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      一種基因敲除打靶載體及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:573826閱讀:760來源:國知局
      專利名稱:一種基因敲除打靶載體及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種基因敲除打靶載體及其應(yīng)用,具體地說,涉及一種無啟動子的同 時帶有正、負(fù)篩選基因的基因敲除打靶載體及其應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      2000年第一例體細(xì)胞基因打靶克隆羊誕生之后,體細(xì)胞基因打靶結(jié)合核移植技術(shù) 被廣泛應(yīng)用于對大動物基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾?;虼虬谢诘脑硎荄NA分子間的同源 重組。在大動物體細(xì)胞中,同源重組的概率非常低,表現(xiàn)在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)過藥物篩選獲得 的隨機(jī)整合的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于同源重組的細(xì)胞,往往需要篩選大量的細(xì)胞才能獲得基因打靶 的細(xì)胞。盡管之前的研究采用很多篩選方法,比如正負(fù)篩選、無啟動子篩選等用來排除隨 機(jī)整合的細(xì)胞,但這種富集基因打靶事件的效率一般在0.41% -11% (Kuroiwa等,2004 ; Takahagi, 2005 ;Shen,2007)。通常需要從上百個細(xì)胞克隆點(diǎn)中篩選出幾個發(fā)生了基因打靶 的細(xì)胞克隆,極大地增加了后續(xù)細(xì)胞凍存和鑒定的工作。PRNP基因編碼朊蛋白。結(jié)構(gòu)異常的朊蛋白是瘋牛病和羊瘙癢病的致病蛋白。理論 上講,敲除了 PRNP基因的牛羊?qū)⒉辉俦化偱2』蝠W病傳染。目前,對牛羊的PRNP基因的 敲除已經(jīng)有3個課題組獲得成功,他們使用的載體及細(xì)胞篩選方法富集基因打靶的效率分 別為 10. 3% (55/533,Denning 等,2001)、0· 6% (1/163,Yu 等,2006)、4· 9% (10/204, Zhu, 2008) ,6. 4% (13/203,Kuroiwa, 2004) ,5. 2% (17/327,Kuroiwa,2004),也就是說,他們需 要從上百個細(xì)胞中篩選出幾個發(fā)生了 PRNP基因打靶的細(xì)胞,很容易丟失陽性細(xì)胞。本發(fā)明利用構(gòu)建的無啟動子打靶載體和負(fù)篩選基因簡單高效的獲得了 PRNP基因 敲除細(xì)胞,富集效率為100% (2/2)和60% (3/5)。本研究的最大優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞篩選方法簡 單,不需大量人力物力,以及極大地方便了后續(xù)的細(xì)胞凍存和鑒定,大大降低了基因打靶的 成本。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的富集基因打靶細(xì)胞效率低而存在的缺陷,提供一種 基因敲除打靶載體,所要解決的技術(shù)問題是通過基因敲除打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提高富集基 因打靶細(xì)胞效率,從而簡化基因打靶細(xì)胞的篩選與鑒定工作,大大降低了基因打靶的成本。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提 供的一種基因敲除打靶載體,其包括正篩選基因,在正篩選基因的兩端具有重組酶識別序 列,所述重組酶識別序列的另一端分別與被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相連,所述兩 同源臂的內(nèi)部不具有啟動正篩選基因表達(dá)的啟動子,在所述同源臂的外側(cè)還具有負(fù)篩選基 因。本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題還可以采用以下的技術(shù)措施來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。前述的基因敲除打靶載體,所述正篩選基因?yàn)榫幋a新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)、潮 霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(hph)、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(gpt)、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)或嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(puro)的基因。前述的基因敲除打靶載體,所述負(fù)篩選基因?yàn)樾叵偃パ鹾塑?DTA),或者編碼次黃 嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶(gpt)、胸腺嘧啶激酶(tk)、白喉 毒素(DT)或單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)的基因。前述的基因敲除打靶載體,所述重組酶識別序列為Cre酶識別序列或FLP酶識別 序列。前述的基因敲除打靶載體,所述同源臂為牛PRNP基因的序列。前述的基因敲除打靶載體,其為LoxPneo-PRNP KO或LoxPhyg-PRNP KO0所述打靶載體在胞內(nèi)定點(diǎn)敲除基因中的應(yīng)用。一種提高基因打靶細(xì)胞富集率的方法,使用前述的打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過含有 與正篩選基因相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基篩選陽性克隆,使陽性克隆得到富集。一種敲除牛PRNP基因的方法,其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO 之一的打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用相應(yīng)的藥物篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,再用另一個打靶載體轉(zhuǎn)染 細(xì)胞并用相應(yīng)的藥物篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。前述的敲除牛PRNP基因的方法,其使用打靶載體LoxPneo-PRNPKO轉(zhuǎn)染牛成纖維 細(xì)胞,在含有G418的細(xì)胞培養(yǎng)基上篩選得到陽性細(xì)胞克隆,并對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定; 用LoxPhyg-PRNP KO轉(zhuǎn)染PRNP基因一個等位基因發(fā)生敲除的牛成纖維細(xì)胞,并用含潮霉素 B的細(xì)胞培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞克隆,并對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定。借由上述技術(shù)方案,本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明首次將無啟動子打靶載體與正、負(fù)篩選基因結(jié)合使用,因此,能夠極大 地排除隨機(jī)整合的細(xì)胞,提高打靶細(xì)胞富集效率;(2)在構(gòu)建基因敲除打靶載體時,本發(fā)明首次在無啟動子的正篩選基因兩側(cè)引入 LoxP序列,以方便后續(xù)的標(biāo)記基因的刪除;(3)經(jīng)基因敲除打靶載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,富集基因打靶細(xì)胞效率高,細(xì)胞篩選方法 簡單,不需大量人力物力,極大地方便了后續(xù)的細(xì)胞凍存和鑒定,大大降低了基因打靶的成 本。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述,為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段, 而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施,并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠 更明顯易懂,以下特舉較佳實(shí)施例,并配合附圖,詳細(xì)說明如下。


      圖1為本發(fā)明較佳實(shí)施例PRNP基因無啟動子打靶載體構(gòu)建流程圖。圖2為本發(fā)明較佳實(shí)施例pMD19-T-5,同源臂質(zhì)粒酶切鑒定圖,M,Ikb DNA marker ; 1,質(zhì)粒對照;2,Not I單酶切,5kb ;3,Not I和BsiW I雙酶切,2. 7kb+2. 3kb ;4,5,同源臂 PCR產(chǎn)物對照,2. 3kb。圖3為本發(fā)明較佳實(shí)施例pGEM-T-3,同源臂質(zhì)粒酶切鑒定圖,M,Ikb DNA marker ; 1,質(zhì)粒對照;2,Nhe I 和 Sal I 雙酶切,7. lkb+3. Okb ;3,Nhe I 單酶切,10. lkb。圖4為本發(fā)明較佳實(shí)施例LoxPhyg-PRNP KO質(zhì)粒酶切鑒定圖,1,15kb DNA marker ; 2,Nhe I 單酶切,15,472bp ;3,Sac II 酶切,12. 3kb+3. Ikb ;4,Not I 和 Sal I 雙酶切,10. 9kb+4. 5kb ;5,Not I 和 Nhe I 雙酶切,11. 5kb+3. 9kb ;6,質(zhì)粒對照;7,Ikb DNA marker 圖5為本發(fā)明較佳實(shí)施例LoxPneo-PRNP KO質(zhì)粒酶切鑒定圖,1,15kb DNA marker ; 2,Sac II 單酶切,15,113bp ;3,Not I 和 NheI 雙酶切,11. 5kb+3. 5kb ;4,Not I 和 Sal I 雙酶切,10. 6kb+4. 5kb ;5,Nhe I 和 Sal I 雙酶切,8. lkb+7. Okb ;6,質(zhì)粒對照;7,Ikb DNA markerο
      具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 PRNP基因無啟動子打靶載體的構(gòu)建PRNP基因無啟動子打靶載體的構(gòu)建過程請參閱圖1。在本實(shí)施例中,取牛胎兒皮膚組織剪碎成Imm3左右的小塊,DMEM/F12清洗兩遍后 分批植塊于含ImL DMEM/F12+10% FBS的25cm2的培養(yǎng)瓶中,待組織塊貼壁牢固后再補(bǔ)加 DMEM/F12+10% FBS至6mL,于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 7天,每2天換液1次,待細(xì)胞 生長匯合后,以0. 25%胰蛋白酶消化傳代2 3次,分批以DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO 凍存,獲得牛胎兒成纖維細(xì)胞。以牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組為模板,分別擴(kuò)增5’同源臂和3’同源臂。5’ 同源臂的引物為,LoxP-5F:5’ -TTGC/GGCCGCTATAACACAG CCAGGCATTC AG-3,, 下劃線部分為Not I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn);LoxP-5R :5,TCT C/GTACG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAGTTAT GATGAC TTATCTGCAA AATAAAG-3,,下劃線部分為 BsiW I 限制 性內(nèi)切酶識別位點(diǎn),斜體部分是IoxP序列。5 ’同源臂長度為2,323bp,從PRNP基因(Genbank No. AJ298878)的63,256bp到65,578bp處,包含了 PRNP基因第三外顯子上游2,313bp和第 三外顯子前IObp的序列(即第三外顯子翻譯起始位點(diǎn)ATG上游的序列)。3,同源臂的引物為,LoxP-3F 5,-ATTG/CTAGCCCTCTTATACATTTTGGCAGTG-3,,下 劃線部分為Nhe I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn);LoxP-3R:5,-TAT G/TCGAC GAAACAGTGGAAAGTG TCAGAC-3’,下劃線部分為Sal I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。3’同源臂長度為7,074bp,從PRNP 基因的66,020bp到73,093bp處,包含了 PRNP基因第三外顯子內(nèi)452bp以后直到第三外顯 子下游3,434bp的序列。因此,經(jīng)過基因敲除后,PRNP基因的第三外顯子將會被刪除442bp, 此序列恰好是PRNP基因編碼框的前442bp。同源臂的PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系為50μ 1反應(yīng)體系,其中牛胎兒成纖維細(xì)胞基因 組 2μ KlOOng/μ 1),primer(20pmol/μ 1)各 1μ 1,dNTP(10mM)8y 1,5XLA PCR Buffer 5 μ 1,LA Taq 酶(Takara) 0. 5 μ 1,用水補(bǔ)足 50 μ 1 體系。反應(yīng)條件如下94°C lmin,98°C 10sec68°C 24sec,30 個循環(huán),68°C 10min,4°C保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體(TaKaRa)或pGEM_T載體(Promega)進(jìn)行連接、 轉(zhuǎn)化,挑取重組子,進(jìn)行酶切和測序鑒定,請參閱圖2和圖3。測序結(jié)果表明該序列與已知序 列的同源性達(dá)到99. 9%,可以作為同源臂使用。在牛中PRNP基因是位于13號染色體的單拷貝基因,因此,為了敲除PRNP基因的 兩個等位基因需要對成纖維細(xì)胞進(jìn)行兩輪打靶,這就需要使用兩種不同的正篩選基因進(jìn)行 細(xì)胞篩選。本發(fā)明選擇了新霉素基因和潮霉素B基因作為兩種正篩選基因。本發(fā)明利用PCR擴(kuò)增的方法,分別從打靶載體骨架載體pPGKneoLoxP2PGKDTA (Clontech 公司)和商業(yè)化載體pIREShyg3 (Clontech 公司)上擴(kuò)增出 neo-polyA序列和 hyg-polyA 序列。擴(kuò)增 neo-polyA序列的 PCR 引物為,LoxP-neoF 5'-TCT C/GTACGCCACCATGGG ATCG GCCATTGAACAAG-3,,下劃線部分為BsiWI限制性內(nèi)切酶識別位 點(diǎn),ATG 為 neo 基因翻譯起始位點(diǎn);LoxP-neoR :5,-TAA G/CTAGC GGACCTAATAACTTCGTATAAT GTATGCTATAC-3,,下劃線部分為Nhe I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物大小為1,216bp, 包括完整的neo-polyA序列及其下游的IoxP序列。擴(kuò)增hyg-polyA 序列的 PCR 引物為,LoxP-hygF :5,TCTC/GTACGCCACCATGGA TAGATC CGGAAAGCCTG-3,,下劃線部分為BsiWI限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn),ATG為hyg基因翻 譯起始位點(diǎn)LoxP-hygR :5’ -TAAG/CTAGC ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA AG TTATCTAG AATGCAGTGAAAAAAATG-3,,下劃線部分為Nhe I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn),斜體部分是IoxP序 列。PCR產(chǎn)物大小為l,614bp,包括完整的hyg-polyA序列及通過PCR引物添加的IoxP序 列。擴(kuò)增neo-polyA序列和hyg-polyA序列的PCR反應(yīng)體系為50 μ 1反應(yīng)體系,其中 質(zhì)粒 1μ KlOOng/μ 1) ,primer (20pmol/μ 1)各 1 μ 1, dNTP (IOmM) 6 μ 1,5XLA PCR Buffer 5 μ 1,LA Taq 酶(Takara) 0. 3 μ 1,用水補(bǔ)足 50 μ 1 體系。反應(yīng)條件如下94°C 5min,94°C 20sec60°C 30sec 72°C lmin,35 個循環(huán),72°C 7min,4°C保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Promega pGEM_T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,挑取在T載體多克隆位 點(diǎn)處連接順序?yàn)镹ot I-Bsiff I-neo/hyg-polyA-Nhel的重組子,進(jìn)行酶切和測序鑒定。測 序結(jié)果表明neo-polyA序列和hyg-polyA序列與載體上的相應(yīng)序列完全一致,理論上說,打 靶載體發(fā)生定點(diǎn)整合后,在PRNP基因啟動子的作用下應(yīng)該能夠表達(dá)出抗性蛋白。連接方向 正確的重組子稱為pGEM-T-Neo/Hyg PA載體。將pGEM-T-Neo/Hyg PA質(zhì)粒和pMD19_T_5,同源臂質(zhì)粒小量提取后,經(jīng)過Not I 和BsiW I酶切,分別回收線性化的pGEM-T-Neo/HygPA載體和5’同源臂,經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化 后,挑取有5’同源臂插入的重組子,進(jìn)行酶切和測序鑒定,連接正確的稱為pGEM-T-Neo/ HygPA-5’ 臂。將pGEM-T-Neo/Hyg PA-5,臂載體和打靶載體骨架載體pPGKneoLoxP2PGKDTA小量 提取后,經(jīng)過Not I和Nhe I酶切,分別回收線性化的打靶載體骨架載體和Not 1_5’同源 臂-neo/hyg PA-NheI序列,經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化后,挑取有Not 1-5’同源臂-neo/hyg PA-NheI 序列插入的重組子,進(jìn)行酶切和測序鑒定,連接正確的稱為LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂。將LoxPneo/hygPGKDTA-5 ’臂質(zhì)粒和pGEM_T_3,同源臂質(zhì)粒小量提取后,經(jīng)過Nhe I和Sal I酶切,分別回收線性化的LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂載體和3’同源臂,經(jīng)過連接、 轉(zhuǎn)化后,挑取有3’同源臂插入的重組子,進(jìn)行酶切和測序鑒定,請參閱圖4和圖5,連接正確 的稱為 LoxPneo/hyg-PRNP K0,大小分別為 15,113bp 和 15,472bp。實(shí)施例2牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選本發(fā)明要對牛PRNP基因的兩個等位基因進(jìn)行敲除,對第一個等位基因敲除用的 是脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,對第二個等位基因進(jìn)行敲除用的是Lonza公司的細(xì)胞核電轉(zhuǎn)染 法。2. 1牛PRNP第一個等位基因的敲除接種牛胎兒成纖維細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70-80%匯合度時,按照說明書要求,用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體將經(jīng)過Not I 線性化的PRNP基因打靶載體LoxPneo-PRNP KO轉(zhuǎn)入細(xì)胞中;細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后,胰酶消化法將細(xì)胞從6孔板中消化下來,每IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿接 4X105個細(xì)胞,并用G418濃度為600 μ g/mL的細(xì)胞培養(yǎng)基篩選細(xì)胞7_9d ;用細(xì)胞克隆環(huán)將具有G418抗性的細(xì)胞克隆點(diǎn)挑選出來接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中,待細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合,胰酶消化后,一部分液氮凍存,另一部分繼續(xù)培養(yǎng)至長滿6孔 板的一孔,提取細(xì)胞基因組,采用PCR擴(kuò)增的方法對細(xì)胞克隆點(diǎn)進(jìn)行鑒定。得到的敲除細(xì)胞 命名為ko-E細(xì)胞。2. 2牛PRNP第二個等位基因的敲除將T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至80%匯合的ko-E細(xì)胞用胰酶消化法消化下來,每 IX 107個細(xì)胞用ImL Lonza細(xì)胞核轉(zhuǎn)液重懸,向細(xì)胞重懸液中加入80 μ g Not I線性化的 LoxPhyg-PRNP-KO無啟動子打靶載體,充分混勻后,每個電擊杯中加入100 μ L細(xì)胞-載體混 合液,按照NucleofectorTM細(xì)胞核電擊儀程序Τ036電擊;電擊結(jié)束后,每個電擊杯中的細(xì)胞接種至一個60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,用含有10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,胰酶消化法將60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化下來,每個 60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞經(jīng)過稀釋后接種到6個IOOmrn細(xì)胞培養(yǎng)皿中,并用潮霉素B終濃 度為150 μ g/mL的細(xì)胞培養(yǎng)基篩選細(xì)胞7-9d ;用細(xì)胞克隆環(huán)將具有潮霉素B抗性的細(xì)胞克隆點(diǎn)挑選出來接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng) 板中待細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合,胰酶消化后,一部分液氮凍存,另一部分繼續(xù)培養(yǎng)至長滿6孔 板的一孔,提取細(xì)胞基因組,采用PCR擴(kuò)增的方法對細(xì)胞克隆點(diǎn)進(jìn)行鑒定。經(jīng)過PCR鑒定,獲得的2個具有G418抗性的細(xì)胞克隆點(diǎn)均為PRNP+/-細(xì)胞, LoxPneo-PRNP KO基因打靶載體富集基因打靶的效率為100% ;獲得的5個具有潮霉素B抗 性的細(xì)胞克隆點(diǎn)其中有3個為PRNP-/-細(xì)胞,LoxPhyg-PRNP KO基因打靶載體富集基因打 靶的效率為60%。本發(fā)明與以往研究最大的不同是,通過提高基因打靶載體的富集效率從而簡化了 基因打靶的細(xì)胞篩選與鑒定工作。在本發(fā)明中,細(xì)胞經(jīng)過打靶載體轉(zhuǎn)染和藥物篩選后,一個 IOOmrn細(xì)胞培養(yǎng)皿中最多可以獲得2個細(xì)胞克隆點(diǎn),很方便就可以把它挑取出來繼續(xù)培養(yǎng), 之后的鑒定工作證明這幾個細(xì)胞克隆點(diǎn)往往就是經(jīng)過基因打靶的細(xì)胞,幾乎100%排除了 隨機(jī)整合的細(xì)胞。此外,本發(fā)明構(gòu)建的無啟動子打靶載體上的真核抗性基因都是被IoxP位 點(diǎn)錨定的,可以通過Cre/loxP系統(tǒng)對其進(jìn)行刪除,這種策略在以往的無啟動子打靶載體構(gòu) 建中很少有人報(bào)道。雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。參考文獻(xiàn)K. J. McCreath, J. Howcroft, K. H. S. Campbell, A. CoIman, Α. Ε. Schnieke & Α. J. Kind, Production ofgene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells, Nature,2000,405 (29) :1066-1069C. Denning, S.Burl, A. Ainslie, J.Bracken, et al.Deletion of the α (1,3)galactosyl transferase (GGTAl) geneandthe prion protein (PrP) gene in sheep. Nature biotechnology, 2001,19 :559_562.Guohua Yu, Jianquan Chen, et al. Functional disruption of the prion proteingene in cloned goats. Journal ofgeneral virology,2006,87 :1019-1027.Caihong Zhu, Bei Li, et al. Production of Prnp-/~goats by gene targeting in adult fibroblasts. 2008, Transgenicresearch,Yoshimi Kuroiwa, et al. 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      <211>36
      <212>DNA
      <213>人工序列
      <400>5
      tctcgtacgc caccatggga tcggccattg aacaag36
      <210>6
      <211>42
      <212>DNA
      <213>人工序列
      <400>6
      taagctagcg gacctaataa cttcgtataa tgtatgctat ac42
      <210>7
      <211>36
      <212>DNA
      <213>人工序列
      <400>7
      tctcgtacgc caccatggat agatecggaa agcctg36
      <210>8
      <211>65
      <212>DNA
      <213>人工序列
      <400>8
      taagctagca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatctagaat gcagtgaaaa60
      aaatg65
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      權(quán)利要求
      一種基因敲除打靶載體,其包括正篩選基因,在正篩選基因的兩端具有重組酶識別序列,所述重組酶識別序列的另一端分別與被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相連,所述兩同源臂的內(nèi)部不具有啟動正篩選基因表達(dá)的啟動子,在所述同源臂的外側(cè)還具有負(fù)篩選基因。
      2.如權(quán)利要求1所述的打靶載體,其特征在于,所述正篩選基因?yàn)榫幋a新霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶、次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或嘌呤 霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
      3.如權(quán)利要求1所述的打靶載體,其特征在于,所述負(fù)篩選基因?yàn)樾叵偃パ鹾塑?,或?編碼次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸腺嘧啶激酶、白喉毒素或單 純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶的基因。
      4.如權(quán)利要求1 3任意一項(xiàng)所述的打靶載體,其特征在于,所述重組酶識別序列為 Cre酶識別序列或FLP酶識別序列。
      5.如權(quán)利要求4所述的打靶載體,其特征在于,所述同源臂為牛PRNP基因的序列。
      6.如權(quán)利要求5所述的打靶載體,其為LoxPneo-PRNPKO或LoxPhyg-PRNP KO0
      7.權(quán)利要求1 6任意一項(xiàng)所述打靶載體在細(xì)胞內(nèi)定點(diǎn)敲除基因中的應(yīng)用。
      8.一種提高基因打靶細(xì)胞富集效率的方法,其特征在于,使用權(quán)利要求1 6任意一項(xiàng) 所述打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過含有與正篩選基因相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基篩選陽性克隆,使陽性 克隆得到富集。
      9.一種敲除牛PRNP基因的方法,其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO之 一的打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用相應(yīng)的藥物篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,再用另一個打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì) 胞并用相應(yīng)的藥物篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
      10.如權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于,使用打靶載體LoxPneo-PRNPKO轉(zhuǎn)染牛成 纖維細(xì)胞,在含有G418的細(xì)胞培養(yǎng)基上篩選得到陽性細(xì)胞克隆,并對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒 定;用LoxPhyg-PRNP KO轉(zhuǎn)染PRNP基因一個等位基因發(fā)生敲除的牛成纖維細(xì)胞,并用含潮 霉素B的細(xì)胞培養(yǎng)基篩選陽性細(xì)胞克隆,并對陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定。
      全文摘要
      本發(fā)明涉及一種基因敲除打靶載體,包括正篩選基因,在正篩選基因的兩端具有重組酶識別序列,該重組酶識別序列的另一端分別與被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相連,所述兩同源臂的內(nèi)部不具有啟動正篩選基因表達(dá)的啟動子,在所述同源臂的外側(cè)還具有負(fù)篩選基因。所述打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過含有與正篩選基因相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基篩選陽性克隆,得到的陽性克隆富集效率高,細(xì)胞篩選方法簡單,不需大量人力物力,極大地方便了后續(xù)的細(xì)胞凍存和鑒定,大大降低了基因打靶的成本。
      文檔編號C12N15/63GK101955961SQ20091008816
      公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
      發(fā)明者丁方榮, 戴蘊(yùn)平, 李寧, 李松, 王少華 申請人:北京濟(jì)福霖生物技術(shù)有限公司
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