專利名稱:中國(guó)冬蟲(chóng)夏草真菌及其人工培養(yǎng)方法
本發(fā)明的目的在于解決中國(guó)冬蟲(chóng)夏草的人工培養(yǎng)問(wèn)題。
中國(guó)冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps Sinensis〔Berk〕Sacc)是一種名貴的野生藥用和食用菌類植物。它的純培養(yǎng)真菌從未被真正的分離到。本發(fā)明得到的這一微生物新種的分生孢子世代分類上屬半知菌綱(Fungi Impergecti)從梗孢目(Moniliales)、從梗孢科(Moniliaceae)、頭孢子菌屬(Cephalosporium)定名為冬蟲(chóng)夏草頭孢菌”學(xué)名Cephalospores Dongchongxiacae SP.nev冬蟲(chóng)夏草屬(Cordyceps)在全世界已發(fā)現(xiàn)並鑒定的種有三百多個(gè)，但對(duì)生長(zhǎng)在青藏高原的中國(guó)冬蟲(chóng)夏草雖在一百多年前就被命名為C.Sinensis(Berk)Sacc，但其真菌因未被真正分離倒，使其分生子世代(無(wú)性世代)的分類地位一直沒(méi)有得到解決。國(guó)內(nèi)外的許多研究都把分離到的雜菌或冬蟲(chóng)夏草屬的其它種，誤認(rèn)為是中國(guó)冬蟲(chóng)夏草真菌。本發(fā)明澄清了這一錯(cuò)誤。
本發(fā)明在獲得真正的中國(guó)冬蟲(chóng)夏草的同時(shí)，研究出了它的人工培養(yǎng)方法。
其菌種的分離有兩種方法一是組織分離法采集未成熟的新鮮冬蟲(chóng)夏草(最好是子座還未長(zhǎng)出地面的)，洗凈，用無(wú)菌水多次沖洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分鐘，用滅菌蒸溜水洗去升汞，在無(wú)菌條件下，切去外皮，避開(kāi)腸道，切取白凈組織，剪碎，接于分離培養(yǎng)基表面，置于5～20℃溫度條件下培養(yǎng)，此法簡(jiǎn)單易行，如材料不理想，培養(yǎng)溫度不適宜或消毒不徹底，容易長(zhǎng)出其它共生菌或互生菌。
一種是子囊孢子培養(yǎng)法將尚未成熟的野生天然蟲(chóng)草移栽到有保護(hù)條件圃中，用消毒紙袋套在它的子座上，使彈出的子囊孢子附著在紙袋上，收取紙袋陰干，放在冰箱中備用。凈化時(shí)將附有子囊孢子的紙袋浸于土壤浸出液中，浸透后用小刀將子囊孢子刮下，收集于離心管中，離心分離，棄去上部清液，用土壤浸出液反復(fù)洗滌，再用蔗糖溶液洗滌，反復(fù)離心分離，收集浮于液面的子囊孢子，再用土壤浸出液洗滌，放入冰箱中備用。萌發(fā)時(shí)取凈化的子囊孢子少許，放入含慶大霉素的土壤浸出液中，室溫培養(yǎng)三到六天，子囊孢子即可萌發(fā)，用滅菌吸管吸取已萌發(fā)的子囊孢子稀懸液，滴在瓊脂平板上，在顯微鏡下挑取單個(gè)萌發(fā)孢子，接種在分離培養(yǎng)基上室溫培養(yǎng)，此法麻煩，初生長(zhǎng)緩慢，但可靠性高。
上述兩種方法使用的分離培養(yǎng)基最好的配方是葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克，硫酸鎂0.5克、磷酸二氫鉀1克，維生素液20毫升、瓊脂20克、蒸溜水1000毫升，最好再加20%蟲(chóng)草蝙蝠蛾幼蟲(chóng)浸出液。
新鮮組織塊培養(yǎng)接種一周后，周圍長(zhǎng)出細(xì)小菌絲，兩個(gè)月后形成菌落三到四個(gè)月菌落直徑可達(dá)1～2厘米，凈化子囊孢子培養(yǎng)接種10天后，孢子芽管伸長(zhǎng)、分枝，形成菌絲，兩個(gè)月菌落直徑2～6毫米，三個(gè)月可見(jiàn)很短的灰白色氣中菌絲，四個(gè)月菌落直徑達(dá)1～2厘米，並有棕黑色色素?cái)U(kuò)散于培養(yǎng)基中。
將上述方法獲得的蟲(chóng)草真菌，接種于特殊培養(yǎng)基上(編號(hào)為S31)培養(yǎng)基配方為肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母1克、葡萄糖30克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0.2克、瓊脂18克、核酸0.5克牛奶200毫升、蒸溜水400毫升，5～20℃溫箱中培養(yǎng)一段時(shí)間長(zhǎng)好后，移入5℃左右冰箱中，四個(gè)月后可看到小子座長(zhǎng)出，移出室溫培養(yǎng)一、二個(gè)月后小子座可長(zhǎng)到2～3厘米，顏色、形態(tài)與天然蟲(chóng)草子座基本一樣。將上述培養(yǎng)出的子座，用黑光燈照射，彈射出的子囊孢子的形態(tài)，大小與天然蟲(chóng)草的子囊孢子完全一樣。
還可采用液體發(fā)酵方法加快菌絲的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基有蠶蛹培養(yǎng)基(蠶蛹粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀和水);肝湯培養(yǎng)基(肝湯、洋芋湯、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、復(fù)合維生素B和水)等。獲得的人工蟲(chóng)草菌絲經(jīng)藥理藥化對(duì)比試驗(yàn)和天然蟲(chóng)草基本一樣。
中國(guó)冬蟲(chóng)夏草真菌菌種的鑒別，可從菌落形態(tài)、培養(yǎng)基和基中菌絲顏色，分生孢子的形態(tài)、顏色、大小等方面觀察，在不同培養(yǎng)基中菌絲形態(tài)不同，一種短小，分枝較小;一種為絨毛狀，有較長(zhǎng)的白色菌絲，呈不規(guī)則的樹(shù)枝狀，它們形成的菌落凸起，最初表面平滑堅(jiān)硬，后變皺折不平，顏色從灰白轉(zhuǎn)向棕色，氣中菌絲極短，基中菌絲棕黑色，並有棕黑色素在培養(yǎng)基中擴(kuò)散，而其它雜菌底色多數(shù)為黃色、紅色或無(wú)色，菌絲在兩個(gè)月以上長(zhǎng)出分生孢子，單生無(wú)色，或雙生、數(shù)個(gè)直至十多個(gè)呈頭狀生長(zhǎng)，分生孢子是橢園形，其梗往往呈直角或銳角生長(zhǎng)在菌絲上，呈細(xì)長(zhǎng)瓶狀，一般不分枝，也有少數(shù)2～5個(gè)分枝。
上述方法的一個(gè)實(shí)例是從化隆縣挖來(lái)的新鮮蟲(chóng)草一株，洗凈，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，放入0.1%的升汞液中消毒5分鐘，用無(wú)菌水洗去升汞，在無(wú)菌條件下，切取內(nèi)部白色組織。剪碎。接種在分離培養(yǎng)基表面，放在5～20℃溫箱中一周后長(zhǎng)出了菌絲，兩個(gè)月后形成凸起硬殼的菌落。經(jīng)擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)后將其移入前述編號(hào)為S31生長(zhǎng)子座的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，先在5～20℃溫箱中培養(yǎng)一個(gè)月，然后移入5℃左右冰箱中，四個(gè)月后開(kāi)始有尖細(xì)的子座長(zhǎng)出。再移到有散射陽(yáng)光的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上繼續(xù)培養(yǎng)，一兩個(gè)月后，子座可達(dá)2～3厘米長(zhǎng)，顏色、形態(tài)與天然蟲(chóng)草的子座基本一樣，將成熟的子座用20瓦黑光燈間歇照射，個(gè)別子座彈射出了子囊孢子，經(jīng)鑒別，其形態(tài)、大小與天然生長(zhǎng)的完全一樣。
權(quán)利要求
1.中國(guó)冬蟲(chóng)夏草(簡(jiǎn)稱蟲(chóng)草)是一種藥用和食用的珍貴的菌類植物，目前世界上發(fā)現(xiàn)並鑒定的蟲(chóng)草真菌有三百多個(gè)種。中國(guó)冬蟲(chóng)夏草真菌是上述三百多個(gè)種其中的一個(gè)種，為頭孢菌屬，其特征在于它是以天然蟲(chóng)草組織或孢子為接種材料，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)出來(lái)的蟲(chóng)草真菌。
2.如權(quán)利要求
1所述的蟲(chóng)草真菌，其特征在于真菌菌絲在不同培養(yǎng)基中的形態(tài)不同，一種短小、分枝較少;一種為絨毛狀，有較長(zhǎng)白色菌絲，有隔呈不規(guī)則的樹(shù)枝狀。形成的菌落凸起，最初表面平滑堅(jiān)硬，后變皺折不平，顏色從灰白轉(zhuǎn)向棕色，並有棕黑色素的擴(kuò)散。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的蟲(chóng)草真菌，其特征在于真菌菌絲兩個(gè)月以上長(zhǎng)出分生孢子，單生無(wú)色或雙生、數(shù)個(gè)直至十多個(gè)呈頭狀生長(zhǎng)，為長(zhǎng)園形，其柄不規(guī)則的生長(zhǎng)在菌絲上，呈細(xì)長(zhǎng)瓶狀，一般不分枝，也有少數(shù)2～5個(gè)分枝。
4.蟲(chóng)草屬的其他種，目前已有將其菌接種于糖類、蛋白質(zhì)、維生素、核酸等並添加谷物為基質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后將固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出來(lái)的菌絲移入糖類，蛋白質(zhì)、維生素、核酸等並添加氨基酸以水為基質(zhì)的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，形成菌座的人工培養(yǎng)方法。中國(guó)冬蟲(chóng)夏草真菌的人工培養(yǎng)方法，其特征在于以天然蟲(chóng)草組織或孢子為材料，接種于葡萄糖、蛋白胨為主的分離培養(yǎng)基上，溫度在5～～20℃范圍內(nèi)，培養(yǎng)一～二個(gè)月，將純分離物轉(zhuǎn)接入特殊培養(yǎng)基中，仍在5～20℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，然后移入5℃左右的冰箱中，四個(gè)月后有子座原基形成待長(zhǎng)到1～2厘米后，再移到有散射陽(yáng)光的室溫下繼續(xù)培養(yǎng)一～兩個(gè)月，長(zhǎng)成與天然蟲(chóng)草形態(tài)，顏色一樣的子座。
5.如權(quán)利要求
4所述蟲(chóng)草真菌的人工培養(yǎng)方法，其特征在于分離培養(yǎng)基的最佳配方是葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克、硫酸鎂0.5克、磷酸二氫鉀1克、維生素20毫升、瓊脂20克、蒸溜水1000毫升、蟲(chóng)草蝙蝠蛾幼蟲(chóng)浸出液若干。
6.如權(quán)利要求
4所述蟲(chóng)草真菌的人工培養(yǎng)方法，其特征在于特殊培養(yǎng)基的配方是肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母膏1克、葡萄糖30克、磷酸二氫鉀1克、硫酸鎂0.2克、瓊脂18克、核酸0.5克、牛奶200毫升、蒸溜水400毫升。
專利摘要
中國(guó)冬蟲(chóng)夏草是一種珍貴的野生藥用和食用菌類植物。本發(fā)明從野生天然蟲(chóng)草上采用組織培養(yǎng)和子囊孢子培養(yǎng)的不同方法，獲得與天然蟲(chóng)草性質(zhì)形狀一樣的蟲(chóng)草真菌。在無(wú)菌器皿中人工培養(yǎng)，能長(zhǎng)出與天然蟲(chóng)草一樣的子座及與天然蟲(chóng)草完全一樣的子囊孢子。從而證實(shí)分離到的是真正的中國(guó)冬蟲(chóng)夏草C.Sinensis真菌。人工蟲(chóng)草菌絲經(jīng)藥理藥化對(duì)比試驗(yàn)與天然蟲(chóng)草基本一樣，為人工培育和廣泛應(yīng)用提供了有效的方法。
文檔編號(hào)C12N3/00GK85101971SQ85101971
公開(kāi)日1987年3月4日 申請(qǐng)日期1985年4月1日
發(fā)明者沈南英, 張生民, 曾璐, 張顯恥, 魏世錄 申請(qǐng)人:青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan