專利名稱：一種抗生素的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗細菌藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
隨著抗生素的廣泛使用，微生物的抗藥性也逐漸增強。據(jù)報道，目前分離的金黃色葡萄球菌有90％以上能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，能抗青霉素類藥物，隨著甲氧西林(methicillin)的替代使用，對甲氧西林有抗性的金黃色葡萄球菌(MRSA)迅速產(chǎn)生，由于各類抗藥性在菌株間的不斷積累和轉(zhuǎn)移。至目前，只有糖肽類抗生素仍保持著對MRSA的活性。但Hiramatsu已分離到一株對萬古霉素(vancomycin，屬糖肽類抗生素)有抗性的MRSA菌株，雖然抗性機理還不太清楚，但一旦這種抗性擴散，對MRSA菌株的感染可能就無藥可用了。
與此同時，環(huán)境污染的加劇，社會和人文的變遷使人類的免疫力不斷下降，新的致病菌和條件致病菌不斷出現(xiàn)，先前不被認為是由細菌引起的疾病，如胃痙攣、心臟病等也被發(fā)現(xiàn)可由細菌引起。這種微生物日益增強的抗藥性和新致病菌的不斷出現(xiàn)已經(jīng)成為一個嚴重的社會問題，要解決這一問題，最有效的辦法就是加大力度，篩選開發(fā)新的抗生素。
但是新藥的開發(fā)已越來越難。究其原因，主要是缺乏新型的篩選靶標和有效的篩選方法。傳統(tǒng)上抗生素是根據(jù)抑菌能力來篩選的，隨著對抗生素作用機理的認識，逐漸發(fā)展出以必需酶、受體、離子通道等為靶標進行篩選的方法。近年來，由于人類基因組和微生物基因組工作的進展，新的靶標不斷出現(xiàn)，再加上高通量篩選方法的建立，使新藥篩選工作獲得了快速的發(fā)展。
理想的靶標應該是細胞存活所必需的，在病原菌中高度保守，而在人體中不存在或差異很大的物質(zhì)。目前所用的靶標絕大多數(shù)是具有明確生化功能的蛋白質(zhì)，這類靶標雖然篩選相對容易，但存在著一個缺點，即對找到的抗生素，細菌可能會通過作用位點(靶標)的突變來產(chǎn)生抗藥性。RNA作為靶標來篩選抗生素的工作目前已越來越受到關(guān)注，Echer認為就靶標而言，RNA的價值要比基因組大一倍，Steven也認為用RNA作靶標篩得的抗生素抗藥性發(fā)展較慢。實際上，氨基糖苷類抗生素就可通過與核糖體16S rRNA的A位點結(jié)合而發(fā)揮作用。研究表明，編碼16S rRNA的基因(rDNA)全長約1500bp，由一系列保守區(qū)和可變區(qū)間隔而成，這些保守序列在千百萬年的進化過程中幾乎沒發(fā)生過變化，如1351～1369位(以大腸桿菌為標準)是G-菌的保守區(qū)，1401～1419位是G+菌的保守區(qū)，1167～1189位在所有細菌中都保守。鏈霉素與rRNA的結(jié)合位點是由16S rDNA的非保守區(qū)編碼的，因此當rRNA上的第524位由鳥嘌呤(G)突變成胞嘧啶(C)時，鏈霉素就不能很好地與之結(jié)合，細菌就產(chǎn)生了對鏈霉素的抗性。如果以rRNA的保守序列作靶標去篩選抗生素，將會大大減小這類抗藥性的產(chǎn)生。
RNA除了可與一些小分子物質(zhì)結(jié)合外，還能與蛋白質(zhì)(RNA-bindingproteins)、反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides)結(jié)合。不過大多數(shù)蛋白質(zhì)和反義寡核苷酸分子量較大，很難進入病原微生物的細胞內(nèi)，如果能從微生物代謝產(chǎn)物中篩選到可與RNA特異結(jié)合的多肽類物質(zhì)，將有可能成為具有應用前景的抗生素。
除了蛋白質(zhì)和RNA外，DNA在細菌的生命活動過程中也扮演著非常重要的角色。但用DNA作靶標篩選抗生素的工作還沒有受到重視，主要原因是目前發(fā)現(xiàn)的作用于DNA的抗生素大都缺乏選擇毒性。但DNA作為靶標的潛力值得關(guān)注。研究表明某些物質(zhì)可與DNA發(fā)生特異性結(jié)合，如大腸桿菌乳糖操縱子中的阻遏蛋白可識別一段26bp的DNA序列并與之結(jié)合。Carrasco證實抗癌抗生素AT2433-B1能與特定DNA序列相識別。Charles發(fā)現(xiàn)卡那霉素和新霉素的異硫氰酸鹽可共價連接于特定的DNA片段上。因此，如果以rDNA的保守區(qū)為靶標去篩選能與之發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)，有可能開發(fā)出能專一性地抑制細菌生長而不影響人體DNA功能的抗生素。
由于rRNA與rDNA的負鏈除了U取代T外，其它都一樣，因此，以其保守序列為靶標篩選得到的抗生物質(zhì)進入細胞后，除能與rRNA結(jié)合影響核糖體的組裝，破壞核糖體的功能外，還有可能與DNA結(jié)合抑制復制的進行；而且這些作為靶標的區(qū)域在細菌中高度保守，因作用靶標變異而產(chǎn)生的抗藥性幾乎不太可能發(fā)生。由此而篩選得到的抗生素不僅在醫(yī)療領(lǐng)域，而且在食品保鮮、物品防腐等方面具有巨大的應用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種基于原核生物核糖體核酸為靶標的抗細菌藥物篩選方法，建立了基于細菌核糖體核酸，特別是其中的保守序列為靶標的新型抗生素篩選模型。
本發(fā)明主要包括以下步驟1)合成致病細菌核糖體核酸(包括16S rRNA、16S rDNA、23S rRNA或23S rDNA全序列中至少含18個堿基的序列，特別是其中的保守片段)作為抗生素篩選的靶標，將上述靶標固定在載體A上；2)將核酸隨機片段(含8～12個堿基)固定在載體B上；3)將待篩選物質(zhì)濃縮后溶解于緩沖液中；4)用固定有核酸隨機片段的載體B吸附去除待篩選物濃縮液中的非特異性結(jié)合物；5)用固定有靶標的載體A捕獲待篩選物濃縮液中的特異性結(jié)合物；6)用洗脫液洗下結(jié)合在靶標上的特異性結(jié)合物，進行抑菌試驗；7)對有抑菌能力的特異性結(jié)合物進行分離純化，得到抗生素候選物。
核糖體核酸及核酸隨機片段的合成為一項成熟技術(shù)，本發(fā)明所需的細菌核糖體核酸及核酸隨機片段可以在研究室合成，也可以向生物技術(shù)公司購買。
本發(fā)明可以以某一種特定致病菌的16S rRNA或23S rRNA為靶標篩選能與之特異結(jié)合的專一性抗生素，如以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的16S rRNA或23S rRNA為靶標篩選對這類致病菌有特異抑制作用的專性抗生素；也可以以某一類致病菌共有的rRNA保守序列為靶標篩選廣譜抗生素，這些保守序列可以來自16S rRNA(或16S rDNA)，也可以來自23S rRNA(23SrDNA)。如來自16S rRNA在所有細菌中都保守的AGAGUUUGAUCCUGGCUCAG、GGUUACCUUGUUACGACUU和AGGAGGUGAUCCAACCGCA；或是來自16S rRNA在革蘭氏陽性致病菌中保守的如GGCUUCUGCUGUUACAAA，或是來自16S rRNA在革蘭氏陰性致病菌中保守的如CCCGGCUUCGUAUUCACC，或是來自16S rRNA只在某一類病原菌如立克次氏體中保守的序列如UAAUGCCGGGAACUAUAAGAA；或是來自23S rRNA在所有細菌中都保守的序列如UUCGCCUUUCCCUCACGGUACU等。
本發(fā)明采用的細菌核糖體核酸序列可以是人工合成的保守片段(至少含18個堿基)，或是以27F，1492R為引物經(jīng)聚合酶鏈反應(PCR)合成的16S rDNA全序列，或是以其他引物經(jīng)PCR合成的16S rDNA部分序列，也可以是來自23S rRNA的序列。
本發(fā)明采用的靶標固定化材料可以是在southern blotting中常用的硝酸纖維素膜、PVDF膜或尼龍膜，可以是在基因芯片中常用的玻璃或硅片，可以是核酸親和層析中常用的纖維素或Sepharose，也可以是其他能吸附核酸的材料，如瓊脂糖，羥基磷灰石，聚丙烯等。
本發(fā)明所使用的隨機片段由A、T(U)、G、C四種堿基隨機組裝而成，長度約為10個堿基。
本發(fā)明將上述核酸隨機片段固定在載體B上，先用這些隨機片段盡可能去除發(fā)酵液中的非特異性結(jié)合物；也可以用動物細胞DNA代替核酸隨機片段去除非特異性結(jié)合物。
本發(fā)明所述的待篩選物質(zhì)可以是微生物發(fā)酵液，也可以是動植物組織提取液或動植物細胞培養(yǎng)液。這些待篩選物質(zhì)應先用萃取、蒸發(fā)等常規(guī)方法濃縮，一方面提高有效物質(zhì)濃度，另一方面去除大分子雜質(zhì)，破壞DNA酶和RNA酶以防靶標降解。然后將濃縮物溶于適量磷酸緩沖液中，離心去除水不溶物(作為抗生素，應有足夠水溶性)后制成待篩選物濃縮液。
本發(fā)明對潛在抗生素的捕獲可采用濾膜過濾、液相“雜交”、親和結(jié)合等方法。所謂濾膜過濾法就是將靶標固定在濾膜上，讓待篩選物濃縮液流經(jīng)濾膜，特異性結(jié)合物就留在膜上，不能與靶標結(jié)合的物質(zhì)就被過濾下來，就象普通的過濾一樣；液相“雜交”法就是直接將靶標與待篩選物濃縮液在一定條件下保溫，讓潛在抗生素與靶標結(jié)合，然后將靶標-潛在抗生素結(jié)合物分離出來的過程；親和結(jié)合法就是先將靶標結(jié)合在特定的載體如纖維素顆粒上，然后與待篩選物濃縮液保溫，讓潛在抗生素與靶標親和結(jié)合的過程，就象mRNA的親和層析一樣。
本發(fā)明所使用的洗脫液可以是不同離子強度的溶液，也可以是不同pH的溶液，必要時可用核酸酶將靶標破壞，讓結(jié)合物釋放。
采用本發(fā)明可以根據(jù)某一種致病細菌特有的核糖體核酸序列篩選出能特異抑制該菌生長的專一性抗生素，或根據(jù)致病細菌共有的核糖體核酸保守序列篩選出能抑制各類細菌生長的廣譜抗生素，從而使大規(guī)模、高通量篩選抗藥性發(fā)展慢的新型抗生素成為可能。
具體實施例方式
實施例1濾膜過濾法篩選針對MRSA的專一性抗生素的方法包括以下步驟1.培養(yǎng)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，用DNA提取試劑盒提取其總DNA；2.人工合成16S rDNA的引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’)和1492R(5’GGTTACCTTGTTACGACTU 3’)；3.PCR合成MRSA的16S rDNA全序列；具體操作條件如下0.2mmol/L(each)dNTP，400nmol/L(each)引物，5mmol/L MgCl2和1U Taqplus，總體積50μL。反應條件94℃變性3分鐘后進行30個循環(huán)的PCR反應，每一循環(huán)包括94℃變性1分鐘，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘。30個循環(huán)結(jié)束后，再在72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離后，用PCR純化試劑盒純化；4.將純化的MRSA的16S rDNA全序列在95℃水浴中加熱5分鐘后快速放在冰浴中處理5分鐘，然后將變性的16S rDNA均勻地加到硝酸纖維素膜上，吸附固定30分鐘，真空抽干，紫外線照射30秒，制成固定有靶標的濾膜A，備用；5.用核酸合成儀人工合成含12個堿基的核酸隨機片段，均勻地加到尼龍膜上，吸附固定30分鐘，真空抽干，紫外線照射30秒。制成固定有核酸隨機片段的濾膜B，備用；6.篩選具有抗菌活性的微生物菌株，搖瓶發(fā)酵，收集發(fā)酵液，用乙酸乙酯抽提，收集有機相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸去乙酸乙酯，殘留物用兩倍體積的pH7.0磷酸緩沖液溶解，離心去除沉淀，將上清液加至布氏漏斗上，漏斗中預先放有作為“濾紙”的上述固定有核酸隨機片段的尼龍膜(濾膜B)，以去除非特異性結(jié)合物，濾液緩慢流經(jīng)上述固定有靶標的硝酸纖維素膜(濾膜A)上，讓特異性結(jié)合物與靶標充分結(jié)合；7.用酸性洗脫液(0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液，pH3.0)洗滌，將洗下的特異性結(jié)合物回收(作為藥物，結(jié)合力越強越好，因此可先用pH6.8的磷酸緩沖液洗掉結(jié)合力較弱的成分)；8.進行抗菌抑菌試驗并分離純化具有抗菌活性的相關(guān)化合物；9.對純化的抗生素進行化學結(jié)構(gòu)的確定。
實施例2液相“雜交”試驗篩選廣譜抗菌藥物的方法包括以下步驟1.委托有關(guān)生物技術(shù)公司合成致病細菌23S rRNA第6區(qū)段的保守片段GCGAUUUCCGAACGGGGAAACCC；2.篩選具有抗菌活性的微生物菌株，搖瓶發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物過濾，濾液用乙酸乙酯抽提，收集有機相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸去乙酸乙酯，殘留物用兩倍體積的pH7.0磷酸緩沖液溶解，5000g離心10分鐘，去除沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至一干凈培養(yǎng)皿中；3.委托有關(guān)生物技術(shù)公司合成含10個堿基的核酸隨機片段，加至上述培養(yǎng)皿中，30℃恒溫搖床上緩慢振搖30分鐘；4.將一張DE-81濾膜(直徑比培養(yǎng)皿內(nèi)徑略小)浸至培養(yǎng)皿中，30℃恒溫搖床上緩慢振搖30分鐘，由于DE-81濾膜能強烈吸附并滯留核酸，那些能與核酸隨機結(jié)合的物質(zhì)也一同被去除；5.將合成的23S rRNA第6區(qū)段的保守序列加至培養(yǎng)皿中，30℃恒溫搖床上緩慢振搖60分鐘；6.將一張新的干凈DE-81濾膜(直徑比培養(yǎng)皿內(nèi)徑略小)浸至培養(yǎng)皿中，30℃恒溫搖床上緩慢振搖30分鐘，那些能與靶標寡核苷酸片段特異結(jié)合的物質(zhì)被轉(zhuǎn)移至膜上；7.用高離子強度洗脫液(1mol/L NaCl，0.1mol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH 8.0)洗滌上述膜，將特異性結(jié)合物回收；8.進行抗菌抑菌試驗，判斷抗菌活性；9.大規(guī)模分離純化相關(guān)物質(zhì)，確定該物質(zhì)結(jié)構(gòu)。
實施例3親和結(jié)合試驗篩選廣譜抗菌藥物的方法包括以下步驟1.人工合成致病細菌16S rRNA的保守序列GCAUCAGGUCAAGUCAUC；2.將合成的保守片段溶于適量去離子水中，使成0.1mmol/L的溶液，然后均勻地加到尼龍膜A上，吸附固定30分鐘，室溫干燥，80℃真空爐干烤30分鐘，制成固定有靶標的濾膜A，備用；3.人工合成長度為8個堿基的核酸隨機片段，同上法溶解后均勻地加到尼龍膜B上，吸附固定30分鐘，室溫干燥，80℃真空爐干烤30分鐘，制成固定有核酸隨機片段的濾膜B，備用；4.篩選具有抗菌活性的中草藥，粉碎后用80％的丙酮水溶液浸提，普通濾紙過濾，濾液加至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸去丙酮，得浸提濃縮液；5.將濾膜B放于一干凈培養(yǎng)皿中，加入浸提濃縮液，30℃搖床緩慢振搖30分鐘，去濾膜B；6.將濾膜A放于培養(yǎng)皿中，30℃搖床緩慢振搖60分鐘，取濾膜A；7.用pH8.0，6.0，5.0，4.0的Tris-HCl洗脫液分段洗滌，將濾膜A上的特異性結(jié)合物回收；8.進一步進行抗菌抑菌試驗并對收集物進行分離純化。
實施例4親和結(jié)合試驗篩選抗破傷風梭狀芽孢桿菌的專一性抗生素的方法包括以下步驟1.人工合成破傷風梭狀芽孢桿菌16S rRNA的特異性片段ACCCUAGAGCAUAAGGGGCAUGAUGAUUUG；2.將合成的片段連接到纖維素上(可請有關(guān)生物技術(shù)公司加工)，制成靶標-纖維素親和層析用的固定相，備用；3.用酚氯仿抽提法提取小牛胸腺DNA，用堿變性液(終濃度為0.4mol/LNaOH，40mmol/LEDTA)室溫處理10分鐘使DNA變性后，均勻地加到硝酸纖維素膜上，吸附固定30分鐘，室溫干燥，80℃真空爐干烤30分鐘，制成固定有動物細胞DNA的濾膜，備用；
4.篩選具有抗菌活性的微生物菌株，搖瓶發(fā)酵，收集并濃縮發(fā)酵液，溶于適量pH7.0的磷酸緩沖液中，過濾；5.將濾膜用pH7.0的磷酸緩沖液漂洗后，放于一干凈培養(yǎng)皿中，加入上述濾液，30℃搖床緩慢振搖30分鐘，讓能與動物細胞DNA結(jié)合的物質(zhì)吸附到濾膜上，去濾膜；6.在濾液中加入靶標-纖維素顆粒(固定相)，混合均勻，30℃搖床緩慢振搖30分鐘；7.將上述混合物加至層析柱上，棄去未被結(jié)合的溶液；8.以不同離子強度的洗脫緩沖液(分別含0.2，0.6，1.0和1.4mol/LNaCl的Tris-HCl緩沖液，pH7.0)作流動相分段層析，收集層析液；9.進行抗菌抑菌試驗；10.對有抗菌活性的成分進行大規(guī)模分離純化，確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。
權(quán)利要求
1.一種抗生素的篩選方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)以細菌核糖體核酸作為靶標，將其固定在載體A上；2)將核酸隨機片段固定在載體B上；3)將待篩選物質(zhì)濃縮后溶解于緩沖液中；4)用固定有核酸隨機片段的載體B吸附去除待篩選物濃縮液中的非特異性結(jié)合物；5)用固定有靶標的載體A捕獲待篩選物濃縮液中的特異性結(jié)合物；6)用洗脫液洗下結(jié)合在靶標上的特異性結(jié)合物，進行抑菌試驗；7)對有抑菌能力的特異性結(jié)合物進行分離純化，得到抗生素候選物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的細菌核糖體核酸為16S rRNA、16S rDNA、23S rRNA和23S rDNA中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的細菌核糖體核酸為全序列中至少含18個堿基的序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的核酸隨機片段長度為8～12個堿基。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的載體為硝酸纖維素膜、尼龍膜、玻璃、硅片、纖維素、Sepharose、瓊脂糖、羥基磷灰石、聚丙烯中的一種。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的緩沖液為中性磷酸緩沖液。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的特異性結(jié)合物的捕獲可采用濾膜過濾法、液相“雜交”法、親和結(jié)合法中的一種。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脫液為不同離子強度的溶液。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脫液為不同pH值的溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗細菌藥物的篩選方法。傳統(tǒng)上抗生素是根據(jù)抑菌能力來篩選的。本發(fā)明的包括以下步驟合成致病細菌核糖體核酸作為抗生素篩選的靶標固定在載體A上；將核酸隨機片段固定在載體B上；將待篩選物質(zhì)溶解于緩沖液中；用固定有核酸隨機片段的載體B吸附去除待篩選物濃縮液中的非特異性結(jié)合物；用固定有靶標的載體A捕獲待篩選物濃縮液中的特異性結(jié)合物；用洗脫液洗下結(jié)合在靶標上的特異性結(jié)合物，進行抑菌試驗；對有抑菌能力的特異性結(jié)合物進行分離純化。采用本發(fā)明方法可以篩選出能特異抑制某菌生長的專一性抗生素，也可以篩選出能抑制各類細菌生長的廣譜抗生素。
文檔編號C12Q1/18GK1557965SQ20041001602
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月18日
發(fā)明者吳根福 申請人:浙江大學