基因生物公司測序，經(jīng)過序列比對，證明突變 位點的質(zhì)粒是正確的，即突變型載體pEGFP-Nlm構(gòu)建成功。實施例2 不同分子量大小的融合蛋白表達載體的構(gòu)建為了比較分析pEGFP-Nl和pEGFP_Nlm載體克隆進入不同大小的蛋白多肽表達序 列后，對于融合蛋白的表達效率和定位結(jié)果的影響，首先根據(jù)文獻報道，挑選不同大小的、 且其亞細(xì)胞定位已知的多肽表達核苷酸序列，分別克隆連接到質(zhì)粒pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm 的EGFP表達序列的上游，構(gòu)建成不同的表達質(zhì)粒。由于實驗需要，需選取大小不同的蛋白，同時需要這些蛋白符合亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位 已知，且定位精確，能滿足處于且僅處于細(xì)胞核內(nèi)、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)、特定細(xì)胞器內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)生物 膜上的條件。在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中，注解部分有包括蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位及蛋白已知功能 在內(nèi)的信息。運用生物信息學(xué)的方法，在Linux系統(tǒng)下用Perl高級程序語言可以編寫相應(yīng) 的搜索程序，實現(xiàn)全面、有效且快速蛋白數(shù)據(jù)庫搜索，發(fā)現(xiàn)符合特定條件的基因。一、丙酮酸激酶基因丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)，其生物化學(xué)縮寫式為三磷酸腺苷丙酮 酸-2-0-磷酸轉(zhuǎn)移酶，其基因長度為12142bp，能夠編碼包含574aa (分子量約62KDa，其大 于約26KDa的EGFP的分子量)長度的蛋白。在無氧條件下，葡萄糖進行分解，形成2分子 丙酮酸并提供能量，這一過程稱為糖酵解作用；在此過程中，PK是催化形成第二個ATP反應(yīng) 的酶(Liapounova，N. A. et al. , Eukaryot Cell, 2006，5，2138—46)。利用常規(guī)的分子生物學(xué)方法，將PK蛋白的表達序列分別克隆進入pEGFP-m和 pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的上游，然后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測其表達情況。
二、ZNF268鋅指蛋白的KRAB結(jié)構(gòu)功能域KRAB/C2H2型鋅指蛋白均含有一個保守的KRAB功能結(jié)構(gòu)域。ZNF268是一種典 型的KRAB/C2H2型鋅指蛋白，含有一個74aa的KRAB結(jié)構(gòu)域(參見文獻Gou，D. Μ.，et al. Biochimica et Biophysica Acta. 2001，1518，306-10)。我們的前期實驗結(jié)果表明單 獨表達的ZNF268鋅指蛋白的KRAB結(jié)構(gòu)域是定位于細(xì)胞核中的。為了比較分析pEGFP-Nl和pEGFP_Nlm載體對于融合蛋白的表達量和亞細(xì)胞定位 結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，我們將KRAB多肽的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm的 EGFP表達序列的上游，然后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測其表達情況。利用常規(guī)的分子生物學(xué)方法，將KRAB多肽的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和 pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的上游，然后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測其表達情況。構(gòu)建成功的表達質(zhì)粒載體如圖3所示。經(jīng)測序驗證，表達序列正確無誤，可以用于 下游實驗。三、反式激活轉(zhuǎn)錄子基因反式激活轉(zhuǎn)錄子基因來自于I型人類免疫缺陷病毒(HIV-I)，其含義為反式激活 轉(zhuǎn)錄子(Trans-Activator of Transcription，Tat)。人工培養(yǎng)的感染細(xì)胞能夠釋放Tat蛋 白，而HIV-I感染的患者血液中也有發(fā)現(xiàn)。由于不同亞種之間的區(qū)別，TAT蛋白的大小介于 86-101aa之間。在本實驗中所用的為分子量大小14KDa(其小于約26KDa的EGFP的分子 量)的蛋白。在人類免疫缺陷病毒中，Tat蛋白能夠大幅度增加HIV的單鏈RNA的轉(zhuǎn)錄。同 時，Tat能夠直接參與到HIV的致病過程之中發(fā)揮作用(Ammosova,T. , et al. J Biol Chem, 2005，280，36364-71)。將Tat蛋白的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的 上游，然后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測其表達情況。利用常規(guī)的分子生物學(xué)方法，將Tat蛋白的表達序列分別克隆進入pEGFP-Nl和 pEGFP-Nlm的EGFP表達序列的上游，然后轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，檢測其表達情況。構(gòu)建成功的表達質(zhì)粒載體如圖3所示。經(jīng)測序驗證，表達序列正確無誤，可以用于 下游細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗分析。實施例3 比較分析pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm載體以下細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗均在HeLa細(xì)胞中進行。HeLa細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中 心(CCTCC，中國武漢)，由本室按照常規(guī)操作方法進行保存。一、二者均可用于分子量大于EGFP的多肽的亞細(xì)胞定位丙酮酸激酶蛋白(PK)基因能夠編碼一種分子量約62KDa的蛋白多肽，其分子量 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于EGFP，定位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)我們利用pEGFP-Nl和pEGFP-Nlm載體對PK-EGFP 融合蛋白在HeLa細(xì)胞中進行亞細(xì)胞定位實驗驗證時，將PK_EGFP_N1 (unmatation)和 PK-EGFP-Nl (matation)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，通過Western blot分析，由圖4可見， PEGFP-Nl質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中正常定位表達于細(xì)胞質(zhì)中；此外，由于PK蛋白本身的分子量 很大，因此與EGFP形成融合蛋白后，無論是采用pEGFP-Nl載體還是pEGFP-Nlm載體，均不 會在細(xì)胞的其它部位表達額外的EGFP蛋白。通過共聚焦分析，由圖5可見，PK蛋白的表達 序列無論是與pEGFP-Nl還是pEGFP-Nlm載體融合，由于PK分子量很大，均不會表達額外的 EGFP蛋白。EGFP 表示對于綠色熒光蛋白EGFP的表達定位；DAPI染核實驗顯示了細(xì)胞核所在的位置；Merge 二者的重疊圖譜，顯示PK蛋白完全定位在細(xì)胞質(zhì)中。說明對于分子量較大的蛋白多肽進行定位實驗分析時，pEGFP-m載體是一種非常 好的蛋白多肽亞細(xì)胞定位分析的實驗工具。二、pEGFP-Nlm載體比pEGFP_Nl更適合于分子量小于EGFP的蛋白多肽的亞細(xì)胞 定位分析文獻報道及本室研究結(jié)果表明，當(dāng)利用pEGFP-Nl載體對于分子量接近或小于 EGFP的蛋白多肽進行亞細(xì)胞定位分析時，除了在應(yīng)有的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中表達出綠色熒光蛋白 外，在其他的地方也有一些模糊的熒光，這影響了定位實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些結(jié)果可以用 Western blot得到驗證。因此，我們認(rèn)為，除了表達目的蛋白-EGFP融合蛋白外，應(yīng)該還表 達了額外的EGFP蛋白，影響了亞細(xì)胞定位結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此改善pEGFP-Nl載體勢在必 行。利用鋅指蛋白ZNF268的KRAB結(jié)構(gòu)域和HIV病毒蛋白Tat作為研究例子，我們比 較分析了 PEGFP-Nl和pEGFP-Nlm載體用于目的蛋白的分子量小于EGFP的蛋白多肽的亞細(xì) 胞定位分析。圖6為融合蛋白KRAB-EGFP分別在載體pEGFP_Nl和pEGFP-Nlm中的表達情況檢 測。A圖中泳道1 :EGFP表達對照；泳道2 :KRAB-EGFP在載體pEGFP-Nlm中的表達情況，由 于EGFP蛋白表達序列中的Kozak序列發(fā)生了突變，因此不會表達額外的EGFP蛋白。B圖中 泳道3 =EGFP對照；泳道4 :KRAB-EGFP在載體pEGFP-Nl中的表達情況，由于EGFP蛋白表達 序列中的Kozak序列未發(fā)生突變，因此該表達質(zhì)粒除了表達KRAB-EGFP融合蛋白外，還額外 表達了大量的EGFP蛋白，影響了融合蛋白的表達量及其亞細(xì)胞定位結(jié)果的準(zhǔn)確性。圖7利用共聚焦顯微鏡觀察方法，驗證了圖6的結(jié)論。上半部分圖顯示分子量小于 EGFP的、且特異定位于細(xì)胞核中的多肽序列KRAB的表達序列克隆進入載體pEGFP-附后，除 了表達了大部分融合蛋白外，在細(xì)胞質(zhì)中也表達了許多EGFP蛋白，影響了該蛋白的亞細(xì)胞 定位結(jié)果的準(zhǔn)確性；下圖表示KRAB表達序列克隆進入載體pEGFP-Nlm后，只在細(xì)胞核中表 達了大量的融合蛋白，亞細(xì)胞定位結(jié)果非常好，且融合蛋白的表達效率明顯提高。EGFP 表 示綠色熒光蛋白EGFP表達檢測；DAPI 顯示細(xì)胞核所在的位置；merge 表示前面二者的重 疊圖譜。圖8利用共聚焦顯微鏡觀察方法，顯示分子量小于EGFP的、且特異定位于細(xì)胞核 中的Tat蛋白與之融合表達時的情況。上圖表示EGFP-Tat融合表達蛋白的序列克隆進入 pEGFP-Nl載體時的表達情況；下圖顯示EGFP-Tat融合表達蛋白的序列克隆進入pEGFP-Nlm 載體時的表達情況。結(jié)果表明在突變型載體pEGFP-Nlm中，細(xì)胞質(zhì)中額外的EGFP的相對量 大為減少，可以顯著提高融合蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果的準(zhǔn)確性以及融合蛋白的表達效率。 EGFP 表示綠色熒光蛋白EGFP表達檢測；DAPI 顯示細(xì)胞核所在的位置；merge 表示前面 二者的重疊圖譜?？傊?，未突變的載體pEGFP-Nl用于KRAB和Tat的定位分析時，除了在細(xì)胞核表達 了融合蛋白外(圖7、8)，在其他的部位也表達了額外的EGFP蛋白(圖6、7、8)；而當(dāng)利用突 變型載體pEGFP-Nlm進行對比實驗時，我們發(fā)現(xiàn)額外表達的EGFP蛋白大大減少(圖6)，在 融合蛋白不應(yīng)該表達的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中也未發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白(圖7、8)，且融合蛋白的表達效 率也得到較大的提高(圖7、8)。上述結(jié)果顯示，當(dāng)我們利用pEGFP-Nl載體對Tat和鋅指蛋白ZNF268的KRAB結(jié)構(gòu)域進行亞細(xì)胞定位分析時，由于它們的分子量小于EGFP，可能由于 “重掃描”和“翻譯重起始”現(xiàn)象的存在，明顯地在細(xì)胞中額外表達了 EGFP蛋白，這嚴(yán)重地影 響了亞細(xì)胞定位結(jié)果的準(zhǔn)確性；當(dāng)改用本發(fā)明中構(gòu)建的突變型載體PEGFP-Nlm進行平行實 驗時，可以看到，不僅可以消除額外的EGFP蛋白的表達，而且融合蛋白的表達效率也得到 了極大地提高，這將極大地提高亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。因此，本發(fā)明中的 突變型載體pEGFP-Nlm將可以作為商業(yè)化載體系統(tǒng)pEGFP的重要補充，在用于分子量接近 或小于EGFP的蛋白多肽的亞細(xì)胞定位分析中，可以極大地提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信 度。
權(quán)利要求
一種突變型載體pEGFP N1m的構(gòu)建方法 ，其特征在于將pEGFP N1載體中EGFP核苷酸表達序列的翻譯起始位點ATG及其附近的Kozak序列采用PCR定點突變技術(shù)進行突變，使其不能得到表達。
2.如權(quán)利要求1所述的突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)引物設(shè)計采用的上游引物序列為5，-GGATCCACCGGTCGCCTCCCTGTTGAGCAAGG GCGAGG-3，，下游引物序列為5，-CCTCGCCCTTGCTCAACAGGGAGGCGACCGGTGGATCC-3，；2)PCR定點突變以pEGFP-Nl質(zhì)粒為模板，進行PCR反應(yīng)；3)回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物，常規(guī)方法進行酶切、連接和轉(zhuǎn)化；4)陽性克隆篩選以及測序鑒定，完成突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建。
3.如權(quán)利要求2所述的突變型載體pEGFP-Nlm的構(gòu)建方法，其特征在于步驟2中PCR 反應(yīng)循環(huán)為95°C IOmin ； (95°C 30s, 58°C 30s, 68°C 30s ；35 cycles) ；68°C 5min ； 16 °C 24h。
4.突變型載體pEGFP-Nlm用于分子量接近或小于EGFP的蛋白多肽的亞細(xì)胞定位分析。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種突變型載體pEGFP-N1m的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，本發(fā)明方法是利用PCR定點突變技術(shù)將商業(yè)化載體pEGFP-N1進行改造得到一種突變型載體pEGFP-N1m。比較分析實驗結(jié)果表明，利用本發(fā)明中構(gòu)建的突變型載體pEGFP-N1m對分子量接近于或小于EGFP的蛋白多肽進行亞細(xì)胞定位分析時，可以消除額外的EGFP蛋白表達對定位實驗結(jié)果的干擾，明顯地提高亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，同時還可以提高融合蛋白的表達效率。
文檔編號C12N15/79GK101974554SQ201010291680
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者吳淼, 李文鑫, 汪維, 郭明雄 申請人:武漢大學(xué)