一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，屬于真核細(xì)胞水平基 因功能分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建一般需要多步驟進(jìn)行，方法繁瑣。
[0003] 目前商業(yè)化的相似產(chǎn)品主要包括Clontech公司的In-fusion試劑盒與NEB公司 的Gibson組裝試劑盒，兩種產(chǎn)品僅提供連接反應(yīng)體系，用戶需要自己準(zhǔn)備載體體系而且兩 個(gè)公司的反應(yīng)體系存在下列限制：
[0004] 1)需要進(jìn)行長(zhǎng)片段的PCR擴(kuò)增，從而使得最終構(gòu)建的多基因表達(dá)載體容易產(chǎn)生突 變；
[0005] 2)兩種方法均需要額外合成多條引物，并且增加了PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物膠回收等步驟， 既增加了額外費(fèi)用，又較繁瑣；
[0006] 3)兩種方法構(gòu)建的載體需要特異的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，不適用實(shí)驗(yàn)室普通感受 態(tài)細(xì)胞，需要額外進(jìn)行購(gòu)置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種廣泛應(yīng)用于真 核細(xì)胞水平基因功能分析實(shí)驗(yàn)的一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法。
[0008] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0009] -步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0010] 1)構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒：
[0011] 1.1)確定欲過(guò)表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為N，所述的N為大于1的正整數(shù)，下同；；
[0012] 1. 2)將欲過(guò)表達(dá)的N個(gè)基因的⑶S區(qū)按順序分別插入到N個(gè)質(zhì)粒pOE-1、pOE-2直 到pOE-N中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)；
[0013] 1. 3)使用定點(diǎn)突變的方法將基因⑶S中的Bsal位點(diǎn)進(jìn)行突變，同時(shí)保證其所編碼 的氨基酸不變；
[0014] 1.4)使用菌落PCR篩選出陽(yáng)性克隆子并擴(kuò)增；
[0015] 1. 5)分別提取N個(gè)質(zhì)粒，并將質(zhì)粒濃度調(diào)整到200ng/y1;
[0016] 2)構(gòu)建敲低質(zhì)粒：
[0017] 2. 1)確定欲敲低的基因個(gè)數(shù)為N;
[0018] 2. 2)將欲敲低的N個(gè)基因的shRNAoligo按順序分別引入到N個(gè)質(zhì)粒pSH-1、 pSH-2直到pSH-N中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)；
[0019] 2.3)挑選3個(gè)克隆子，并測(cè)序驗(yàn)證，并將質(zhì)粒濃度調(diào)整到200ng/yl;
[0020] 3)構(gòu)建過(guò)表達(dá)和敲低混合質(zhì)粒：
[0021] 3. 1)將欲過(guò)表達(dá)的基因的⑶S或欲敲低的基因的shRNAoligo分別引入pOE質(zhì)粒 和pSH質(zhì)粒中，例如，欲過(guò)表達(dá)第1、3和5號(hào)基因，而欲敲低第2、4和6號(hào)基因，則將第1、3 和5號(hào)基因的⑶S區(qū)域分別引入pOE-1、pOE-3和pOE-5中，而將第2、4和6號(hào)基因的shRNA oligo引入到pSH-2,pSH-4 和pSH-6 中；
[0022] 3. 2)通過(guò)測(cè)序和菌落PCR驗(yàn)證序列的正確性，并將Bsal位點(diǎn)進(jìn)行突變，并將質(zhì)粒 濃度調(diào)整到200ng/y1 ;
[0023] 4)按體積比，在離心管中順序加入如下樣品：
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒： I. 1)確定欲過(guò)表達(dá)的基因個(gè)數(shù)為N ; 1. 2)將欲過(guò)表達(dá)的N個(gè)基因的⑶S區(qū)按順序分別插入到N個(gè)質(zhì)粒pOE-1、pOE-2直到 pOE-N中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)； 1. 3)使用定點(diǎn)突變的方法將基因 CDS中的BsaI位點(diǎn)進(jìn)行突變，同時(shí)保證其所編碼的氨 基酸不變； 1. 4)使用菌落PCR篩選出陽(yáng)性克隆子并擴(kuò)增； 1.5)分別提取N個(gè)質(zhì)粒； 2) 構(gòu)建敲低質(zhì)粒： 2. 1)確定欲敲低的基因個(gè)數(shù)為N ; 2. 2)將欲敲低的N個(gè)基因的shRNA oligo按順序分別引入到N個(gè)質(zhì)粒pSH-1、pSH-2直 到pSH-N中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)； 2. 3)挑選3個(gè)克隆子，并測(cè)序驗(yàn)證； 3) 構(gòu)建過(guò)表達(dá)和敲低混合質(zhì)粒： 3. 1)將欲過(guò)表達(dá)的基因的⑶S或欲敲低的基因的shRNA oligo分別引入pOE質(zhì)粒和 pSH質(zhì)粒中； 3. 2)通過(guò)測(cè)序和菌落PCR驗(yàn)證序列的正確性，并將BsaI位點(diǎn)進(jìn)行突變； 所述的N為大于1的正整數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，其特征在于，待 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、敲低質(zhì)粒或過(guò)表達(dá)和敲低混合質(zhì)粒構(gòu)建后，進(jìn)行以下步驟： 4) 按體積比，在離心管中順序加入如下樣品：
5) 將步驟4)混合體系混勻后置于PCR儀中，進(jìn)行加熱反應(yīng)； 6) 反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase，其中，反應(yīng)產(chǎn)物、ATP與 PlasmidSafe DNase 體積比為 16 : 2 : 2; 7) 步驟6)所得體系在37°C條件下孵育，然后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布 于含有IPTG和X-gal的kana平板上，37°C孵育過(guò)夜； 8) 第二天，挑取3個(gè)藍(lán)色菌落進(jìn)行擴(kuò)增； 9)第二天，提取質(zhì)粒并鑒定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，其特征在于， 所述的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、敲低質(zhì)?；蜻^(guò)表達(dá)和敲低混合質(zhì)粒提取后，將質(zhì)粒濃度調(diào)整到200ng/ μ 1〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，其特征在于，所 述的pDV-N質(zhì)粒濃度為25ng/ μ 1，所述的ATP濃度為10mM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，其特征在于，步 驟5)中，進(jìn)行加熱反應(yīng)的程序?yàn)椋?37°C加熱5min，然后20°C加熱5min，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)后，再繼續(xù)37°C加熱5min，之后升 溫到80°C加熱20min。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一步式真核細(xì)胞多基因修飾載體構(gòu)建方法，首先應(yīng)確定欲修飾的基因數(shù)目N，然后將各個(gè)基因的CDS區(qū)分別引入pOE-1至pOE-N中，同時(shí)也可以將每個(gè)基因?qū)?yīng)的shRNA序列分別引入pSH-1至pSH-N中。通過(guò)將pOE-1至pOE-N和pDV-N加入同一個(gè)反應(yīng)體系中，即可一步式構(gòu)建出N個(gè)基因串聯(lián)過(guò)表達(dá)的最終質(zhì)粒；或者將pSH-1至pSH-N和pDV-N加入同一個(gè)反應(yīng)體系中，即可一步式構(gòu)建出N個(gè)基因同時(shí)knock-down的最終質(zhì)粒；同樣的，也可以選擇其中幾個(gè)基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和另外基因的knock-down質(zhì)粒和pDV-N加入同一個(gè)反應(yīng)體系中，即可一步式構(gòu)建出既含有多個(gè)基因過(guò)表達(dá)，同時(shí)將另一些基因knock-down的最終載體。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的構(gòu)建過(guò)程一步式，過(guò)程簡(jiǎn)便，效率高，同時(shí)可對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行任意組合。
【IPC分類】C12N15-79, C12N15-66
【公開號(hào)】CN104531749
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410785444
【發(fā)明人】彭魯英, 劉暢, 李麗, 康志騫, 王鐸
【申請(qǐng)人】同濟(jì)大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日