專利名稱：中國被毛孢無性繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及--種無性繁殖方法，特別涉及一種中國被毛孢無性繁殖方法。所述的中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu,Guo,YuetZeng)異名為冬 蟲夏草真菌頭孢子菌屬菌種。
背景技術(shù)：
自然界生長的冬蟲夏草的生長過程，實(shí)際上是蝙蝠蛾幼蟲在進(jìn) 食過程中被作為真菌的被毛孢感染，被毛孢利用蝙蝠蛾幼蟲作營養(yǎng)基生長，直 至幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)被消耗殆盡，在幼蟲的頭部形成菌體的集合，稱為子座，頂 端產(chǎn)生孢子，成熟后再崩發(fā)，再感染，周而復(fù)始，完成被毛孢有性繁殖的全部 過程。嚴(yán)格意義上，冬蟲夏草既不是蟲也不是草，是昆蟲幼蟲與真菌被毛孢的 結(jié)合體。完全模仿自然界冬蟲夏草的有性繁殖規(guī)律來培養(yǎng)被毛孢，目前在技術(shù)上還 有相當(dāng)大的困難，并受生產(chǎn)成本的制約。目前生產(chǎn)領(lǐng)域只有發(fā)酵的菌絲體作為 冬蟲夏草替代品。而發(fā)酵的菌絲體無論在生長形態(tài)、細(xì)胞組織、活性組分含量 還是藥用價(jià)值方面與天然冬蟲夏草都有很大的差別。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足，而提供一種中國 被毛孢無性繁殖方法，所要解決的技術(shù)問題是第一、利用真菌被毛孢單孢分 裂繁殖規(guī)律，采用無性繁殖方法培養(yǎng)獲取作為天然冬蟲夏草替代品的被毛孢有 性特征的菌體組織。第二、通過將昆蟲蛋白、動(dòng)物蛋白、海洋生物蛋白和植物 蛋白按照特定比例組合在一起，并通過獨(dú)特的加工方法，制備出適合被毛孢快 速生長的優(yōu)質(zhì)低成本多元培養(yǎng)基。第三、提供一種菌種培養(yǎng)專用透氣瓶蓋，不
僅能夠?qū)崿F(xiàn)養(yǎng)殖瓶內(nèi)自由水以水汽形式有序排出，而且有效防止霉菌侵入。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于在蒸汽滅菌后的玻璃瓶內(nèi)用手 術(shù)刀將菌體組織切碎；接種在玻璃瓶內(nèi)的培養(yǎng)基表面；在玻璃瓶口蓋上透氣瓶 蓋；將蓋有透氣瓶蓋的玻璃瓶放置在養(yǎng)殖區(qū)，直至成熟；其中，培養(yǎng)基及手術(shù)刀具的滅菌溫度110 12rC，滅菌時(shí)間25 30分鐘； 養(yǎng)殖區(qū)空氣凈化度30萬級，室內(nèi)溫度10 18。C，室內(nèi)濕度RH 40% 550/0;其中，所述的培養(yǎng)基為每100kg培養(yǎng)基中含有蠶蛹7 9kg，去殼去皮扇 貝肉3 5kg，新鮮牛肉1.5 2.5kg，新鮮牛骨4 6kg，花生米0.4 0.6kg，鮮 牛奶4 6kg，大豆蛋白胨0.8 1.2kg，瓊脂1.0 1.4kg，磷酸二氫鉀40 60g， 硫酸鎂15 25g，余量為水。環(huán)境濕度的控制是本發(fā)明的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，濕度高于朋55%容易滋生霉菌， 低于RH40。/。則導(dǎo)致培養(yǎng)基水分過度揮發(fā)。本發(fā)明無性繁殖方法所培養(yǎng)的被毛孢，與自然條件生長的冬蟲夏草以及發(fā) 酵法制得菌體相比較(1)、肉眼觀察干品比對用發(fā)酵技術(shù)獲得的菌體是灰白 色狀態(tài)組織，比重較輕。用本發(fā)明方法獲得的菌體為圓形，堅(jiān)硬，表面凸起不 平，黃棕色，比重較大，與天然蟲草子座的組織細(xì)胞形態(tài)基本相同。(2)、經(jīng)中 國中醫(yī)研究院中藥研究所檢驗(yàn)，有效成分含量本發(fā)明菌體〉天然蟲草〉發(fā)酵菌絲。經(jīng)中國科學(xué)院微生物研究所檢測，本發(fā)明中國被毛孢菌體組織性狀穩(wěn)定，具備有性繁殖特征。(3)、轉(zhuǎn)種觀察將生長到4 5個(gè)月左右的被毛孢菌體連瓶倒置于裝有培養(yǎng)基的玻璃瓶上，瓶口與瓶口連接處作無菌處理連接封閉。一個(gè)月后，五倍放大鏡觀察，培養(yǎng)基表面分布極少圓點(diǎn)白色的細(xì)胞組織，2 3個(gè) 月培養(yǎng)基表面布滿白色半透明①2 3mm圓形，中間凹陷并伴生短絨毛狀、有
立肉芽狀態(tài)細(xì)胞組織，隨后生長速度加快。有極少部分會(huì)生出1 2枝與天然蟲草子座形態(tài)相同假性子座，但長勢較弱，高約20 30mm，粗約^2mra，生長時(shí)間 短，極易倒?fàn)?，倒?fàn)詈笈c菌體組織生長在一起，無痕跡，取后曬干后極脆，長 至12 13個(gè)月后，由白色、半透明狀變成黃色、淺棕色，成熟。與無性繁殖的 菌體形態(tài)無明顯差別。觀察表明，無性繁殖被毛孢仍具有性繁殖記憶特征。本發(fā)明的培養(yǎng)基及其制備方法的積極效果在于(1)、多年實(shí)踐證明，本發(fā) 明的培養(yǎng)基能夠滿足被毛孢細(xì)胞快速分裂生長所需的必要氨基酸和其他營養(yǎng)元 素。每100ml培養(yǎng)基可可生產(chǎn)5g被毛孢菌體。(2)、采用本發(fā)明培養(yǎng)基的制備 方法，保證了制得培養(yǎng)基為可被直接吸收的小分子溶液，縮短了酶分解時(shí)間， 提高了被毛孢生長速度。(3)、培養(yǎng)基的生產(chǎn)周期短，制造成本低，經(jīng)濟(jì)性好， 適合產(chǎn)業(yè)化大面積推廣利用。其中，作為海洋生物蛋白的扇貝肉作用尤其突出，如果采用其他蛋白代替， 將無法實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。另外，各種組分的配比也是本發(fā)明的關(guān)鍵，是經(jīng)過 多年實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)。制備方法中的工藝步驟，工藝條件也是本發(fā)明的關(guān)鍵技 術(shù)，也是經(jīng)過多年探索積累尋找到的，如果有所變動(dòng)，將直接影響培養(yǎng)基的使 用性能。牛骨的用量比例較常規(guī)高，這是多年研究、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的，采用本比例 明顯促進(jìn)被毛孢組織細(xì)胞的分裂生長，這也是本發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)。本發(fā)明的透氣瓶蓋的積極效果在于(1)、透氣管設(shè)置在瓶蓋側(cè)面，并在 透氣管外端通過副蓋安裝有濾紙，不僅可以保證了養(yǎng)殖瓶內(nèi)自由水以水汽形式 有序排出，而且有效防止霉菌感染；另一方面，由于瓶蓋頂部無障礙設(shè)計(jì)，養(yǎng) 殖瓶可以縱向多層擺放，有效利用了空間，節(jié)省了占地面積。(2)、在滅菌過程 中，上述透氣管能迅速起到增壓和減壓作用，從而縮短滅菌時(shí)間。(3)、在填充 培養(yǎng)基，尤其在接種過程中，能縮短與外界空氣的接觸時(shí)間，減少霉菌感染機(jī)
會(huì)，操作方便。(4)、即使該透氣瓶蓋被污染，清洗后更換濾紙可重復(fù)使用，降 低了物耗，節(jié)約了生產(chǎn)成本。(5)、透氣管設(shè)有足夠長度，即使霉菌孢子透過濾紙也很難感染瓶內(nèi)菌種。(6)、透氣管腔縱截面積經(jīng)過科學(xué)計(jì)算設(shè)計(jì)，使得自由水通過量被控制在合理的范圍內(nèi)，不會(huì)因?yàn)橥ㄟ^量過大造成培養(yǎng)基過多、過快脫水，或者因?yàn)橥ㄟ^量過小導(dǎo)致瓶內(nèi)積水，影響菌種的正常生長。(7)、瓶蓋封 閉段下沿預(yù)留有用于緊密配合插入瓶口內(nèi)的探入段，避免了滅菌時(shí)產(chǎn)生的汽化 水從瓶口與瓶蓋絲扣之間的縫隙流出產(chǎn)生霉菌滋生載體的問題。


圖1是本發(fā)明透氣瓶蓋的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是被毛孢表面生長狀態(tài)圖片。圖3是被毛孢鮮活菌體尺度圖片。圖4是被毛孢鮮活菌體高度圖片。圖5是被毛孢正常生長狀態(tài)圖片。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。 一、中國被毛孢無性繁殖首先從天然冬蟲夏草中分離出菌體組織，或者取利用本方法繁殖的菌體組 織。在滅菌后的玻璃瓶內(nèi)用手術(shù)刀將菌體組織切碎，越細(xì)越好。將細(xì)碎的菌體 組織接種在玻璃瓶內(nèi)的培養(yǎng)基表面，在玻璃瓶口蓋上透氣瓶蓋；將蓋有透氣瓶 蓋的玻璃瓶放置在養(yǎng)殖區(qū)，直至成熟。其中，培養(yǎng)基及手術(shù)刀具的滅菌溫度110 12rC，滅菌時(shí)間25 30分鐘。 培養(yǎng)基滅菌后自然冷卻12小時(shí)以上，置放區(qū)溫度18。C以下。養(yǎng)殖區(qū)空氣凈化度30萬級，室內(nèi)溫度10 18。C，室內(nèi)濕度RH 40% 55%;接種量為每瓶20mn^左右。接種瓶為50ml和100ml PDA培養(yǎng)基兩種裝
生長期分為三個(gè)階段。第一階段約為30天，五倍放大鏡觀察，在PDA培養(yǎng)基表面與菌種的接觸面縫隙生成乳白色、半透明細(xì)胞組織，細(xì)胞組織表面伴 生有白色短絨毛，局部生長直立、分枝、肉芽狀組織。第二階段約為120天的快速生長期，細(xì)胞組織分裂造成擠壓向上隆起，有 肉芽狀組織分裂最快，隆起表面呈高低不平，細(xì)胞組織仍是白色、半透明，厚 度約10 15mm，個(gè)別增厚至25mm以上。顯微鏡觀察，在頂部表面有囊殼小空腔， 腔內(nèi)有產(chǎn)孢細(xì)胞形成。切片觀察，細(xì)胞組織呈微黃色、半透明。有較濃藥香味， 內(nèi)部有小孔洞，洞壁有白色短絨毛，導(dǎo)管細(xì)胞周圍孔洞排列。第三階段為成熟采集期，菌體表面細(xì)胞組織由白色半透明逐漸變黃、黃棕 色，培養(yǎng)基剩余不多，并開裂、干縮，沒有可利用價(jià)值。原菌種碎屑變成黑棕 色，木質(zhì)化，無再生跡象，并與新生成的細(xì)胞組織在一起。采集后菌體有粘連 部分培養(yǎng)基，用0.2MPa壓縮空氣吹掉，集中干燥，真空包裝，即成初級產(chǎn)品。圖2顯示成品被毛孢的組織形態(tài)。圖3顯示菌體與培養(yǎng)基的比例。圖4顯示菌體的實(shí)際高度。圖5顯示被毛孢的正常生長狀態(tài)。二、培養(yǎng)基制備實(shí)例實(shí)例1按照制備100kg培養(yǎng)基，(1) 、將去殼去皮扇貝肉4kg用清水浸泡48小時(shí)，再換水6次以上脫鹽， 最后磨制成漿，作A組分；(2) 、將花生米0.5kg用水浸泡10小時(shí)，然后磨漿制成B組分；(3) 、新鮮牛肉2kg磨漿制成C組分；(4) 、蠶蛹8kg磨漿、去皮制成D組分；(5) 、將A、 B、 C、 D組分混合，加水補(bǔ)充到80kg，煮開，文火熬制30分鐘，沉淀、濾除渣子，制成E組分；(6) 、將新鮮牛骨5kg用高壓鍋煮開后熬制30分鐘，沉淀、濾除渣子，制成F組分；(7) 、將E組分和F組分混勻，加入鮮牛奶5kg，大豆蛋白胨lkg，瓊脂1.2kg， 磷酸二氫鉀50g，硫酸鎂20g，并加水補(bǔ)充到100kg， 一并熬開，裝瓶，滅菌， 冷卻備接種用，其中滅菌溫度115。C，滅菌時(shí)間30分鐘。實(shí)例2按照制備100kg培養(yǎng)基，(1) 、將去殼去皮扇貝肉3kg用清水浸泡36小時(shí)，再換水6次以上脫鹽， 最后磨制成漿，作A組分；(2) 、將花生米0.6kg用水浸泡8小時(shí)，然后磨漿制成B組分；(3) 、新鮮牛肉1.5kg磨槳制成C組分；(4) 、蠶蛹9kg磨漿、去皮制成D組分；(5) 、將A、 B、 C、 D組分混合，加水補(bǔ)充到85kg,煮開，文火熬制20分 鐘，沉淀、濾除渣子，制成E組分；(6) 、將新鮮牛骨4kg用高壓鍋煮開后熬制20分鐘，沉淀、濾除渣子，制 成F組分；(7) 、將E組分和F組分混勻，加入鮮牛奶6kg，大豆蛋白胨0.8kg，瓊脂 L4kg，磷酸二氫鉀40g，硫酸鎂15g，并加水補(bǔ)充到100kg， 一并熬開，裝瓶， 火菌，冷卻備接種用，其中滅菌溫度11(TC，滅菌時(shí)間28分鐘。實(shí)例3
按照制備100kg培養(yǎng)基，(1) 、將去殼去皮扇貝肉5kg用清水浸泡60小時(shí)，再換水6次以上脫鹽，最后磨制成漿，作A組分；(2) 、將花生米0.4kg用水浸泡12小時(shí)，然后磨漿制成B組分；(3) 、新鮮牛肉2.5kg磨漿制成C組分；(4) 、蠶蛹7kg磨漿、去皮制成D組分；(5) 、將A、 B、 C、 D組分混合，加水補(bǔ)充到75kg，煮開，文火熬制40分 鐘，沉淀、濾除渣子，制成E組分；(6) 、將新鮮牛骨6kg用高壓鍋煮開后熬制40分鐘，沉淀、濾除渣子，制 成F組分(7) 、將E組分和F組分混勻，加入鮮牛奶4kg，大豆蛋白胨1.2kg，瓊脂 l.Okg，磷酸二氫鉀60g，硫酸鎂25g，并加水補(bǔ)充到100kg， 一并熬開，裝瓶， 滅菌，冷卻備接種用，其中滅菌溫度12rC，滅菌時(shí)間25分鐘。所用的水要求是純凈水，所用各種原料必須保證新鮮，無變質(zhì)跡象。另外， 活蛹優(yōu)于抽絲后的死蛹，死蛹優(yōu)于干蛹。所制備的培養(yǎng)基PH值在5.5 6.5之間。 夏季配制的營養(yǎng)液放置時(shí)間一般不能超過6小時(shí)。 三、透氣瓶蓋具體實(shí)施方式
如圖1所示，本實(shí)施例包括內(nèi)壁帶有與瓶口配合的絲扣的連接段1，在連接 段1上端還有封閉段2，在封閉段2的側(cè)面有一段透氣管4，濾紙5通過副蓋6 固定在所述透氣管4的外口端。封閉段2下端探入到連接段1上端面內(nèi)壁以下，該探入段3外徑與所配套 養(yǎng)殖瓶瓶口內(nèi)徑尺寸相配合。使用時(shí)，該探入段3正好插入到瓶口內(nèi)。
透氣管4的管腔縱截面為圓形。直徑為9毫米或者12毫米，對應(yīng)于50ml 禾口 100ml PDA培養(yǎng)基兩種裝量。
透氣管4的長度一般為16毫米。
權(quán)利要求
1、一種中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于在蒸汽滅菌后的玻璃瓶內(nèi)用手術(shù)刀將菌體組織切碎；接種在玻璃瓶內(nèi)的培養(yǎng)基表面；在玻璃瓶口蓋上透氣瓶蓋；將蓋有透氣瓶蓋的玻璃瓶放置在養(yǎng)殖區(qū)，直至成熟；其中，培養(yǎng)基及手術(shù)刀具的滅菌溫度110～121℃，滅菌時(shí)間25～30分鐘；養(yǎng)殖區(qū)空氣凈化度30萬級，室內(nèi)溫度10～18℃，室內(nèi)濕度RH 40％～55％；其中，所述的培養(yǎng)基為每100kg培養(yǎng)基中含有蠶蛹7～9kg，去殼去皮扇貝肉3～5kg，新鮮牛肉1.5～2.5kg，新鮮牛骨4～6kg，花生米0.4～0.6kg，鮮牛奶4～6kg，大豆蛋白胨0.8～1.2kg，瓊脂1.0～1.4kg，磷酸二氫鉀40～60g，硫酸鎂15～25g，余量為水。
2、如權(quán)利要求l所述的中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基的制備方法為按照制備100kg培養(yǎng)基，(1) 、將去殼去皮扇貝肉用清水浸泡36 60小時(shí)，再換水6次以上脫鹽， 最后磨制成漿，作A組分；(2) 、將花生米用水浸泡8 12小時(shí)，然后磨漿制成B組分；(3) 、新鮮牛肉磨漿制成C組分；(4) 、蠶蛹磨漿、去皮制成D組分；(5) 、將A、 B、 C、 D組分混合，加水補(bǔ)充到75 85kg，煮開，文火熬制 20 40分鐘，沉淀、濾除渣子，制成E組分；(6) 、將新鮮牛骨用高壓鍋煮開后熬制20 40分鐘，沉淀、濾除渣子，制 成F組分；(7) 、將E組分和F組分混勻，加入鮮牛奶，大豆蛋白胨，瓊脂，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，并加入剩余的水， 一并熬開，裝瓶，滅菌，冷卻備接種用，其中滅菌溫度110 121°C，滅菌時(shí)間25 30分鐘。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于所述 透氣瓶蓋包括內(nèi)壁帶有與瓶口配合的絲扣的連接段(1)，在連接段(1)上端還 有封閉段(2)，在封閉段(2)的側(cè)面有一段透氣管(4)，濾紙(5)通過副蓋(6)固定在所述透氣管(4)的外口端。
4、 如權(quán)利要求3所述的中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于封閉段(2) 下端探入到連接段(1)上端面內(nèi)壁以下，該探入段(3)外徑與所配套養(yǎng)殖瓶 瓶口內(nèi)徑尺寸相配合。
5、 如權(quán)利要求3所述的中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于透氣管(4) 的管腔縱截面為圓形，直徑為9毫米或者12毫米；透氣管(4)的長度為14—18 毫米。
全文摘要
本發(fā)明是一種中國被毛孢無性繁殖方法，其特征在于在蒸汽滅菌后的玻璃瓶內(nèi)用手術(shù)刀將菌體組織切碎；接種在玻璃瓶內(nèi)的培養(yǎng)基表面；在玻璃瓶口蓋上透氣瓶蓋；將蓋有透氣瓶蓋的玻璃瓶放置在養(yǎng)殖區(qū)，直至成熟。利用真菌被毛孢單孢分裂繁殖規(guī)律，采用無性繁殖方法成功培養(yǎng)獲取了作為天然冬蟲夏草替代品的被毛孢有性特征的優(yōu)質(zhì)菌體組織。
文檔編號C12N1/14GK101126069SQ20071001681
公開日2008年2月20日 申請日期2007年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日
發(fā)明者姜善清 申請人:姜善清