專利名稱:一種融合基因載體的構(gòu)建表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及一種融合基因載體的構(gòu)建表達(dá)及在制備腫瘤生物治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素18(IL-18)是1995年克隆的一種新型細(xì)胞因子，又稱γ干擾素誘導(dǎo)因子。能刺激γ干擾素的分泌，增強(qiáng)ThI型免疫反應(yīng)。誘生IL-18的早期研究主要集中于肝臟，后來有研究者用體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)誘導(dǎo)來獲得IL-18cDNA。本研究從健康人外周血單核細(xì)胞的RNA中，直接經(jīng)RT-PCR法擴(kuò)增出IL-18基因，說明生理情況下，單核細(xì)胞就有IL-18 MRNA的表達(dá)。在功能上，IL-18更接近于IL-12，被認(rèn)為是一種很有潛力的抗腫瘤，抗感染的細(xì)胞因子。近年的研究發(fā)現(xiàn)IL-18可以促進(jìn)DC的成熟，顯著提高DC的抗原遞呈功能，并且能吸引II類DC和誘導(dǎo)ThI型免疫反應(yīng)，國內(nèi)陳吉泉等報道以mIL-18基因修飾和3LL Lewis肺癌細(xì)胞提取物致敏的DC治療后，小鼠肺部轉(zhuǎn)移癌有明顯的抑制，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少，而且CTL、NK殺傷活性顯著增強(qiáng)，但這種CTL效應(yīng)只針對3LL Lewis肺癌細(xì)胞，而對其他腫瘤細(xì)胞株幾乎無殺傷作用。
目前研究表明，絕大多數(shù)人類惡性腫瘤均存在高水平的端粒酶活性，端粒酶活性被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞持續(xù)生長所必需的。而構(gòu)成端粒酶復(fù)合物的成分--人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的催化亞單位，為端粒酶的限速因素，在端粒酶的激活和腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，也是抗細(xì)胞凋亡的主要因子。新近，Nair等在Natural Medicine上報道以小鼠為模型，將hTERT mRNA轉(zhuǎn)染DC后產(chǎn)生抗腫瘤作用，腫瘤明顯縮小，生存期延長。Zhen Su等在2002年CancerResearch上報道用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)編碼的mRNA轉(zhuǎn)染DC具有潛在的誘導(dǎo)CTL與抗腫瘤免疫作用。Vonderheide等也有類似研究，并且針對TERT表達(dá)的腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用。
隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，加上計算機(jī)技術(shù)的引入，將功能類似或功能互補(bǔ)的2種細(xì)胞因子，通過人工接頭改造并構(gòu)建出具有復(fù)合功能的細(xì)胞因子融合蛋白的研究取得令人矚目的成就。自構(gòu)建出IL-3/GM-CSF融合蛋白(該融合蛋白的生物學(xué)活性是兩因子配合應(yīng)用時的10～30倍，已經(jīng)進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)。)以來，蛋白相繼產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)表明，這些融合蛋白不僅保留了融合前各因子的功能，而且可能產(chǎn)生更強(qiáng)更新的生物學(xué)效應(yīng)。
本發(fā)明構(gòu)建的PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18經(jīng)限制性內(nèi)切酶驗(yàn)證以及DNA測序和同源性對比分析該基因片段與NCBI基因庫hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均達(dá)到99.9％，近期xia等的研究也證實(shí)IL-18與腫瘤抗原共同結(jié)合能明顯增強(qiáng)DC的抗腫瘤作用，而不會有負(fù)向影響。本發(fā)明之所以將兩者構(gòu)建在同個載體上形成融合基因轉(zhuǎn)染，是因?yàn)榕c兩個單個基因分別轉(zhuǎn)染比較，轉(zhuǎn)染的效率高。單個基因的共轉(zhuǎn)染，不能保證兩個基因均轉(zhuǎn)染入同個細(xì)胞，從而不能同時發(fā)揮TERT對DC的刺激作用和IL-18顯著增強(qiáng)抗原遞呈的作用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)融合蛋白載體，SEQ ID NO1為該融合蛋白的基因序列。
本發(fā)明的第二個目的是提供人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)融合蛋白載體的構(gòu)建，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)1.PCR引物IL-18基因克隆的引物設(shè)計參照Genebank登錄序列，采用計算機(jī)輔助設(shè)計，由上海博亞公司合成， 序列如下引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG(Nhe I位點(diǎn))。
引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA(Hind III位點(diǎn))。
2.PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構(gòu)建(1)標(biāo)本的采取標(biāo)本為正常人外周血10毫升，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞。
(2)RNA提取用Trizol試劑盒提取總RNA(步驟按其說明書進(jìn)行)，檢測A260/A280＞1.8。
(3)hIL18 cDNA的合成及基因擴(kuò)增hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。基因擴(kuò)增采用PCR法，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因。
(4)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構(gòu)建將IL-18 PCR擴(kuò)增、電泳、回收和純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測序鑒定后亞克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT質(zhì)粒中Nhe I和Hind III位點(diǎn)之間。在兩個基因連接區(qū)插入直鏈氨基酸，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒。
3.PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18融合基因的鑒定(1)PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鑒定提取的少量質(zhì)粒分別經(jīng)Nhe I、Not I雙酶切；Nhe I、Hind III雙酶切和EcoR I、Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)分子量的大小判斷是否有hIL-18，hTERT及hTERT+hIL-18片段，(2)PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的DNA序列分析陽性的hTERT+hIL-18融合基因克隆，DNA序列的分析委托上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
本發(fā)明的另一個目的是提供人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)融合蛋白載體的表達(dá)，通過一下步驟實(shí)現(xiàn)1.轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞將培養(yǎng)的3T3細(xì)胞按1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24h至細(xì)胞達(dá)80％-85％，然后按試劑說明書步驟用lipofectamineTM2000分別包裹需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒到Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen公司)并混勻，逐滴加入已換無血清培養(yǎng)基的3T3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6小時換上20％胎牛血清的DMEM。
2.免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48h后1孔細(xì)胞免疫熒光染色∶無水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室溫90m，PBS洗滌后加入熒光標(biāo)記的1∶200的二抗(FITC)30m，PBS洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察。
3.Western-blot檢測融合蛋白的表達(dá)收集5×106個細(xì)胞，用全細(xì)胞蛋白抽提試劑盒。40μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10％SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％的脫脂奶粉封閉1小時，分別加入抗人IL-18(1∶1000，Santa Cruz)、抗人TERT(1∶1000，Santa Cruz)，于4℃冰箱過夜，洗膜3次，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000，SantaCruz)，室溫反應(yīng)2小時，洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影。結(jié)果與MARKER(Novagen 71047-3)比較TERT/IL-18的分子量大小。
本發(fā)明的又一個目的是提供這種融合基因載體在制備腫瘤生物治療藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明的有益之處是1.利用基因工程技術(shù)，將功能類似或功能互補(bǔ)的2種細(xì)胞因子，通過人工接頭改造并構(gòu)建出具有復(fù)合功能的細(xì)胞因子融合蛋白。
2.IL-18與TERT融合蛋白表達(dá)，使其有可能既具有對腫瘤細(xì)胞殺傷靶向性強(qiáng)的特點(diǎn)，有能明顯提高樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)。
3.為制備理想的樹突狀細(xì)胞疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究的疫苗用于消滅微小殘留病，在惡性血液病患者達(dá)到異基因骨髓移植相當(dāng)?shù)寞熜?。預(yù)計每例病人費(fèi)用比異基因骨髓移植減少20萬元以上，可明顯降低醫(yī)療費(fèi)用。
4.本發(fā)明構(gòu)建的融合基因經(jīng)免疫熒光染色和Western bloting證實(shí)，能在真核細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)融合蛋白。同時，該融合基因的IL-18能刺激KG-1細(xì)胞分泌γ干擾素，而TERT蛋白能發(fā)揮抗MTX誘導(dǎo)凋亡的能力，說明融合蛋白中的IL-18和TERT各自都能發(fā)揮生物學(xué)功能，而且互不干擾。
5.本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)和生物學(xué)功能測定，為以后轉(zhuǎn)染DC奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，即既能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時擴(kuò)大樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤范圍，為發(fā)揮樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，研制腫瘤的治療性疫苗提供基礎(chǔ)。
圖1為IL-18 cDNA的RT-PCR產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖2為融合基因酶切后產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖；圖3為融合基因載體PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18 CDNA的序列測定圖；圖4為轉(zhuǎn)染hIL-18，hTERT和hTERT+hIL-18的DC誘導(dǎo)的CTL對K562和A549殺傷效應(yīng)的比較；圖5為3T3細(xì)胞表達(dá)hTERT/IL-18融合蛋白(綠色熒光)右側(cè)為同一視野對照圖；圖6為3T3細(xì)胞表達(dá)hTERT/IL-18融合蛋白Western bloting檢測圖；圖7為hTERT/IL-18融合蛋白刺激KG-1細(xì)胞分泌γ-干擾素圖；圖8為hTERT/IL-18融合蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞抗MTX誘導(dǎo)凋亡的能力圖。
具體實(shí)施方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一1.材料1.1.1菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α；真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1(+)/hTERT和PCDNA3.1(+)。
1.1.2試劑 限制性內(nèi)切酶Hind III、Nhe I、EcoR I、Not I，T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒等均購自美國Promega公司；IL-18和TERT抗體和γ-干擾素ELISA試劑盒購自R&D公司，總RNA提取試劑盒為Invitrogene公司產(chǎn)品；凋亡檢測試劑盒購自Bender公司；MTX購自Sigma公司；酵母提取物、胰蛋白胨等細(xì)菌培養(yǎng)試劑為英國Oxford產(chǎn)品；瓊脂糖、RNA酶、膠回收試劑盒為Sangon公司產(chǎn)品；氯化鈣、SDS、淋巴細(xì)胞分離液、醋酸鈉為國產(chǎn)試劑。
1.1.3PCR引物 IL-18基因克隆的引物設(shè)計參照Genebank登錄序列，采用計算機(jī)輔助設(shè)計，由上海博亞公司合成，序列如下引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG(Nhe I位點(diǎn))。
引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA(Hind III位點(diǎn))。
2.方法2.1人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)載體的構(gòu)建2.1.1PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構(gòu)建(1)標(biāo)本的采取 標(biāo)本為正常人外周血10毫升，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞。
(2)RNA提取 用Trizol試劑盒提取總RNA(步驟按其說明書進(jìn)行)，檢測A260/A280＞1.8。
(3)hIL18 cDNA的合成及基因擴(kuò)增hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。基因擴(kuò)增采用PCR法，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因。
(4)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構(gòu)建將IL-18 PCR擴(kuò)增、電泳、回收和純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測序鑒定后亞克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT質(zhì)粒中Nhe I和Hind III位點(diǎn)之間。在兩個基因連接區(qū)插入直鏈氨基酸，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒。
2.2PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18融合基因的鑒定2.2.1PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鑒定提取的少量質(zhì)粒分別經(jīng)Nhe I、Not I雙酶切；Nhe I、Hind III雙酶切和EcoR I、Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)分子量的大小判斷是否有hIL-18，hTERT及hTERT+hIL-18片段，2.2.2PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18的DNA序列分析陽性的hTERT+hIL-18融合基因克隆，DNA序列的分析委托上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。
2.2.3人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)載體的表達(dá)(1)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞將培養(yǎng)的3T3細(xì)胞按1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24h至細(xì)胞達(dá)80％-85％，然后按試劑說明書步驟用lipofectamineTM2000分別包裹需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒到Opti-MEM I培養(yǎng)基(Invitrogen公司)并混勻，逐滴加入已換無血清培養(yǎng)基的3T3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6小時換上20％胎牛血清的DMEM。
(2)免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48h后1孔細(xì)胞免疫熒光染色∶無水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室溫90m，PBS洗滌后加入熒光標(biāo)記的1∶200的二抗(FITC)30m，PBS洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察。
(3)Western-b1ot檢測融合蛋白的表達(dá)收集5×106個細(xì)胞，用全細(xì)胞蛋白抽提試劑盒。40μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10％SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％的脫脂奶粉封閉1小時，分別加入抗人IL-18(1∶1000，Santa Cruz)、抗人TERT(1∶1000，Santa Cruz)，于4℃冰箱過夜，洗膜3次，加HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000，SantaCruz)，室溫反應(yīng)2小時，洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影。結(jié)果與MARKER(Novagen 71047-3)比較TERT/IL-18的分子量大小。
實(shí)施例二 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)融合基因的生物學(xué)功能檢測1.融合基因刺激KG-1細(xì)胞分泌γ-干擾素的生物學(xué)功能檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液γ-干擾素含量的檢測取出轉(zhuǎn)染融合基因的3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液0.1ml，從1×106/ml的KG-1細(xì)胞中取0.1ml至96孔板，分別以原液，1∶2稀釋，1∶5稀釋，1∶10稀釋，1∶20稀釋，正常3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清液(陰性對照)，以及標(biāo)準(zhǔn)IL-18刺激液(陽性對照)和空白對照(PBS)。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。采用定量酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA法)，按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。在酶標(biāo)儀490nm波長處測吸光度(A值)。根據(jù)CurveExpert軟件分析計算。
2.融合基因抗凋亡的功能檢測用已知的凋亡誘導(dǎo)劑甲氨蝶聆(MTX)，分別以不同濃度0nm，1nm，10nm，50nm，100nm作用于轉(zhuǎn)染的5×105/ml 3T3細(xì)胞和正常的3T3細(xì)胞24小時。參照Annexin V細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，1000rpm/min離心，4℃7min，棄上清。將細(xì)胞重懸于1ml 1×Bindingbuffer，取100μl細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀專用試管中，加5μl Aannexin V FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min，加入300μl 1×Binding buffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測，Cellquest 1.2分析軟件分析結(jié)果。
實(shí)施例三1.融合基因電轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞(1)取2×106個細(xì)胞，用無血清無抗生素的培養(yǎng)基洗滌2次后，混懸于400微升的hypo-osmolarbuffer(Eppendorf公司產(chǎn)品)電轉(zhuǎn)緩沖液。
(2)取10微克無菌無熱源的融合基因質(zhì)粒加于上述細(xì)胞懸液中，輕柔混勻后，轉(zhuǎn)移至400微升的電轉(zhuǎn)杯中(Electroporation cuvette)2mm間距，400ul容積。
(3)將電轉(zhuǎn)杯置于電轉(zhuǎn)儀(Multiporator Eppendorf)中，300V/20us電流沖擊2次，期間間隔1分鐘。
(4)吸出電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞，用10ml含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次(800rpm×5min)；并培養(yǎng)于15％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。
2.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的體外誘導(dǎo)及殺傷活性的檢測分離正常人外周血的T淋巴細(xì)胞，與融合基因轉(zhuǎn)染后的DC在含IL-250U/ml 15％FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基中共同孵育5天，比例為T∶DC為30∶1，第5天收集活細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，51Cr標(biāo)記1h的hTERT高表達(dá)的K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以100∶1、50∶1、25∶1不同的效靶比，用51Cr 4h釋放法檢測CTL的活性，同時設(shè)最大釋放組和自然釋放組，同時以取自正常人的滑膜細(xì)胞作為對照細(xì)胞(無hTERT表達(dá))。以下式計算殺傷率∶殺傷率＝(實(shí)驗(yàn)組cpm-自然釋放組cpm)/(最大釋放組cpm-自然釋放組cpm)×100％。
結(jié)果1.重組IL-18cDNA RT-PCR產(chǎn)物的初步鑒定根據(jù)所設(shè)計的引物，預(yù)計擴(kuò)增片段的大小為510BP左右，2％瓊脂凝膠電泳顯示的條帶基本符合預(yù)期的DNA片段，參見圖1，其中1 IL-18 cDNA(510bp)；2陰性對照。說明擴(kuò)增產(chǎn)物為IL-18 CDNA片段。說明擴(kuò)增產(chǎn)物為IL-18 CDNA片段。
2.質(zhì)粒PCDNA3.1(+)/hTERT+hIL-18的酶切鑒定將挑選出的陽性克隆擴(kuò)增后取菌液初步抽提質(zhì)粒，分別經(jīng)Nhe I/Not I、Nhe I/Hind III和EcoR I/Not I三對內(nèi)切酶酶切后，1％瓊脂凝膠電泳顯示三條分子量大小不同的條帶，參見圖2，圖中1PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18經(jīng)Nhe I/Hind III酶切，2PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18經(jīng)EcoR I/NotI酶切，3PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18經(jīng)Nhe I/Not I酶切，4PCDNA3.1(+)(5428bp)。Nhe I/Hind III雙酶切，見到分子量510bp大小的條帶(hIL-18)，證實(shí)插入的片段與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小一致，所篩選的克隆含IL-18cDNA片段。EcoR I/Not I雙酶切后，見到分子量3.4Kb大小的條帶(hTERT)，Nhe I/Not I雙酶切后，可以見到分子量約3.9Kb左右的條帶(hTERT+hIL-18)，證實(shí)了PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18的融合基因。
3.PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18 CDNA的序列測定將質(zhì)粒PCDNA3.1(+)/hTERT+IL-18DNA測序(參見圖3)和同源性對比分析該基因片段與http://ncbi.nlm.nih.gov的基因數(shù)據(jù)庫(AllGenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase 0，1 or2 HTGS sequences)比較融合基因的前面部分與hIL-18基因的符合率為570/574(99％)，融合基因的前面部分與hTERT基因的符合率為395/406(97％)，而與hTERT啟動子基因的符合率為221/222(99％)。結(jié)果表明，所構(gòu)建的cDNA片段即為人TERT和IL-18融合的編碼基因。圖3中融合基因載體PCDNA 3.1(+)/hTERT+hIL-18連接部分的DNA序列AAGCTTIL-18 Hind III的酶切點(diǎn)；GAATTC TERT EcoR I的酶切點(diǎn)。
實(shí)施例四 疫苗誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對白血病和肺癌細(xì)胞的殺傷1.對表達(dá)hTERT的白血病和肺癌細(xì)胞株的殺傷分別以融合基因(hTERT+hIL-18)以及hTERT，hIL-18轉(zhuǎn)染后的DC，刺激誘導(dǎo)形成CTL細(xì)胞，作為效應(yīng)細(xì)胞，51Cr標(biāo)記1h的hTERT高表達(dá)的白血病細(xì)胞K562和肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，以上述不同的效靶比，檢測CTL的活性，按照上述計算公式。
2.體外實(shí)驗(yàn)表明，融合基因轉(zhuǎn)染的DC，誘導(dǎo)刺激形成的CTL細(xì)胞對高表達(dá)hTERT的白血病細(xì)胞和肺癌細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用。25∶1、50∶1、100∶1不同的效靶比下，轉(zhuǎn)染融合基因(hTERT+hIL-18)的DC激的CTL細(xì)胞對K562的殺傷率分別為(18.1％；32.7％；47.6％)，對A549的殺傷率為(16.2％；29.8％；45.3％)。轉(zhuǎn)染hTERT的DC刺激的CTL細(xì)胞對K562的殺傷率分別為(17.3％；28.6％；40.9％)，對A549的殺傷率分別為(14.4％；23.5％；40.1％)轉(zhuǎn)染hIL-18的DC刺激的CTL細(xì)胞對K562的殺傷率分別為(12.8％；18.8％；26.7％)，對A549的殺傷率分別為(12.2％；18.7％；25.9％)，參見圖4，在同樣實(shí)驗(yàn)條件下，對hTERT無表達(dá)的正常滑膜細(xì)胞無殺傷作用(殺傷率分別為9.7％；15.6％；18.4％)。由此可見，轉(zhuǎn)染融合基因的DC刺激誘導(dǎo)的CTL對高表達(dá)hTERT的白血病和肺癌細(xì)胞都有殺傷作用，雖然hTERT與hTERT+hIL-18轉(zhuǎn)染的DC誘導(dǎo)的CTL效應(yīng)沒有明顯差異(p＞0.05)，但是其殺傷效應(yīng)還是有提高的。而僅轉(zhuǎn)染hIL-18的DC誘導(dǎo)的CTL效應(yīng)，由于沒有腫瘤抗原的刺激，其CTL效應(yīng)是比較低的(p＜0.05)。所以，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了我們的設(shè)想，這樣也為制備理想的樹突狀細(xì)胞疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。圖4A為K562的CTL殺傷效應(yīng)，圖4B為A549的CTL殺傷效應(yīng)。
實(shí)施例五 融合蛋白的表達(dá)鑒定1.表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光鑒定48h后免疫熒光染色顯示融合蛋白彌散表達(dá)于胞漿，參見圖5，為3T3細(xì)胞表達(dá)hTERT/IL-18融合蛋白(綠色熒光)右側(cè)為同一視野對照。
2.表達(dá)產(chǎn)物的Western bloting鑒定收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取全蛋白，分別加入抗人IL-18(參見圖6)、抗人TERT抗體(圖未顯示)，目的基因表達(dá)產(chǎn)物可以分別與hTERT抗體及hIL-18抗體特異性結(jié)合。X片曝光顯影后可見到融合蛋白分子量約127KD左右，與預(yù)期一致。證實(shí)了hTERT/hIL-18融合基因在3T3細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。圖6為3T3細(xì)胞表達(dá)hTERT/IL-18融合蛋白Western bloting檢測。
實(shí)施例六 hTERT/IL-18融合蛋白的生物學(xué)功能檢測1.融合蛋白能明顯刺激KG-1細(xì)胞分泌γ-干擾素。正常3T3細(xì)胞上清與空白對照組刺激KG-1細(xì)胞分泌γ-干擾素的能力明顯較弱，與原液組有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。原液刺激KG-1細(xì)胞分泌γ-干擾素的能力與標(biāo)準(zhǔn)品相似(p＞0.05)。隨著上清的稀釋倍數(shù)增加，刺激KG-1細(xì)胞分泌γ-干擾素的能力逐步下降(見圖7)。
2.融合蛋白抗MTX誘導(dǎo)凋亡的生物學(xué)功能檢測Annexin VFITC及PIPE雙標(biāo)記細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，MTX 0-100nm作用24h，正常3T3細(xì)胞凋亡(AnnexinVFITC陽性LR+UR象限)百分?jǐn)?shù)分別為0.71％；2.46％；4.19％；6.68％；10.81％，轉(zhuǎn)染融合基因的細(xì)胞組分別為0.82％；1.90％；2.13％；2.72％；2.94％(圖8)；從以上數(shù)據(jù)可知，隨著藥物濃度上升，正常細(xì)胞組細(xì)胞凋亡數(shù)增加；而轉(zhuǎn)染融合基因的細(xì)胞組凋亡不明顯(在10nm濃度以上正常組與轉(zhuǎn)染組之間有統(tǒng)計學(xué)差異)。
3.用途初步的實(shí)驗(yàn)表明，體外誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對高表達(dá)hTERT的細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用，而對hTERT無表達(dá)的正?；ぜ?xì)胞無殺傷作用，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的設(shè)想，為制備理想的樹突狀細(xì)胞疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的實(shí)施方案應(yīng)理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>一種融合基因載體的構(gòu)建表達(dá)及用途<160>3<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1033<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)…(583)(619)…(624)(629)…(1033)<223>n＝a或g或c或t<400>1ATGgGCTGAC CAGTAGAAGA CAATTGCATC AACTTTGTGG CAATGAAATT TATTGACAAT 60aCGTTtTact TTATAGCTGA AGATGATGAA AACCTGGAAT CaGATTActT TGGCAAGCTT 120GAATCTAAAT TATCAGTCAT AAGAAATTTG AATGACCAAG TTCTCTTCAT TGACCAAGGA 180AATCGGCCTC TATTTGAAGA TATGACTGAT TCTGACTGTA GAGATAATGC ACCCCGGACC 240ATATTTATTA TAAGTATGTA TAAAGATAGC CAGCCTAGAG GTATGGCTGT AACTATCTCT 300GTGAAGTGTG AGAAAATTTC AACTCTCTCC TGTGAGAACA AAATTATTTC CTTTAAGGAA 360ATGAATCCTC CTGATAACAT CAAGGATACA AAAAGTGACA TCATATTCTT TCAGAGAAGT 420GTCCCAGGAC ATGATAATAG GATGCAATTT GAATCTTCAT CATACGAAGG ATACTTTCTA 480GCTTGTGAAA AAGAGAGAGA CCTTTTTAAA CTCATTTTGA AAAAAGAGGA TGAATTGGGG 540GATAGATCTA TAATGTTCAC TGGTTCAAAA CGAAGACAAG CTTGGTACCG AGCTCGGATC 600CACTAGTCCA GTGTGGTGGA ATTCCACCAT GCCGCGCGCT CCCCGCTGCC GAGCCGTGCG 660
CTCCCTGCTG CGCAGCCACT ACCGCGAGGT GCTGCCGCTG GCCACGTTCG TGCGGCGCCT 720GGGGCCCCAG GGCTGGCGGC TGGTGCAGCG CGGGGACCCG GCGGCTTTCC GCGCGCTGGT 780GGCCCAGTGC CTGGTGTGCG TGCCCTGgGA CGCACGGCCG CCCCCCGCCG CCCCTCCTTC 840CGCCAGGTGT CCTGCCTGAA GGAGCTGGTG GCCCGAGTGC TGCAGAGGCT GTGCGAGCGC 900GGCGCGARAC GTGCTGGCCT TCGGCTTCSC GCTGCTGGAC GGGGCCGCGG GGCCCCCCGA 960GGTCTTCACC ACAGCGTGCG CAGCTACCTG CCCAACACGG TGACCGACGC ACTGSCGGGG 1020GAGCGGGCGT GGG 1033<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(4)…(9)<223>n＝a或g或c或t<400>1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG 31<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(4)…(9)<223>n＝a或g或c或t<400>1GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA 30
權(quán)利要求
1.一種人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細(xì)胞介素18融合蛋白載體，SEQ ID NO1為該融合蛋白的基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細(xì)胞介素18融合蛋白載體的構(gòu)建，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)PCDNA3.1(+)/hTERT-hIL18質(zhì)粒的構(gòu)建標(biāo)本為正常人外周血10毫升，淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取總RNA，檢測A260/A280＞1.8，hIL18 cDNA的合成采用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，基因擴(kuò)增采用PCR法，PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測有無目的基因，將IL-18PCR擴(kuò)增、電泳、回收和純化片段，通過T-A克隆，經(jīng)DNA測序鑒定后亞克隆到PCDNA 3.1(+)/hTERT質(zhì)粒中Nhe I和Hind III位點(diǎn)之間，在兩個基因連接區(qū)插入直鏈氨基酸，連接后，以氯化鈣沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿，挑選陽性菌落，接種于2毫升含有氨芐的LB液體培養(yǎng)基中過夜，抽提質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細(xì)胞介素18融合蛋白載體的構(gòu)建，其特征是PCR引物1CTGGCTAGCATGGCTGCTGAACCAGTAGAAG，Nhe I位點(diǎn)，引物2GGGAAGCTTGTCTTCGTTTTGAACCAGTGA，Hind III位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細(xì)胞介素18融合蛋白載體的表達(dá)，其特征是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞將培養(yǎng)的3T3細(xì)胞按1×105/孔接種24孔板，培養(yǎng)24h至細(xì)胞達(dá)80％-85％，然后按試劑說明書步驟用lipofectamineTM2000分別包裹需要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒到Opti-MEM I培養(yǎng)基并混勻，逐滴加入已換無血清培養(yǎng)基的3T3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6小時換上20％胎牛血清的DMEM；(2)免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48h后1孔細(xì)胞免疫熒光染色無水乙醇固定后加入1∶50的hTERT一抗，室溫90m，PBS洗滌后加入熒光標(biāo)記的1∶200的二抗FITC 30m，PBS洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察；(3)Western-blot檢測融合蛋白的表達(dá)收集5×106個細(xì)胞，用全細(xì)胞蛋白抽提試劑盒，40μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進(jìn)行10％SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％的脫脂奶粉封閉1小時，分別加入1∶1000，Santa Cruz的抗人IL-18和1∶1000，Santa Cruz的抗人TERT，于4℃冰箱過夜，洗膜3次，加HRP標(biāo)記的1∶2000，Santa Cruz的二抗，室溫反應(yīng)2小時，洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，X片曝光顯影，結(jié)果與MARKER比較TERT/IL-18的分子量大小。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/人白細(xì)胞介素18融合蛋白載體在制備腫瘤生物治療藥物中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，將功能類似或功能互補(bǔ)的2種細(xì)胞因子，通過人工接頭改造并構(gòu)建出具有復(fù)合功能的細(xì)胞因子融合蛋白人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)融合蛋白。并建立人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)/人白細(xì)胞介素18(hIL18)融合蛋白載體的表達(dá)，使其有可能既具有對腫瘤細(xì)胞殺傷靶向性強(qiáng)的特點(diǎn)，又能明顯提高樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的免疫效應(yīng)，擴(kuò)大其抗腫瘤范圍，為制備理想的樹突狀細(xì)胞疫苗奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，研究表明在惡性血液病患者達(dá)到異基因骨髓移植相當(dāng)?shù)寞熜В擅黠@降低醫(yī)療費(fèi)用，為研制腫瘤的治療性疫苗提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/79GK1995356SQ200610155201
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月14日
發(fā)明者童向民, 金潔, 姚航平 申請人:浙江大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan