專利名稱:一種高產(chǎn)γ-氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種高產(chǎn)γ-氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵工程中生物技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種構(gòu)建遺傳工程菌的方法、重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究及其在轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)Y-氨基丁酸上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸(簡(jiǎn)稱GABA)是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有許多重要的生理功能，如降血壓、保持神經(jīng)安定、增強(qiáng)記憶、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖、保肝利腎等。近年來(lái)，GABA的研究和應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外主要采用化學(xué)合成法和微生物法制備GABA，化學(xué)合成法反應(yīng)條件劇烈，污染嚴(yán)重；微生物發(fā)酵法條件溫和、安全、成本較低，但后處理過(guò)程復(fù)雜且生產(chǎn)周期長(zhǎng)；全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成GABA則可提高底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品純度，且具有節(jié)約后處理工序、縮短生產(chǎn)周期及降低環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛重視。
本發(fā)明課題組專利“一株高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸為Y -氨基丁酸乳酸菌的選育”公開號(hào):101^8679A
公開日:2010. 12. 29，該專利公開了以植物乳桿菌(LP-GB 01-21)為生產(chǎn)菌株，5L發(fā)酵罐水平，在pH5. 0乙酸-乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終GABA濃度達(dá)到 132g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為94. 3%，產(chǎn)量明顯高于其他同類菌株，但由于植物乳桿菌是兼性厭氧微生物，培養(yǎng)條件較難控制，GABA的生產(chǎn)效率受培養(yǎng)條件影響較為顯著；同時(shí)，植物乳桿菌中GAD的表達(dá)量受菌體代謝狀態(tài)的控制，表達(dá)量有限，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率仍有待于提高。鑒于此，本研究擬通過(guò)構(gòu)建GAD高表達(dá)型重組大腸桿菌，借助大腸桿菌生長(zhǎng)迅速、易于高密度培養(yǎng)和GAD表達(dá)可以人工調(diào)控的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行GABA大規(guī)模和高效率生產(chǎn)。另外，GAD是生物催化 L-谷氨酸脫羧反應(yīng)生成Y -氨基丁酸的限速酶，通過(guò)對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，即酶的熱穩(wěn)定性、PH穩(wěn)定性及溫度、pH與酶活性的關(guān)系，幾種金屬離子對(duì)酶的影響，來(lái)確定該酶作用的合適條件指導(dǎo)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成GABA，并為工業(yè)化制備GABA提供了參考依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)GABA重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構(gòu)建方法，并對(duì)重組谷氨酸脫羧酶(GAD)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果確定了最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件，為微生物轉(zhuǎn)化L-谷氨酸為Y -氨基丁酸的工業(yè)化提供了有益的指導(dǎo)。
本發(fā)明的技術(shù)方案提取總Lactobacillus plantarum染色體為模板，根據(jù) GeneBank公布的植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因組序列設(shè)計(jì)引物如下
Pl :5，-GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3‘；(下劃線為 BamH I 酶切位點(diǎn))
P2 :5，GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3，(下劃線為 Not I 酶切位點(diǎn))進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增條件為94°C，5min 預(yù)變性；94°C 50s, 57°C Imin 30s，72°C 2min,35^ 循環(huán)；72°C延伸lOmin。所得片段經(jīng)膠回收后與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化Ε. coli JM109,經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，將重組質(zhì)粒命名為 T-Lpgad，采用相同限制性內(nèi)切酶分別對(duì)T-Ipgad和pET18a(+)進(jìn)行雙酶切，膠回收Ipgad 片段，將其與線性化載體pET48a(+)混合，在T4連接酶的作用下過(guò)夜連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，將符合預(yù)期結(jié)果的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子于-80°C冰箱中保藏。
取凍管保藏的菌種接種至含卡那霉素(終濃度為50 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，粗酶液采用比色法進(jìn)行酶活測(cè)定，一個(gè)酶活力單位(U)定義為在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生lymol GABA所需的酶量，粗酶液蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測(cè)定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。粗酶液經(jīng)Ni-NTA純化得到重組GAD，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究。
通過(guò)對(duì)重組谷氨酸脫羧酶GAD酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，確定了其最適作用溫度、最適PH以及具有較強(qiáng)促進(jìn)作用的金屬離子種類及濃度，根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果，對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，5L發(fā)酵罐水平，對(duì)重組菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化產(chǎn)GABA實(shí)驗(yàn)。
重組菌搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米漿1.5，NaCl 0.3， K2HPO4O. 1，MgS047H20 0. 05。在 pH 6. 5 7. 0、121°C下滅菌 IOmin0
重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖5.0，蛋白胨10，玉米漿7. 5，NaCl 0.5， K2HPO4O. 1, MgS047H20 0. 05，L-谷氨酸 1. 0，生物素 2 X 1(Γ5。pH 6. 5 7. 0、121°C 下滅菌 IOmin0
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明課題組前期通過(guò)篩選、誘變獲得一株植物乳桿菌，該菌具有較高的谷氨酸脫羧酶酶活，但由于植物乳桿菌是兼性厭氧微生物，培養(yǎng)條件較難控制， 同時(shí)，植物乳桿菌中GAD的表達(dá)量受菌體代謝狀態(tài)的控制，表達(dá)量有限，本實(shí)驗(yàn)克隆了該菌的GAD酶基因，實(shí)現(xiàn)了其在大腸肝菌中的異源表達(dá)，且表達(dá)量高。利用pET28a上的多聚組氨酸標(biāo)簽，粗酶液過(guò)鎳柱純化，得到較純的重組酶GAD，并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，確定了該酶作用的最適PH、最適溫度、及不同金屬離子對(duì)其作用的影響。為改良全細(xì)胞轉(zhuǎn)化工藝提供了可靠的理論依據(jù)。
根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果，對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件為 ρΗ4· 8乙酸-乙酸鈉緩沖液、2. 5mmol/L Ca2+、3. 5mmol/L Mg2+，轉(zhuǎn)化溫度37°C。在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件下，以50g/L的投料量進(jìn)行分批投料，轉(zhuǎn)化Mh，轉(zhuǎn)化液離心取上清，加入15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，取Iml進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物GABA濃度為 204. 5g/L,轉(zhuǎn)化率為 97. 92 %。
產(chǎn)品純度高，轉(zhuǎn)化率高，轉(zhuǎn)化周期短，技術(shù)可移植性強(qiáng)，只要一般的發(fā)酵車間(如抗生素、維生素、氨基酸生產(chǎn)車間)即可進(jìn)行生產(chǎn)，不需購(gòu)置特殊設(shè)備和儀器，易于推廣應(yīng)用。


圖1重組質(zhì)粒pET18a-lpgad的構(gòu)建；
圖 2 重組質(zhì)粒 pET-28a-lpgad 的酶切驗(yàn)證 Lanel λ HindIII DNA marker ； Lane2pET-28a-lpgad/BamHI g| ；Lane3 pET-28a-lpgad/BamHI+NotI M^W ；Lane4 DS2000 DNA marker ；[0017] 3 Μ GAD ^ Lanel Supernatant of Ε. coli Β 21 ；Lane2 Supernatant of Ε. coli B121with recombinant plasmid pET_28a(+)-Ipgad ;Lane3 Protein markers(kDa)；
4 MM GAD ^ Ni-NTA ^tit Lanel Protein markers (kDa) ；Lane2 Supernatant of E.coliB121 with recombinant plasmid pET-28a(+)-Ipgad ；Lane3 Purified GAD ；
圖5重組GAD最適pH (A)及其pH穩(wěn)定性(B)；
圖6重組GAD最適溫度㈧及其熱穩(wěn)定性⑶；
圖7不同金屬離子及EDTA對(duì)重組GAD的影響(B)；
圖8不同不同濃度Ca2+ (A)、Mg2+⑶對(duì)GAD酶活的影響；
圖 9 重組 GAD 的 Lineweaver-Burk 作圖；
圖10氨基酸測(cè)定儀測(cè)定BL21/pET-28a-lpgad 5L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化液中底物與產(chǎn)物的
含量圖譜；
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 重組大腸桿菌BL21/pET-28a-lpgad的構(gòu)建
根據(jù) NCBI 中植物乳桿菌 Lactobacillus ρlantarum subsp. plantarum ST-III (GI :308044682)全基因組核酸序列32Μ37^ρ中的Ipgad基因序列，設(shè)計(jì)谷氨酸脫羧酶編碼基因的引物
Pl =GAC(GGATCC)ATGGACCAGAAGCTGTTAAC(BamH I)
P2 :GGC(GCGGCCGC)TCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT (Not I)
提取總Lactobacillus plantarum染色體為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段， PCR 擴(kuò)增條件為 94°C，5min 預(yù)變性；94°C 50s, 57°C Imin 30s, 72°C 2min，;35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。所得片段經(jīng)膠回收后與克隆載體pMDIS-T連接，轉(zhuǎn)化Ε. coli JM109，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，將重組質(zhì)粒命名為T-Lpgad。 將T-Ipgad用BamHI和Not I進(jìn)行雙酶切，膠回收Ipgad片段，將其與經(jīng)相同雙酶切處理獲得的線性化載體pET48a(+)混合，加入T4連接酶，16°C過(guò)夜連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，如圖2所示，將符合預(yù)期結(jié)果的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子保存在含有20%甘油的LB中，冷凍保存于-80°C。
實(shí)施例2 重組谷氨酸脫羧酶的表達(dá)及Ni-NTA純化
取凍管保藏的重組子接種至含卡那霉素(終濃度為50μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中， 37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1 %接種量轉(zhuǎn)接，37°C培養(yǎng)至OD約0. 6-0. 8，加人IPTG至終濃度為0. 5mmol/L, 16°C過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)超聲波破碎細(xì)胞，上清液SDS-PAGE 分析，檢測(cè)到一條分子量約為53kDa的特異性條帶，如圖3所示。上清液測(cè)得比酶活為 8.53U/mg。
將過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于10000r/min，4°C離心15min，收集菌體，用pH7. 4PBS緩沖液懸浮菌體，超聲波破碎細(xì)胞，然后經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，選用表達(dá)載體pET-28a (+)中含有6 ·His-Tag編碼序列，過(guò)Ni-NTA純化GAD。純化后的GAD經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果見圖3， 可看出經(jīng)過(guò)純化后得到相對(duì)單一的條帶，如圖4所示，基本上可以認(rèn)為已得到相對(duì)較純的 GAD酶蛋白。純化后酶液的比酶活達(dá)到32. 45U/mg,是純化前粗酶液酶活的3. 8倍，回收率達(dá) 53. 32%。
實(shí)施例3 重組谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究
1)最適pH及pH穩(wěn)定性配制pH3. 6 6. 0的醋酸-醋酸鈉反應(yīng)緩沖液，30°C下將酶液分別與不同PH的反應(yīng)液混合，測(cè)定GAD在不同pH反應(yīng)體系中的酶活，考察pH對(duì)酶促反應(yīng)的影響。再將一定量的酶液加入到以上不同PH的反應(yīng)緩沖液中，30°C下分別保溫2h， 測(cè)定剩余酶活，考察GAD在不同pH條件下的穩(wěn)定性。
2)最適溫度及熱穩(wěn)定性采用pH4. 8的反應(yīng)緩沖液，分別在20°C，25°C，30°C， 35 V，37 °C，40 V ,45 °C, 50 V ,55 °C, 60 V，65 °C，70 V下測(cè)定酶活，研究溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響。將酶液置于以上不同溫度下保溫211、411、611、811、1011，測(cè)定剩余酶活，考察640在不同溫度下的穩(wěn)定性。
3)不同金屬離子及EDTA對(duì)酶活的影響在反應(yīng)液中分別加入終濃度為lmmol/L 的 Ca2+、Mg2+、K+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Na+、Ag+、Al3+、Li2+ 以及 EDTA，30°C 下測(cè)定 GAD 酶活，以不加金屬離子的反應(yīng)液作為對(duì)照，研究不同金屬離子對(duì)其酶促反應(yīng)的影響。另外，對(duì)具有明顯激活作用的金屬離子，配制不同的濃度進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
4)Km值及Vmax的測(cè)定配制不同濃度的L-谷氨酸鈉底物溶液，分別與酶液在 30°C下反應(yīng)，采用雙倒數(shù)作圖法確定GAD的Km及Vmax值。
酶學(xué)性質(zhì)初步研究表明，最適pH為4. 8，在pH3. 6-5. 2范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，如圖5 所示；最適溫度為37°C，20V _40°C范圍內(nèi)，保溫10h，相對(duì)酶活仍在85%以上，如圖6所示； Mn2+、Fe2/ Fe3/ Ag+、Cu2+均對(duì)植物乳桿菌GAD的活力有較大的抑制作用，Li+、K+、Na+等對(duì)活性影響不明顯，Ca2+、Mg2+對(duì)該酶有較強(qiáng)的激活作用，如圖7所示；如圖8所示，2. 5mmol/LCa2+ 時(shí)激活作用最明顯，相對(duì)酶活達(dá)1 %，3. 5mmol/L Mg2+對(duì)重組酶GAD的激活作用最強(qiáng)，酶活達(dá)131% ；根據(jù)不同底物濃度與酶促反應(yīng)的關(guān)系，按照米氏方程，采用雙倒數(shù)作圖法，如圖9 所示，可以得到 Km 為 9. 21mmol/L, Vmax 為 7. 58mmol/L · min。
實(shí)施例4 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA研究
通過(guò)對(duì)重組谷氨酸脫羧酶GAD酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，確定了其最適作用溫度、最適PH以及具有較強(qiáng)促進(jìn)作用的金屬離子種類及濃度，根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果，對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件為pH4. 8乙酸-乙酸鈉緩沖液、2. 5mmol/L Ca2+、 3. 5讓。1/LMg2+，轉(zhuǎn)化溫度 37°C。
將斜面保藏的菌種接種至50ml (裝液量為10ml)LB培養(yǎng)基中，于旋轉(zhuǎn)式搖床中 37°C、160r/min培養(yǎng)1 進(jìn)行活化，再以5%的接種量接入500ml搖瓶(裝液量為100ml) 種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，按上述條件培養(yǎng)24h得到種子液，按10%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入5L全自動(dòng)發(fā)酵罐(裝液量為3L)，先于37°C、250r/min培養(yǎng)至0D_為0. 6，再向其中添加乳糖至終濃度為lg/L，同時(shí)在線控制pH6. 8流加葡萄糖，30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵14h至0D_ 為13.6。將培養(yǎng)好的菌體進(jìn)行離心收集，雙蒸水洗滌三次，用乙酸-乙酸鈉緩沖液懸浮菌體，在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件下，以50g/L的投料量進(jìn)行分批投料，前期由于酶活水平較高，反應(yīng)速率較快，投料間隔為每池投料一次，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶活有所下降，反應(yīng)速度變慢， 12h后，投料時(shí)間間隔延長(zhǎng)到他，在轉(zhuǎn)速250r/min、通氣量Ivvm的條件下轉(zhuǎn)化Mh，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清，加入15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，取Iml進(jìn)行適當(dāng)稀釋后氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)得轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物GABA濃度為204. 5g/L，轉(zhuǎn)化率為97. 92%，如圖10所示。
權(quán)利要求
1.本專利構(gòu)建一株高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸為Y-氨基丁酸誘導(dǎo)型重組大腸桿菌，并對(duì)高表達(dá)谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究并應(yīng)用于重組菌轉(zhuǎn)化Y-氨基丁酸條件的優(yōu)化， 其特征是首次擴(kuò)增了經(jīng)多次誘變篩選獲得的具有較高谷氨酸脫羧酶活性的植物乳桿菌GB 01-21(保藏號(hào)CCTCC M 209102)的谷氨酸脫羧酶編碼基因lpgad，構(gòu)建高產(chǎn)Y -氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad。最終重組菌轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物GABA濃度為204. 5g/L，轉(zhuǎn)化率為 97. 92%。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述高產(chǎn)Y-氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構(gòu)建方法， 其特征是以植物乳桿菌GB 01-21全基因組為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物PCR擴(kuò)增谷氨酸脫羧酶基因lpgad，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET18a-lpgad。根據(jù)GeneBank公布的植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶基因組序列設(shè)計(jì)引物如下Pl 5' -GACGGATCCATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3‘；(下劃線為 BamH I 酶切位點(diǎn))P2 5' -GGCGCGGCCGCTCAGGTGTGTT TAAAGCTGTT-3‘(下劃線為 Not I 酶切位點(diǎn))提取植物乳桿菌GB 01-21染色體為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94°C，5min預(yù)變性； 940C 50s, 57 0C Imin 30s, 72°C 2min，;35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 lOmin。所得片段經(jīng)膠回收后與克隆載體PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109,經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，將重組質(zhì)粒命名為T-Lpgad，采用相同限制性內(nèi)切酶分別對(duì) T-Ipgad和pET48a(+)進(jìn)行雙酶切，膠回收Ipgad片段，將其與線性化載體pET48a(+)混合，在T4連接酶的作用下過(guò)夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETj8a-lpgad。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述，該重組大腸桿菌的基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化后獲得重組谷氨酸脫羧酶，大小為53kDa。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1和3所述，重組谷氨酸脫羧酶酶學(xué)性質(zhì)特征在于最適pH為4.8，在 PH3. 6-5. 2范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適溫度為37°C，20°C _40°C范圍內(nèi)，保溫10h，相對(duì)酶活仍在85%以上；2. 5mmol/L Ca2+時(shí)激活作用最明顯，相對(duì)酶活達(dá)巧4%，3. 5mmol/L Mg2+對(duì)重組酶GAD的激活作用最強(qiáng)，酶活達(dá)131 % ；Km為9. 21mmol/L, Vmax為7. 58mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述酶學(xué)性質(zhì)在指導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化上的應(yīng)用，其特征是根據(jù)酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果，將轉(zhuǎn)化體系的溫度、PH分別調(diào)整至最適值，并向其中添加對(duì)重組酶GAD具有促進(jìn)作用的金屬離子，來(lái)確定最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。(1)重組菌搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖1.0，蛋白胨3.0，玉米漿1.5，NaCl0.3， K2HPO4O. 1，MgS047H20 0. 05。在 pH 6. 5 7. 0、121°C下滅菌 IOmin0重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖5. 0，蛋白胨10，玉米漿7. 5，NaCl 0. 5，K2HPO4O. 1， MgS047H20 0. 05，L-谷氨酸 1. 0，生物素 2Χ1(Γ5。pH 6· 5 7· 0、121°C下滅菌 lOmin。(2)培養(yǎng)條件將斜面保藏的菌種接種至50ml(裝液量為10ml) LB培養(yǎng)基中，于旋轉(zhuǎn)式搖床中37°C、160r/min培養(yǎng)1 進(jìn)行活化，再以5 %的接種量接入500ml搖瓶(裝液量為 100ml)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體，按上述條件培養(yǎng)24h得到種子液，按10%的接種量將培養(yǎng)好的種子液接入5L全自動(dòng)發(fā)酵罐(裝液量為3L)，先于37°C、250r/min培養(yǎng)至0D_為0. 6， 再向其中添加乳糖至終濃度為lg/L，同時(shí)在線控制pH6.8流加葡萄糖，30°C，誘導(dǎo)發(fā)酵14h 至 OD6tltl 為 13.6。(3)5L發(fā)酵罐重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件為pH4.8乙酸-乙酸鈉緩沖液、2. 5mmol/L Ca2+、 3. 5mmol/L Mg2+，轉(zhuǎn)化溫度 37°C、250r/min。(4)在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化條件下，以50g/L的投料量進(jìn)行分批投料，前期由于酶活水平較高，反應(yīng)速率較快，投料間隔為每池投料一次，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，酶活有所下降，反應(yīng)速度變慢，12h后，投料時(shí)間間隔延長(zhǎng)到6h，在轉(zhuǎn)速250r/min、通氣量Ivvm的條件下轉(zhuǎn)化Mh，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液離心取上清，加入15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，取Iml進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，氨基酸自動(dòng)分測(cè)得轉(zhuǎn)化液中產(chǎn)物GABA濃度為204. 5g/L，轉(zhuǎn)化率為97. 92%。
專利摘要
一種高產(chǎn)γ-氨基丁酸重組大腸桿菌/pET-28a-lpgad的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵工程中生物技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種構(gòu)建遺傳工程菌的方法、重組酶酶學(xué)性質(zhì)研究及其在轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)GABA上的應(yīng)用。首先，PCR擴(kuò)增獲得植物乳桿菌GB 01-21谷氨酸脫羧酶(GAD)基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-lpgad，并在E.coli BL21(DE3)成功表達(dá)，其次，粗酶液采用Ni柱親和層析純化獲得重組GAD，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究，用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。最終5L發(fā)酵罐上進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，GABA累積濃度可達(dá)204.5g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為97.92％，為進(jìn)一步工業(yè)化應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/19GKCN102367432SQ201110289796
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年9月28日
發(fā)明者田靈芝, 饒志明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan