專利名稱:新抗生素sr-1223的制備方法
本發(fā)明是關(guān)于新抗生素SR-1223及其制備方法。本發(fā)明所述的抗生素是由鏈霉菌屬的抗生素SR-1223生產(chǎn)菌的培養(yǎng)液中分離而得，是一種未見文獻(xiàn)報道的新抗生素。本抗生素SR-1223與本申請相應(yīng)的日本專利申請中的RS-1223是同一物質(zhì)。
近年來，抗生素不僅在醫(yī)藥方面，而且在農(nóng)藥方面也正在被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明者為了尋找出比以往更為有效的新抗生素，從多種土壤中分離出微生物來培養(yǎng)抗生素，然而對這些抗生素分別進(jìn)行精制、鑒定和開發(fā)應(yīng)用。
本發(fā)明者曾從中國土壤中分離而得的土壤放線菌的培養(yǎng)物中提取了多種新抗生素。這次又成功地提取了與上述抗生素相異的一種新抗生素。
本發(fā)明的目的在于提供一種新抗生素，并提供一種從鏈霉菌屬的微生物中分離、制取該抗生素的方法。
使用的微生物用來生產(chǎn)本發(fā)明所述的抗生素SR-1223的微生物是一種屬于鏈霉菌屬的菌種，其具有生產(chǎn)抗生素SR-1223的能力。
鏈霉菌SP·SR-1223(Streptcmyces sp·SR-1223)(以下簡稱為“SR-1223菌株”)就是其中一例。該微生物具有上述特性，適于生產(chǎn)本發(fā)明所述的抗生素SR-1223，因而能有效地使用于本發(fā)明所述的制備方法之中。
同時，上述“SR-1223菌株”的自然及其人工變異菌株也均屬于鏈霉菌屬的菌種，凡具有生產(chǎn)后述抗生素SR-1223能力的微生物均可應(yīng)用本發(fā)明所述的方法。
上述“SR-1223菌株”是從中國浙江省土壤中分離而得的土壤放線菌，已于1986年11月5日寄存在中國微生物菌種保藏管理委員會，其保藏中心登記入冊編號為CGMCC № 0117。
“SR-1223菌株”具有下述性質(zhì)1.形態(tài)特征在含有葡萄糖、酵母浸膏的菌體分析用培養(yǎng)基上培養(yǎng)本菌株，然后進(jìn)行菌體分離干燥，再用6N鹽酸于110℃，加熱水介20小時。用紙層析法檢測細(xì)胞壁的氨基酸組分時，可以發(fā)現(xiàn)L、L-二氨基庚二酸。
本菌株經(jīng)平板培養(yǎng)后呈螺旋性，形成由多個孢子相連的孢子鎖。其在淀粉、酵母瓊脂培養(yǎng)基、淀粉·無機鹽瓊脂培養(yǎng)基上，氣生菌絲生長良好呈灰色狀;在酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基上，可生成黑色素，但可溶性色素的生成并不顯著。碳源糖的利用除山梨糖、山梨醇外，均很良好。從上可見，本菌株屬鏈霉菌屬，其在各種培養(yǎng)基上的性狀如下。
2.在各種培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)于27℃培養(yǎng)三周，顏色按照“顏色名稱描述詞典”(Descri-ptive color names dictionary)記述。
(1)蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基生長 一般氣生菌絲 中等 b灰乳色(oysten white)基內(nèi) 2cb淺米黃色(ivory tint)可溶性色素 無
(2)葡萄糖·天門冬酰氨瓊脂培養(yǎng)基生長 一般氣生菌絲 少量 e灰色(gray)基內(nèi) 3gc亮黃褐色(light tan)可溶性色素 極少 3gc亮黃褐色(light tan)(3)甘油·天門冬酰氨瓊脂培養(yǎng)基生長 良好氣生菌絲 豐富 4gc玫瑰色(rose beige)基內(nèi) 3lg亮褐色(light brown)可溶性色素 極少 3lg亮褐色(light brown)(4)淀粉·無機鹽瓊脂培養(yǎng)基生長 良好氣生菌絲 豐富 5fe死灰色(ash)基內(nèi) 3ec亮米黃色(light beige)可溶性色素 無(5)酪氨酸瓊脂培養(yǎng)基生長 一般氣生菌絲 無基內(nèi) 4Ni栗褐色(chestnut brown)可溶性色素 4Pl深褐色(deep brown)(6)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基生長 一般氣生菌絲 無基內(nèi) 2gc竹色(bamboo)
可溶性色素 無(7)酵母·麥芽瓊脂培養(yǎng)基生長 良好氣生菌絲 幾乎無 e灰色(gray)基內(nèi) 3ie淺黃棕色(cinnamcn)可溶性色素 少量 3lg亮褐色(light brown)(8)麥片瓊脂培養(yǎng)基生長 不良?xì)馍z 少量 3dc自然色(natural)基內(nèi) 2dc自然細(xì)條色(natural string)可溶性色素 無(9)胨·酵母·鐵瓊脂培養(yǎng)基生長 一般氣生菌絲 無基內(nèi) 3ie淺黃棕色(cinnamon)可溶性色素 3ie淺黃棕色(cinnamon)(10)淀粉·酵母瓊脂培養(yǎng)基生長 良好氣生菌絲 豐富 e灰色(gray)基內(nèi) 3ie淺黃棕色(cinnamon)可溶性色素 少量 3lg亮褐色(light brown)3.碳源的利用性(普戈瓊脂培養(yǎng)基)生長狀態(tài)L-阿拉伯糖 +++
D-木糖 +++D-葡萄糖 +++D-果糖 +++蔗糖 +++肌醇 +++L-鼠李糖 +++棉子糖 +++D-甘露醇糖 +++乳糖 ++蜜二糖 ++D-半乳糖 +++L-山梨糖 ±D-麥芽糖 +++D-山梨醇 ±柳醇 +對照 -+++ 生長非常好++ 生長較好+ 生長± 極少量生長- 不生長4.其它生理性質(zhì)(1)合適溫度 25～30℃(2)明膠的液化 陰性
(3)乳的凝固·胨化 陽性(4)淀粉水解 陽性(5)纖維素分介 陰性～擬陽性(6)黑色素的生成 陽性(7)硝酸鹽還原 陽性(8)黃嘌呤溶介 陽性如上所述，本菌種屬灰色鏈霉菌屬。按柏氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊第八版(Bergey′s Manual of Determinative Bacteri-ology 8th edition)分類法，可推斷本菌種屬鏈霉菌屬的Streptomyces griseosporeus、Streptomyces lute-ogriseus或其極近緣菌。
培養(yǎng)及精制方法用鏈霉菌屬的上述抗生素生產(chǎn)菌，通過常規(guī)的抗生素生產(chǎn)方法，可以培養(yǎng)“SR-1223菌株”，并制得本發(fā)明所述的抗生素SR-1223。培養(yǎng)方式既可為液體培養(yǎng)，也可為固體培養(yǎng)。在工業(yè)性生產(chǎn)時，為了有利于培養(yǎng)，宜將上述生產(chǎn)菌的孢子懸浮液或培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)基上，并進(jìn)行通氣攪拌。
對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，可使培養(yǎng)基中含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其它營養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可為胨、大豆粉、肉膏、米糠、麥皮、尿素、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽，以及其它有機或無機含氮化合物。至于其它營養(yǎng)源則可適當(dāng)添加一些無機鹽類。例如食鹽、磷酸鹽類及鉀、鈣、鋅、錳、鐵之類的金屬鹽。必要時也可添加些動、植、礦物油等作為消泡劑。
對溫度、時間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)格的限制，以適于使用菌的生長為準(zhǔn)，并以選擇SR-1223產(chǎn)量最高的條件為好。例如，培養(yǎng)基的PH范圍可為4～9，尤以接近中性為好，培養(yǎng)溫度宜在25～35℃，當(dāng)然這些培養(yǎng)的組份、培養(yǎng)基的氫離子濃度、培養(yǎng)溫度、攪拌條件等均應(yīng)根據(jù)所使用菌株的種類及外部條件等進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)，以獲得最好的效果。
由上述所得的培養(yǎng)物出發(fā)，通過一些適當(dāng)?shù)姆椒ň湍苤频肧R-1223。這是些常用于提取代謝產(chǎn)物的常規(guī)方法。例如，可單獨、組合或反復(fù)利用SR-1223與不純物在溶介度、離子結(jié)合力、吸附親和力及分子量等方面的差別進(jìn)行分離。具體地講SR-1223大部分存在于培養(yǎng)濾液中。將培養(yǎng)液調(diào)整到偏酸性，譬例調(diào)整到PH4.0，再用醋酸乙酯之類的有機溶劑進(jìn)行提取，所得的濃縮油狀物經(jīng)硅膠層析(例如溶劑為氯仿-甲醇)后，收集并濃縮SR-1223活性區(qū)分。然后再經(jīng)過高速液相色譜(例如充填劑為Nucle-osil5C18、展開劑為甲醇-水相中加入1%二乙胺·甲醇)，收集SR-1223的活性峰并調(diào)節(jié)到PH呈酸性(如PH＝4.0)，濃縮后用醋酸乙酯提取、洗凈、再濃縮，即可得到SR-1223的粗粉末。最后再經(jīng)高速液相色譜(如High carbon ODS、溶劑為甲醇-水-1%二乙胺·甲酸)，收集SR-1223活性峰，同上濃縮、提取、洗凈、再濃縮，經(jīng)冷凍干燥后，即可得淡黃色粉末狀的SR-1223純品。
如上所得的SR-1223其理化性質(zhì)及生物性質(zhì)如下形狀淡黃色粉末融點130℃(分解)元素分析碳63.85%、氫8.56%
分子量660(據(jù)SIMS質(zhì)譜)比旋度〔α〕25D+10°(C＝1.0·甲醇)紫外吸收光譜
270(579)(參照圖1)紅外吸收光譜νKBrmaxcm-13400、2900、1755、1700、1570、1450、1370、1270、1170、1030顯色反應(yīng)茴香醛-硫酸反應(yīng)呈陽性溶介性易溶于甲醇、醋酸乙酯、丙酮、氯仿，難溶于水、正戊烷、正己烷、苯。
薄層分析(美國Merck公司制造的0.25mm硅薄層板)溶劑 Rf值氯仿∶甲醇＝2∶1 0.64氯仿∶甲醇＝10∶1 0.17醋酸乙酯∶苯＝4∶1 0.10抗菌譜采用通常的瓊脂平板稀釋法，求出最低抑制濃度(MIC)。
(真菌使用馬鈴薯·蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌使用肉湯瓊脂培養(yǎng)基)其結(jié)果，SR-1223對植物病原性系狀菌顯示出很強的生長抑制作用，而對常規(guī)細(xì)菌幾乎無生長抑制作用。
測試菌 MIC(mcg/ml)灰葡萄孢菌 32(Botrytis cinerea)刺盤孢菌 62.5(Colletotrichum lagenarium)稻瘟病菌 62.5(Piricularcia oryzae)
蛇孢腔菌 62.5(Ophiobolus niyabeanus)黑曲霉菌 62.5(Aspergillus niger)鏈格孢菌 125(Alternaria mali)米曲霉菌 125(Aspergillus oryzae)尖鐮孢菌 250(Fusarium oxysporum)與其他物質(zhì)比較紫外光譜中，在270nm處有吸收峰的已知的抗生素有冷霉素(Cry-omycin)、勻霉素(Homomycin)、萘啶霉素(Naphthyridomy-cin)、薩布里霉素(Subliomycin)、結(jié)核放線菌素(Juberac-tinomycin)等。但這些抗生素均對細(xì)菌類顯示出抗菌性，在這一點上與本抗生素有著明顯的不同。而且在其他理化性質(zhì)上也有著明顯的差異，故而可以推論SR-1223是一種新抗生素。
SR-1223由于對上述植物病原性系狀菌顯示出很強的生長抑制作用，故而可望成為一種農(nóng)用抗生素藥劑。
實驗例以葡萄糖2%、可溶性淀粉1%、肉汁浸膏0.1%、干酵母0.4%、大豆粉2.5%、食鹽0.2%、磷酸二氫鉀0.005%的配比制成培養(yǎng)基。將“SR-1223菌株”接種于該培養(yǎng)基中，置于28℃振蕩培養(yǎng)96小時，取其培養(yǎng)液15升，于PH＝4的條件下用醋酸乙酯進(jìn)行抽提，提取液經(jīng)減壓濃縮后，即得8.5g油狀物。然后以氯仿-甲醇(4∶1)為溶劑，調(diào)制一根直徑為60mm，長度為400mm的硅膠柱。將上述油狀物溶于甲醇后在柱中展開。以每10ml為一計量，在第25～47計量區(qū)域里收集活性組份。
將上述活性組份的收集物減壓濃縮得到2.2g濃縮物。此后用高速液相色譜分離制取SR-1223的粗品。色譜柱選用直徑為20mm、長度為300mm的Nucleosil5C18。溶劑采用甲醇-水(7.5∶2.5)，并添加1%的二乙胺·甲酸(PH＝7.3)。流速8.0ml/分、壓力170kg/cm2。在保留時間為16分鐘時出現(xiàn)SR-1223的峰。收集該組分，用0.1N鹽酸調(diào)整PH至4，減壓濃縮直至除盡甲醇為止。沉淀經(jīng)醋酸乙酯提取、水洗、再濃縮后，即得26mg SR-1223的粉末狀粗品。
再后再用高壓液相氣譜進(jìn)行精制。色譜柱為High-Carbon ODS直徑10mm、柱長250mm，溶劑為甲醇-水-1%二乙胺∶甲酸(PH7.3)(7.5∶1.5∶1)，流速1.4毫升/分，壓力150kg/cm2，在保留時間為20分鐘時出現(xiàn)SR-1223活性峰。收集活性峰區(qū)域，用0.1N鹽酸調(diào)整到PH4，減壓濃縮直至除盡甲醇。用醋酸乙酯提取，以0.1N鹽酸洗滌，再水洗、濃縮。然后再將濃縮物溶于甲醇，加水，減壓濃縮至除盡甲醇，經(jīng)冷凍干燥后即得26mg淡黃色粉末狀的SR-1223純品。
4.附圖的簡單說明圖1為本發(fā)明所述的抗生素SR-1223的紫外吸收光譜圖，圖2為抗生素SR-1223的紅外吸收光譜圖。
權(quán)利要求
1.一種新抗生素SR-1223的制備方法，其特征在于培養(yǎng)屬于鏈霉菌(streptomyces)屬的抗生素SR-1223的生產(chǎn)菌，再從這些培養(yǎng)物中分離提取新抗生素SR-1223。
2.按權(quán)利要求
1所述的制備方法，其特征在于所述的抗生素SR-1223的生產(chǎn)菌為鏈霉菌SP·SR-1223(Streptomyces SP·SR-1223)。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新抗生素SR-1223及其制備的方法。該抗生素對某些植物病原性系狀菌顯示出很強的生長抑制作用，可望成為一種農(nóng)用抗生素藥劑，本抗生素通過培養(yǎng)鏈霉菌sp·SR-1223(Streptomyc es sp·SR-1223)而制得。
文檔編號C07G11/00GK86104124SQ86104124
公開日1988年8月17日 申請日期1986年12月1日
發(fā)明者成杏春, 方仁萍, 梁鳳群, 戴仙文, 沈寅初, 朱道荃, 磯野清, 山口勇, 黃耿堂, 木原剛, 日下部寬男, 見里朝正 申請人:上海市農(nóng)藥研究所, 日本國理化研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan