專利名稱:一種利用黑曲霉生產(chǎn)殼聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用黑曲霉生產(chǎn)殼聚糖酶的方法，具體而言是指利用黑曲霉 (Aspergillusniger)Lff-I菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的新工藝，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
殼聚糖是幾丁質(zhì)的脫乙酰基產(chǎn)物，是一種高分子陽離子絮凝劑。殼聚糖經(jīng)部分降解得到的殼寡糖具有良好的水溶性，易被生物體吸收，且無毒、無熱源、無變異性，并具有獨特的生理活性，在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外由殼聚糖制備殼寡糖主要有三種方法酸降解法、氧化降解法和酶解法。其中利用專一性的殼聚糖酶水解殼聚糖，具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過程易控制及對環(huán)境無污染等特點，且殼寡糖產(chǎn)量高、 質(zhì)量穩(wěn)定，是一種較為理想的生產(chǎn)殼寡糖的方法。
殼聚糖酶的分布較廣泛，目前已在細菌(Bacillus、Myxobacter, Enterobacter)、 放線菌(Streptomyces、Nocardioides)、霉菌(Aspergillus、Penicillium)、病毒 (chlorella virus PBCV_1、CVK_2)和植物的不同組織中檢測到殼聚糖酶的存在，并已從發(fā)酵液中純化得到殼聚糖酶。大多數(shù)微生物殼聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，在細胞的正常代謝活動中，微量合成或不合成，底物的存在將導(dǎo)致殼聚糖酶的大量合成。陳小娥等報道了搖瓶發(fā)酵一株曲霉菌，在粗酶液中檢測到殼聚糖酶活性為197U/mL，同時研究了碳源對自篩曲霉突變株0U22-326)產(chǎn)酶的影響，發(fā)現(xiàn)CJ22-3^5菌株殼聚糖酶是一種典型的誘導(dǎo)酶，其合成與分泌都需要殼聚糖的誘導(dǎo)，質(zhì)量分數(shù)為2%的殼聚糖起到最佳的誘導(dǎo)效果。孫玉英等報道的 Microbacterium sp. OUOl菌株產(chǎn)殼聚糖酶活性為118U/mL。余蓉等在發(fā)明專利(《殼聚糖酶制備新工藝》，公開號CN1810963A)中報道了利用貴州綠僵菌(Metarhizium guizhouense) 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的新技術(shù)，但殼聚糖酶固態(tài)發(fā)酵酶活性僅為83. lU/g干培養(yǎng)基。綜上所述，目前無論是液體發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵，微生物產(chǎn)殼聚糖酶活性均較低，導(dǎo)致了殼聚糖酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本高，從而限制了該酶的廣泛應(yīng)用；且未見有利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的文獻或?qū)＠麍蟮?。微生物固態(tài)發(fā)酵具有設(shè)備簡單、投入少、見效快、生產(chǎn)成本低及對環(huán)境友好等優(yōu)勢。本發(fā)明利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的酶活性高于目前國內(nèi)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以麩皮、玉米粉和豆餅粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵基料，利用黑曲霉LW-I固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的方法。本發(fā)明所述固態(tài)發(fā)酵的技術(shù)方案和內(nèi)容如下
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger) Lff-I菌株，由江南大學(xué)篩選和保藏，該菌株已于2008年在《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報》雜志的Vol. 16 No. 2 Pg. 346公開，本發(fā)明人承諾該菌株在20年內(nèi)向公眾發(fā)放。
2.斜面種子培養(yǎng)去皮馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L，瓊脂20g/L, pH 6. O ； 121°C滅菌20min，放置試管斜面；冷卻后接種LW-I菌株，30°C培養(yǎng)96h。此斜面培養(yǎng)基可用于菌種的活化、保藏和斜面種子等，每3個月轉(zhuǎn)接1次。
3.麩曲種子制備:250mL三角瓶裝IOg基料(麩皮IOg)，(NH4)2SO4 IOOmg,自來水 12mL, pH 6. 0 ；充分混勻，121°C滅菌40min ；冷卻后接種LW-I試管斜面種子，30°C靜置培養(yǎng) 96h，期間分別于24h和44h各翻曲一次。
4.固態(tài)發(fā)酵250mL三角瓶中裝IOg基料(麩皮8 10g，豆餅粉0 2g，玉米粉 0 Ig)，(NH4)2SO4 50 lOOmg，殼聚糖 0 0. 3g, MgSO4 5 IOmgjCaCl2 5 IOmgjKH2PO4 30 50mg，自來水12 15mL，pH 6.0 ；充分混勻，121°C滅菌40min ；冷卻后接種一菌耳LW-I 麩曲種子，30°C靜置培養(yǎng)84 96h，期間分別于20 24h和40 44h各翻曲一次。
5.粗酶液提取固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后稱取發(fā)酵曲料lg，加入9mL的pH 5. 0,0. 05mol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，室溫浸泡lh，濾紙過濾，所得濾液即為殼聚糖酶液。
6.分析方法
殼聚糖酶活性測定于25mL具塞試管A和B中，分別加入用pH 5. 0、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制的質(zhì)量濃度為1. 0%的殼聚糖溶液2. 4mL，50°C預(yù)熱lOmin，在A管中加入0. ImL適當稀釋的酶液，50°C準確反應(yīng)20min;立即各加入2. 5mL 3'，5' -二硝基水楊酸(DNS)試劑，在B管中再補加0. ImL酶液，A和B管均煮沸7min，冷卻后各加去離子水 5mL,混勻；540nm處以B管為空白對照測定A管吸光度值，并從鹽酸氨基葡萄糖標準曲線上查出相應(yīng)的還原糖(以氨基葡萄糖計)含量并折算成酶活性單位。酶活性單位定義為在本測定條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μ g還原糖所需的酶量定義為1個殼聚糖酶活性單位(U)。
還原糖測定采用DNS法，以鹽酸氨基葡萄糖為標準。
曲料水分測定稱取一定量的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物(曲料)，105°C烘干至恒重。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明突出的優(yōu)點是利用廉價的麩皮、豆餅粉和玉米粉等農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵主原料，且采用的生產(chǎn)菌株黑曲霉(Aspergillus niger)是公認安全 (GRAS)的微生物，其具有安全、可靠和不產(chǎn)生毒素等特點。本發(fā)明利用黑曲霉LW-I菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶是一種充分利用自然界可再生資源、綠色環(huán)保且可持續(xù)的生產(chǎn)方式， 同時具有設(shè)備簡單、投資少、見效快、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)勢。本發(fā)明在實驗室小試規(guī)模上，利用黑曲霉LW-I菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶，其殼聚糖酶發(fā)酵酶活性可達1381 1966U/g 干曲。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述內(nèi)容的范圍僅局限于下述實施例。
實施例1
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-I 菌株。
2.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL三角瓶裝IOg基料(麩皮10g)，(NH4)2SO4 IOOmg, MgSO4IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自來水 13mL, pH 6· 0。
3.固態(tài)發(fā)酵條件培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳LW-I麩曲種子， 30°C靜置培養(yǎng)96h，期間分別于20h和40h各翻曲一次。
重復(fù)3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶實驗結(jié)果表明，LW-I成熟固態(tài)發(fā)酵曲料的殼聚糖酶平均酶活性達到1451U/g干曲。[0021]實施例2
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL三角瓶裝IOg基料(麩皮IOg)，(NH4)2SO4 IOOmg,殼聚糖 0. 2g, MgSO4 IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自來水 13mL, pH 6· O。
3.固態(tài)發(fā)酵條件培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳LW-I麩曲種子， 30°C靜置培養(yǎng)96h，期間分別于20h和40h各翻曲一次。
重復(fù)3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶實驗結(jié)果表明，LW-I成熟固態(tài)發(fā)酵曲料的殼聚糖酶平均酶活性達到1966U/g干曲。
實施例3
1.菌株黑曲霉(Aspergillus niger)Lff-l 菌株。
2.固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL三角瓶裝IOg基料(麩皮8g，豆餅粉2g)，(NH4)2SO4 lOOmg，殼聚糖 0. 3g, MgSO4 IOmg, CaCl2 IOmg, KH2PO4 30mg,自來水 13mL, pH 6.0。
3.固態(tài)發(fā)酵條件培養(yǎng)基121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳LW-I麩曲種子， 30°C靜置培養(yǎng)96h，期間分別于20h和40h各翻曲一次。
重復(fù)3批次(每批次平行做3瓶)的上述三角瓶實驗結(jié)果表明，LW-I成熟固態(tài)發(fā)酵曲料的殼聚糖酶平均酶活性達到1381U/g干曲。
權(quán)利要求
1.一種實驗室小試生產(chǎn)殼聚糖酶的新工藝，其特征在于以廉價的麩皮、豆餅粉和玉米粉等農(nóng)副產(chǎn)品為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的主料，并添加適量的無機氮源、殼聚糖和無機鹽等，在 250mL三角瓶中，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株進行固態(tài)發(fā)酵；發(fā)酵結(jié)束后向培養(yǎng)物中加入緩沖液提取殼聚糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于使用的菌種是黑曲霉LW-I菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于采用的發(fā)酵工藝是固態(tài)發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于使用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為250mL三角瓶裝IOg基料(麩皮8 10g，豆餅粉0 2g，玉米粉0 Ig)，(NH4) 2S04 50 lOOmg，殼聚糖 0 0. 3g, MgSO4 5 IOmgjCaCl2 5 IOmgjKH2PO4 30 50mg,自來水 12 15mL，pH 6. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于采用的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件為發(fā)酵培養(yǎng)基 121°C滅菌40min，冷卻后接種一菌耳黑曲霉LW-I麩曲種子，30°C靜置培養(yǎng)84 96h，期間分別于20 24h和40 44h各翻曲一次。
專利摘要
一種利用黑曲霉生產(chǎn)殼聚糖酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明采用廉價的麩皮、豆餅粉和玉米粉等農(nóng)副產(chǎn)品為發(fā)酵基料，并添加適量的無機氮源、殼聚糖和無機鹽等，利用黑曲霉(Aspergillus niger)LW-1菌株固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶。本發(fā)明提供了黑曲霉LW-1菌株實驗室小試生產(chǎn)殼聚糖酶的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，其成熟發(fā)酵曲料的殼聚糖酶活性可達1381～1966U/g干曲。本殼聚糖酶生產(chǎn)新工藝具有設(shè)備簡單、投入少、見效快、生產(chǎn)成本低廉、對環(huán)境友好以及殼聚糖酶固態(tài)發(fā)酵酶活性較高等優(yōu)勢，有利于殼聚糖酶的開發(fā)和利用，具有較高的經(jīng)濟和實用價值。
文檔編號C12R1/685GKCN102154241SQ201010550909
公開日2011年8月17日 申請日期2010年11月19日
發(fā)明者史紅玲, 吳靜, 唐存多, 李劍芳, 鄔敏辰, 陳偉 申請人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan