專利名稱：改進(jìn)昆蟲毒素效力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的某些菌株產(chǎn)生的昆蟲毒素。更具體地說，本發(fā)明涉及通過共同施用有效量的胰蛋白酶抑制劑來改進(jìn)這類毒素的效力的方法。
蛋白酶抑制劑以多種形式存在于植物、動物、昆蟲和微生物的各種組織中。各種絲氨酸蛋白酶抑制劑被深入地進(jìn)行了特征鑒定，它們一般通過一種共同的機(jī)制發(fā)揮作用。每種抑制劑都含有一個活性位點(diǎn)，此活性位點(diǎn)為一個表面肽鍵，它作為酶的底物而形成一個非常穩(wěn)定的酶-抑制劑復(fù)合物。有幾類絲氨酸蛋白酶抑制劑已作了鑒定。Kunitz和Bawman-Birk型胰蛋白酶抑制劑常見于植物體內(nèi)。這些抑制劑常見于豆科植物(Leguminosae)的種子和塊莖中。蛋白酶抑制劑在植物中的生理功能問題已提出多年。貯藏器官中的抑制劑對萌發(fā)前或萌發(fā)期間蛋白酶的控制可能具有調(diào)節(jié)或保護(hù)作用(Ryan，C.A.，TheBiochemistryofPlants，6∶364，1981)。這些抑制劑可以抑制可能會從破裂的蛋白體中意外釋放的內(nèi)源性蛋白酶，從而保護(hù)胞質(zhì)蛋白不被消化(Baumgartner，etal.，PlantPhysiol.，58∶1，1976)。蛋白酶抑制劑可通過抑制酶原的激活(例如幾丁質(zhì)合酶)而起作用(Hassanetal.，J.InsectPhysiol.，33(9)∶669-676，1987)。植物蛋白酶抑制劑還可能進(jìn)化為抵御植物害蟲的防護(hù)機(jī)制。有幾個研究小組研究了飼喂植物蛋白酶抑制劑對昆蟲幼蟲的影響，發(fā)現(xiàn)某些抑制劑具有高水平的殺蟲作用。但重要的是要注意，只是在抑制劑濃度為飼料總重量和2-5%時才觀察到殺蟲作用(Gatehouse，etal.，J.Sci.FoodAgric.34∶345-350，1983)。
七十年代后期，從五千多個豇豆變種中選擇出一個對四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)幼蟲具有抗性的豇豆品種。四紋豆象是西非的一種主要貯藏害蟲。生化研究表明，種子內(nèi)較高水平的胰蛋白酶抑制劑與昆蟲耐性有關(guān)(美國專利4，640，836)。如果將純化的豇豆胰蛋白酶抑制劑(CPTI)與昆蟲敏感性品種的豇豆粉以1.5-10.0%(w/w)的水平混合，則四紋豆象的發(fā)育大大減緩，并觀察到很高的死亡率(Gatehouse，etal.J.Sci.FoodAgric.34∶345-350，1983)。最近以表達(dá)豇豆胰蛋白酶抑制劑的基因轉(zhuǎn)移植物進(jìn)行了遺傳改造，表現(xiàn)出較強(qiáng)昆蟲耐性。CPTI含量最高(可溶性蛋白的1%)的植物表現(xiàn)出最高的胰蛋白酶抑制活性，也導(dǎo)致最高水平的昆蟲死亡率(Hilder，etal.Nature330∶160-163，1987)。
從蘇云金芽孢桿菌(B.t.)的許多菌株中分離出另一類完全不同的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)也能抑制昆蟲發(fā)育并具有殺蟲活性。由B.t.產(chǎn)生的蛋白晶體毒素是用于昆蟲防治的主要的一類蛋白(Klausner，Bio/Technology2∶408-419)B.t.是一種形成孢子的革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，它特征性地產(chǎn)生一種具有殺蟲活性的伴孢晶體蛋白。已分離出B.t.菌株的一個變種，它所產(chǎn)生的毒素具有抗范圍廣泛的昆蟲的活性，包括鱗翅目、鞘翅目和雙翅目昆蟲。已分離出許多對鱗翅目昆蟲具有活性的B.t.菌株，并分析了其伴孢晶體蛋白。這些蛋白一般是編碼為130-140Kd的蛋白，隨后在敏感昆蟲的中腸中經(jīng)蛋白水解激活而形成分子量約為65-70Kd的活性毒素(Aronson，et al.，Microbiol.Rev.50∶1-24，1968)。蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德亞種(B.t.kurstaki)的晶體/孢子制備物多年來在諸如DIPEL (Abbott Laboratories)和THURICIDE (Sandoz)等產(chǎn)品中用作商業(yè)殺蟲劑。這些商業(yè)B.t.k殺蟲劑可有效地防治五十多個種的鱗翅目害蟲(Wilcox，et al.Protein Engineering，Inouye and Sarma(Eds.)，Academic Press，NY，1986)。1977年在以色列分離出的蘇云金芽孢桿菌以色列亞種(B.t.israeliensis)所產(chǎn)生的毒素，現(xiàn)已證實對若干雙翅目水生昆蟲如蚊和蚋的幼蟲有毒(EPO公告0，195，285)。最近，從蘇云金芽孢桿菌黃粉 亞種(B.t.tenebrionis)和蘇云金芽孢桿菌圣地亞哥亞種(B.t.San diego)分離出對鞘翅目昆蟲具有毒性的蘇云金芽孢桿菌毒素(Herrnstadt et al.，Bio/Technology 4∶305-308，1986;Krieg，et al.，Z.Angew.Entomologie 500-508∶1983)。
農(nóng)業(yè)上重要的昆蟲包括(但不限于)煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)、煙草天蛾(Manducasexta)、谷實夜蛾(Heliothiszea)、小地老虎(Agrotisipsilon)、玉米螟(Ostrinianubilalis)、粉紋夜蛾(Trichoplusiani)、梨豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)。


圖1顯示大豆的Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的完整氨基酸順序。
圖2顯示植物轉(zhuǎn)化盒式載體pMON316的質(zhì)粒圖譜。
圖3顯示制備pMON9732和pMON9733所用的步驟。
圖4顯示制備pMAP17所用的步驟。
圖5顯示制備pMON294所用的步驟。
圖6顯示制備含B.t.k.HD-73毒素蛋白編碼基因的植物轉(zhuǎn)化載體所用的步驟。
圖7顯示制備含B.t.t毒素蛋白編碼基因的植物轉(zhuǎn)化載體所用的步驟。
圖8圖示大豆胰蛋白酶抑制劑對B.t.k.HD-73的增效作用。
圖9圖示大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑對B.t.t的增效作用。
圖10圖示煙芽夜蛾幼蟲體重由于接觸B.t.k毒素蛋白而下降的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖11圖示含胰蛋白酶抑制劑的粗提物對B.t.毒素的生物活性的增效作用。
圖12顯示制備質(zhì)粒pMON9791所用的步驟。
圖13顯示植物轉(zhuǎn)化盒式載體pMON893的質(zhì)粒圖譜。
圖14顯示增強(qiáng)的CaMV35S啟動子的DNA順序。
圖15顯示制備質(zhì)粒pMON9792所用的步驟。
圖16圖示構(gòu)成去致瘤力的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)ACO的T-DNA區(qū)的各成分。
本發(fā)明就其最廣義的方面來說，提供一種增強(qiáng)土壤細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌的伴孢蛋白的殺蟲活性的方法。更具體地說就是通過同時施用有效量的胰蛋白酶抑制劑來提高B.t.毒素的殺蟲活性?！坝行⑾x量”是指造成昆蟲死亡或幼蟲體重下降和/或發(fā)育遲緩所必需的毒素量。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，極低水平(這一水平本身并不具有殺蟲活性)的胰蛋白酶抑制劑，可大大增強(qiáng)B.t.毒素對其目標(biāo)昆蟲的殺蟲活性。一般來說，當(dāng)所用的B.t.毒素的濃度只造成極小的(～10%)死亡率時，加入至少占飼料重量0.0002%的水平的純化的胰蛋白酶抑制劑，即可將僅用B.t.毒素所觀察到的死亡率提高二至五倍。抑制劑/飼料比例在約0.000002至2.0%(重量)之間較好，在約0.00002和0.02%(重量)之間更好。
因此，本發(fā)明的一個方面是提供改進(jìn)的B.t.毒素組合物，這類組合物含有有效殺蟲量的蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白，以及有效量的胰蛋白酶抑制劑以增強(qiáng)B.t.毒素的殺蟲活性。當(dāng)毒素的濃度在10-10至10-7M之間時，抑制劑與毒素的摩爾比在1/10-2至106/1之間。抑制劑/毒素比例在約1/1和104/1之間最好。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道，由于存在抑制劑而造成的增效作用，將隨目標(biāo)昆蟲的不同而不同。
本發(fā)明的另一方面是提供一種增強(qiáng)表達(dá)B.t.毒素的植物的殺蟲劑抗性的方法，即改造基因轉(zhuǎn)移植物使其也表達(dá)一種胰蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明的再一方面是提供一種增強(qiáng)滋生在植物上并已被轉(zhuǎn)化而可表達(dá)B.t.毒素的細(xì)菌的有效性的方法，即轉(zhuǎn)化該細(xì)菌使其也表達(dá)上述抑制劑。滋生在植物上的細(xì)菌既可以附著在植物表面(葉或根)，實際上也可以生長在植物體內(nèi)。這類細(xì)菌的描述見于EP公告185，005和200，708，以及PCT公告WO87/03303。
鱗翅目型毒素及編碼這類毒素的結(jié)構(gòu)基因可從蘇云金芽孢桿菌的某些亞種得到，這些亞種包括(但不必限于)，戈爾斯德HD-1亞種、戈爾斯德HD-73亞種、猝倒亞種(B.t.sotto)、柏氏亞種(B.t.berliner)、蘇云金亞種(B.t.thuringiensis)、多窩亞種(B.t.tolworthi)、松蠋亞種(B.t.dendrolimus)、阿菜亞種(B.t.alesti)、蠟螟亞種(B.t.galleriae)、鲇澤亞種(B.t.aizawai)、亞毒亞種(B.t.subtoxicus)。雙翅目型毒素及編碼這類毒素的結(jié)構(gòu)基因可從諸如以色列亞種等亞種得到。鞘翅目型毒素及編碼這類毒素的結(jié)構(gòu)基因可從蘇云金芽孢桿菌的某些亞種得到，這些亞種包括(但不必限于)黃粉 變種和圣地亞哥變種。為清楚簡要地進(jìn)行說明，本發(fā)明將用戈爾斯德HD-1和HD-73亞種的鱗翅目型毒素和黃粉 亞種的鞘翅目型毒素作進(jìn)一步的敘述。
用來實施本發(fā)明的抑制劑通常是植物的胰蛋白酶或胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑，但其它胰蛋白酶抑制劑如已被確定對B.t.毒素具有增強(qiáng)作用，則也可使用。具體說來，合適的胰蛋白酶抑制劑可從動物、植物、昆蟲或微生物中分離得到。
合適的胰蛋白酶抑制劑既可以是Kunitz型，也可以是Bowman-Birk型，并可以從許多植物中分離，這些植物包括(但不必限于)豌豆、豇豆、裂莢老豌豆、小扁豆、斑豆、北方豆、菜豆、綠豆、芥菜(mustard bean)、大豆、紅豆(red bean)、 蒿、卡瓊麻豆(cajun pea)、稻、棉花、玉米、小麥、高梁、油菜、栗和大麥。
胰蛋白酶抑制劑可通過許多方法進(jìn)行分離。一般是將來源植物的種子在咖啡磨碎機(jī)中磨成粗粉并在室溫下貯存。胰蛋白抑制劑的提取方法是，以適當(dāng)?shù)谋壤?通常為1/5，w/v)將該粗粉用100mM磷酸鈉、150mM氯化鈉緩沖液(pH7.0)在4℃下混合。用振動臺或磁力攪拌盤攪拌使粉末保持懸浮?；旌?6-24小時后，先使該懸浮液通過三層紗布，然后將濾液以14，000×g離心20分鐘，除去顆粒。小心移出上清液并于-80℃下貯存。也可將磨好的粉末用乙醇進(jìn)行預(yù)處理使該粉末脫脂，然后用pH2.5-8.0的適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行提取，所用的適當(dāng)緩沖劑有Tris-HCl，pH8.0;乙酸鈉pH5.0;磷酸鈉pH7.0等。提取時間可以變化，從1小時到24小時或更長時間。提取時間若超過24小時則需要低溫，以減少細(xì)菌污染。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道，從磨碎的種子中提取蛋白酶抑制劑的條件非常靈活，因為這些抑制劑非常穩(wěn)定且可溶。另一些可供選用的提取方法見于文獻(xiàn)(Gennis，etal.J.Biol.Chem.251(3)734-740，1976;Elfant，etal.，Proc.Soc.Exp.Biol.andMed.180329-333，1985;Boisen，etal.Physiol.Plant52167-176，1981;Griffiths，J.Sci.FoodAgric.35481-486，1984;Wagner，etal.Arch.Biochem.Biophys.121672-677，1967)。
由種子粗提物純化胰蛋白酶抑制劑的第一步是用鹽析法濃縮蛋白。將硫酸銨粉末(酶級純)加到冷卻的(4℃)粗提物中，使其濃度達(dá)到約80%(51.6g/100ml)，同時在磁力攪拌盤上攪拌?；旌霞s1小時后，以約20，000×g在4℃下離心約30分鐘移出所形成的沉淀。將沉淀溶于原始體積的蒸餾水中，用流動的去離子水透析約2小時。再用含50mM乙酸鈉、20mM氯化鈣，pH5.0的緩沖液(原始體積的40倍)在4℃下透析過液。在某些情況下，較低的pH將會產(chǎn)生沉淀，此時以14，000×g離心20分鐘除去沉淀并棄去。將含有抑制劑蛋白組分的上清液貯于-80℃下以供進(jìn)一步純化。
可以利用幾種柱層析方法，從種子提取物中分離各種類型的蛋白酶抑制劑。由于植物的抑制劑的分子量低(6，000-25，000Kd)，F(xiàn)oard及其同事曾用SephadexG-100、SephadexG-75、最后在DEAE一纖維素上作離子交換，以層析手段純化出植物的抑制劑(Biochem.Biophys.Act.495∶369-382，1977)。另一些人采用這一一般性方案的許多修改方案來純化種子的抑制劑。
此外，親和層析技術(shù)的最新進(jìn)展為抑制劑的純化提供了一種有潛在價值的工具。利用抑制劑對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的專一性，還可以分離Kunitz(胰蛋白酶抑制劑)型和Bowman-Birk(雙頭胰凝乳蛋白酶/胰蛋白酶抑制劑)型的種子抑制劑。
通過用溴化氰(2g/ml乙腈)活化Sepharose4B-CL并保持反應(yīng)在10℃以下和pH10以上直到pH達(dá)到穩(wěn)定，制備出脫水胰蛋白酶-Sepharose和脫水胰凝乳蛋白酶-Sepharose。用冰冷的蒸餾水和100mM碳酸氫鈉充分洗滌活化樹脂，并將該樹脂與脫水胰蛋白酶或脫水胰凝乳蛋白酶以1∶1混合(見MethodsinEnzymology，91∶378-388，1983，AcademicPress)。在4℃下保溫過夜后，偶聯(lián)反應(yīng)完成98%以上。將該樹脂用蒸餾水和10mMHCl充分洗滌，并加等體積的2M乙醇胺(pH9.0)過夜使反應(yīng)位點(diǎn)保持封閉狀態(tài)。第二次洗滌樹脂并貯存于4℃。一般用50mM乙酸鈉、20mM氯化鈣在pH5.0下依次在脫水胰蛋白酶-Sepharose和脫水胰凝乳蛋白酶-Sepharose上進(jìn)行層析。將硫酸銨鹽析步驟得到的蛋白加到脫水胰蛋白酶-Sepharose上。用緩沖液洗柱，然后用5mMHCl洗脫。合并各峰組分(A280)，緩沖至pH5.1后加到脫水胰凝乳蛋白酶-Sepharose柱上，完全按前面就脫水胰蛋白酶-Sepharose柱所述洗柱和洗脫。流通組分含有Kunitz型抑制劑，而用HCl洗脫的組分含有Bowman-Birk型抑制劑。
B.t.毒素的分離A.鱗翅目型毒素已采用許多方法從B.t.菌中純化鱗翅目型毒素(Johnson，D.E.，“蘇云金芽孢桿菌各血清型中昆蟲細(xì)胞溶解活性的發(fā)生率”，F(xiàn)EMSMicrobiologyLettres43121-125，1975;Lecadet，M.M.andDedonder，R.，“孢子形成過程中蘇云金芽孢桿菌晶體內(nèi)含體的生物發(fā)生”，Eur.J.Biochem.23282-294，1971;Schesser，J.H.，Kramer，K.J.andBulla，Jr.L.A.，“利用煙草天蛾對蘇云金芽孢桿菌的均一伴孢晶體進(jìn)行生物檢定”，Appl.Environ.Microbiol.33878-880，1977;Tojo，A.andAizawa，K.，“蘇云金芽孢桿菌及其內(nèi)毒素被蠶屬腸汁蛋白酶溶解和降解”，Appl.Environ.Microbiol.45(2)576-580，1983;Nickerson，K.W.andBulla，Jr.L.A.，Appl.Microbiol.28124-128，1974)。Yamamoto等人公開了一種從B.t.k.HD-73菌中分離毒素的方法(Arch.ofBiochem.Biophys.227(1)233-241，1983)。將細(xì)菌培養(yǎng)在含有胨化牛奶養(yǎng)分、葡萄糖、酵母抽提物、磷酸二氫鉀和其它微量礦物質(zhì)的培養(yǎng)基中。維持30℃進(jìn)行發(fā)酵，直到幾乎所有細(xì)胞都產(chǎn)生孢子和晶體。將細(xì)胞溶解，以10，000×g離心20分鐘收集晶體，并通過至少三次重復(fù)離心用1MNaCl洗去細(xì)菌蛋白酶。將孢子和晶體的混合物懸浮在水中，在分液漏斗中振蕩直到產(chǎn)生泡沫。將水層中的晶體與含孢子的泡沫層分開，并將這個利用發(fā)泡進(jìn)行分離的操作重復(fù)至少10次，直到幾乎所有孢子都被除去。利用溴化鈉(NaBr)密度梯度進(jìn)行等密度離心，進(jìn)一步純化晶體。將一份晶體懸浮液樣品鋪在NaBr線性密度梯度上(1.30至1.40g/ml)，以100，000g離心2小時。用相差顯微鏡觀察每個條帶，確定晶體條帶的位置。離心后用水透析，從晶體中除去NaBr。將純化的晶體凍干并貯于-20℃?zhèn)溆谩?br> 將凍干的晶體(100mg)懸浮于4ml水中，并在機(jī)械對流爐中于70℃保溫1小時，使剩余的所有細(xì)菌蛋白酶失活。然后加入2-巰基乙醇至終濃度為2%，并加入氫氧化鈉調(diào)pH至10，解離出晶體。釋放出的毒素在SepharcylS-300(Pharmacia)柱上進(jìn)行純化，該柱已用含0.1%2-巰基乙醇和1mMEDTA的50mMTris-HCl，pH8平衡。以與毒素等電點(diǎn)相等的pH進(jìn)行酸沉淀，收集并濃縮毒素。
進(jìn)行HD-73的蛋白水解斷裂時，從粉紋夜蛾的五齡幼蟲收集腸汁，利用上述的溴化氰法將其連到Sepharose4B上。將純化的B.t.k.HD-73與粉紋夜蛾腸汁-Sepharose以1∶1的比例混合，并在25℃下輕輕攪拌保溫4小時。將該溶液以6，000×g離心除去樹脂，在SDS-PAGE上分析水解程度(134kd蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)?8kd蛋白)。一旦確定反應(yīng)已完全，就把蛋白凍干并貯于-80℃。
B.鞘翅目型毒素蘇云金芽孢桿菌黃粉 變種產(chǎn)生多種鞘翅目型毒素蛋白，這些蛋白以蛋白晶體形式存在，伴隨孢子形成而產(chǎn)生。這些蛋白晶體在孢子形成期間或之后，伴隨細(xì)胞自溶而釋放到培養(yǎng)基中。為確定蘇云金芽孢桿菌黃粉 變種所產(chǎn)生的毒素蛋白的數(shù)目，將500ml此微生物的培養(yǎng)物在2升培養(yǎng)瓶中于30℃下培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基為含100mM2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液pH7.0的15%TSB培養(yǎng)基。此時培養(yǎng)物已形成孢子，細(xì)胞也已溶解。以20，000×g于4℃下離心20分鐘，收集蛋白晶體和孢子。沉淀用過量的水洗滌三次，接著用2M NaCl洗滌三次。所得沉淀在水加0.02%疊氮化鈉中于4℃貯存。將沉淀懸浮于100mM碳酸鈉緩沖液(pH10)中，室溫下攪拌該懸浮液2小時，從而從晶體中溶解出B.t.t.毒素蛋白。以20，000×g離心20分鐘除去不溶物后，上清液濾過0.2μm濾膜而除去所有剩余的孢子。經(jīng)SDS-PAGE分析判斷，以此方式制備的B.t.t.毒素蛋白，與溶解于125mM Tris-HCl，4%SDS、20%甘油和10%2-巰基乙醇(pH6.8)(用于制備SDS-PAGE分析樣品的SDS樣品緩沖液)中的晶體一樣，由四種不同的主要蛋白組成。
B.t.毒素/蛋白酶抑制劑組合物的制備本發(fā)明的殺蟲劑組合物含有得自蘇云金芽孢桿菌的一個菌株的毒素蛋白和有效量的一種合適的胰蛋白酶抑制劑以增強(qiáng)各毒素蛋白的殺蟲活性。在多數(shù)情況下，蛋白酶抑制劑的量將占飼料重量的0.0000002至2.0%。但在許多情況下，低于0.02%(重量)的抑制劑水平就能使B.t.毒素的殺蟲效力得到有效增強(qiáng)，這一水平遠(yuǎn)低于抑制劑本身表現(xiàn)殺蟲活性的水平。在許多情況下將有可能使用含已形成孢子的培養(yǎng)物的B.t.毒素粗制備物，所述培養(yǎng)物中含有內(nèi)源性毒素蛋白。當(dāng)毒素的濃度在10-10和10-7M之間時，抑制劑與毒素的摩爾比在1/10-2和106/1之間。抑制劑/毒素的比例最好在約1/1和104/1之間。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員知道，由于抑制劑的存在而產(chǎn)生的增效作用將隨著目標(biāo)昆蟲的不同而不同。
改進(jìn)的殺蟲劑組合物還可含有合適的載體如蛭石、硅石等。該組合物還可以分散在一種聚合物中，以增強(qiáng)其加工性能，并增強(qiáng)其對由環(huán)境條件特別是與紫外光接觸所造成的降解的耐受力?？梢詫σ鹊鞍酌敢种苿┗蜻M(jìn)行改造使其在蘇云金芽孢桿菌中表達(dá)，以便通過發(fā)酵產(chǎn)生一種同時含有適當(dāng)水平的B.t.蛋白和胰蛋白酶抑制劑的微生物殺蟲劑。
可以利用Heierson等人(1987)或Crawford等人(1987)的方法，將克隆的胰蛋白酶抑制劑基因通過轉(zhuǎn)化作用引入B.t.中。這兩個研究小組證明，用得自枯草桿菌(B.subtilis)的質(zhì)粒就能實現(xiàn)B.t.的轉(zhuǎn)化，這些枯草桿菌表達(dá)對卡那霉素、四環(huán)素加紅霉素、四環(huán)素或氯霉素的抗性。此外，至少已成功地使用了兩種不同類型的質(zhì)粒復(fù)制子。根據(jù)這兩個研究小組的工作，可以用質(zhì)粒pGR71、pTV53ts、pBC16或pC194作載體將胰蛋白酶抑制劑基團(tuán)導(dǎo)入B.t.中。其它帶有類似的可選擇標(biāo)記和復(fù)制子的質(zhì)粒也可以使用。
用于表達(dá)的適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌敢种苿┚幋a順序，可以是大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的cDNA或南瓜CMTI的合成基因。為在B.t.中表達(dá)這些基因，需要將它們的5′端與能在B.t.中表達(dá)的啟動子融合。合適的啟動子可以從已知能在轉(zhuǎn)化載體中發(fā)揮功能的抗生素抗性基因的5′鄰接區(qū)得到。已知能在枯草桿菌中發(fā)揮功能的啟動子也有可能在B.t.中發(fā)揮功能。有幾種這類啟動子已有描述。已知這些啟動子多半都能在營養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，因此將導(dǎo)致抑制劑在毒素蛋白之前產(chǎn)生。
在晶體形成過程中與B.t.蛋白協(xié)同表達(dá)胰蛋白酶抑制劑可能也是適當(dāng)?shù)?。這可以通過使抑制劑基因與毒素基因啟動子融合來實現(xiàn)。含該啟動子的適當(dāng)片段可以是從pMAP3中B.t.k.基因上游的HpaI位點(diǎn)延伸至毒素基因起點(diǎn)ATG的約150bp片段。與此片段融合的胰蛋白酶抑制劑基因?qū)f(xié)同表達(dá)毒素和抑制劑。已知枯草桿菌中還有另一些專一于孢子形成的啟動子(參考文獻(xiàn))，它們有可能在B.t.中起作用。
昆蟲抗性植物在本發(fā)明的另一些實施方案中，可以通過在基因轉(zhuǎn)移植物中同時表達(dá)B.t.毒素和胰蛋白酶抑制劑來增強(qiáng)植物抗昆蟲侵襲的能力。
以雙鍵DNA形式存在的植物基因的表達(dá)，涉及RNA聚合酶從一條DNA鏈轉(zhuǎn)錄出信使RNA(mRNA)，接著是mRNA初級轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞核內(nèi)的加工。這一加工過程涉及到一個3′非翻譯區(qū)，它使多聚腺苷酸加到RNA的3′端。
DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA的過程受通常稱為“啟動子”的DNA區(qū)的調(diào)控。該啟動子區(qū)含有一段堿基順序，這段順序指導(dǎo)RNA聚合酶與DNA結(jié)合，從而利用其中一條DNA鏈作模板而啟動mRNA的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一條相應(yīng)的RNA鏈。
許多在植物細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動子在文獻(xiàn)中已有描述。其中包括胭脂堿合酶(NOS)和章魚堿合酶(OCS)啟動子(攜帶在根瘤農(nóng)桿菌的誘瘤質(zhì)粒上)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子、二磷酸核酮糖羧化酶(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)小亞基的光誘導(dǎo)性啟動子、以及富含羥脯氨酸的糖蛋白編碼基因的啟動子。所有這些啟動子都曾用來建立各種類型的DNA構(gòu)建體，這些構(gòu)建體也已在植物中表達(dá)(參見例如PCT公告WO84/02913(Rogersetal.，Monsanto))。
已知或已發(fā)現(xiàn)能夠使RNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子可用于本發(fā)明。這些啟動子可從植物或植物病毒中得到，包括(但不限于)CaMV35S啟動子和從植物基因如ssRUBISCO胭脂堿合酶(NOS)和甘露堿合酶(MAS)基因中分離出的啟動子。如下所述，所選用的特定啟動子最好能造成充分的表達(dá)而導(dǎo)致毒素蛋白和蛋白酶抑制劑的生成。誘導(dǎo)抗性所需的毒素蛋白和蛋白酶抑制劑的量會隨著所要保護(hù)的植物和/或昆蟲的類型的不同而不同。因此，雖然優(yōu)選CaMV35S啟動子，但應(yīng)理解，該啟動子對本發(fā)明的所有實施方案來說可能并不都是最佳的。
如果需要，可以對用于本發(fā)明DNA構(gòu)建體的啟動子進(jìn)行修飾，以影響其調(diào)控特性。例如，可將CaMV35S啟動子與ssRUBISCO基因的在無光時阻遏ssRUBISCO表達(dá)的部分相連，產(chǎn)生一個在葉中有活性在根中無活性的啟動子。所得的嵌合啟動子可以如本文所述而使用。為了敘述的目的，短語“CaMV35S啟動子”包括CaMV35S啟動子的各種變化，如利用與操縱基因區(qū)連接，隨機(jī)誘變或人工誘變等手段得到的啟動子。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體還含有一個編碼植物蛋白酶抑制劑和/或B.t.毒素蛋白的結(jié)構(gòu)基因。植物蛋白酶抑制劑和B.t.毒素這兩者的結(jié)構(gòu)基因的例子在下面敘述。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員會知道，也可以用類似的技術(shù)來制備編碼其它B.t.毒素或植物蛋白酶抑制劑的其它結(jié)構(gòu)基因。
如果需要，用于本發(fā)明DNA構(gòu)建體的編碼順序可采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法，通過隨機(jī)突變或人工突變進(jìn)行修飾而產(chǎn)生突變體。因此，這些突變體和變異體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本文所用的短語“B.t.毒素”包括截短的毒素和全長的B.t.毒素。本文所用的短語“蛋白酶抑制劑”包括突變的和變異的抑制劑和未修飾的蛋白酶抑制劑。
3′非翻譯區(qū)含有一個多聚腺苷酸化信號，此信號在植物中的作用是使多聚腺苷酸加至mRNA的3′端。合適的3′區(qū)的例子有(1)含有農(nóng)桿菌誘瘤(Ti)質(zhì)?；颍珉僦瑝A合酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號的3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū);(2)諸如大豆貯藏蛋白基因和RuBP羧化酶小亞基基因這樣一些植物基因。優(yōu)選的3′區(qū)的例子是NOS基因的3′區(qū)，這將在下面的實例更詳細(xì)地敘述。
由本發(fā)明的DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的RNA還含有一個5′非翻譯先導(dǎo)順序。這一順序可從為表達(dá)基因而選擇的啟動子中得到，并可以特異性地修飾以增加mRNA的翻譯。5′非翻譯區(qū)也可以從病毒RNA、合適的真核基因或合成基因順序得到。
基因插入植物用來實施本發(fā)明的基因可用任何合適的方法插入植物基因組。合適的植物轉(zhuǎn)化載體包括從農(nóng)桿菌的誘瘤質(zhì)粒得到的轉(zhuǎn)化載體，例如文獻(xiàn)所述的載體(Herrera-Estralla，etal.Nature303∶209，1983;Bevan，etal.Nature304∶184，1983;Klee，etal.Bio/Technology3∶637，1985;Fraley，etal.Bio/Technology3∶629，1985;Schilperoort，etal.EPO公告120，516)。除了得自農(nóng)桿菌誘瘤質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體外，也可用其它方法把基因插入植物細(xì)胞。這些方法可以包括，例如，使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增加游離DNA吸收的化學(xué)試劑。用B.t.和胰蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生為表現(xiàn)出增強(qiáng)的昆蟲抗性的完整植株。再生步驟方法的選擇并不重要，對下列宿主都有合適的方案豆科植物(苜蓿、大豆、三葉草等)、傘形科植物(胡蘿卜、油菜等)、葫蘆科植物(甜瓜和黃瓜)、茄科植物(馬鈴薯、煙草、番茄、胡椒)、以及各種開花作物(參見例如Ammirato，etal.HandbookofPlantCellCulture-CropSpecies，1984，MacMillanPubl.Co.)?？梢园凑毡景l(fā)明賦予上述各科植物以昆蟲抗性。
A)胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)基因的構(gòu)建可用多種方法分離和構(gòu)建編碼胰蛋白酶抑制劑的基因。如果已經(jīng)知道整個氨基酸順序或核苷酸順序(如南瓜、馬鈴薯抑制劑)，則該基因可直接通過合成完整基因來構(gòu)建(見下)。如果不知道蛋白和DNA順序，可以制備針對蛋白酶抑制劑的抗體，然后用免疫學(xué)方法篩選cDNA文庫中可產(chǎn)生胰蛋白抑制劑的克隆。此外，也可以用各種不同的方法測定蛋白酶抑制劑的氨基末端氨基酸順序，并用簡并寡核苷酸探針篩選cDNA文庫以檢測含蛋白酶抑制劑基因的克隆(見下面Kunitz型抑制劑克隆的例子)。
利用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的常規(guī)方法，對如上述制備的抑制劑制備物測定蛋白酶抑制劑的N-末端氨基酸順序。例如，可以如上所述純化蛋白酶抑制劑并直接測定其N-末端氨基酸順序。也可以將含有蛋白酶抑制劑的蛋白制備物加到聚丙烯酰胺凝膠上，用電泳法分離蛋白，電洗脫蛋白酶抑制劑條帶并進(jìn)行順序測定。
(ⅰ)在植物中表達(dá)CMTI的合成基因已從南瓜中分離出稱為CMTI的胰蛋白酶抑制劑，并證明它能增強(qiáng)B.t.k.對鱗翅目昆蟲的活性和B.t.t.對馬鈴薯甲蟲的活性。
CMTI的氨基酸順序為RVCPRILMKCKKDSDCLAECVCLEHGYCG根據(jù)這個氨基酸順序，設(shè)計了一個合成基因。這個合成基因的設(shè)計包括主要見于高度表達(dá)的雙子葉植物基因的一些密碼子。該基因是由四個合成寡聚核苷酸合成的。退火并連接后，合成基因的DNA順序為
該基因編碼CMTI蛋白，并與BglⅡ位點(diǎn)鄰接。為在植物中表達(dá)，將該BglⅡ片段連入植物盒式表達(dá)載體如pMON893中，pMON893在增強(qiáng)的CaMV35S啟動子和大豆753′末端之間含有一個BglⅡ位點(diǎn)。為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平，也可采用其它植物啟動子。把這些載體摻入農(nóng)桿菌中并用來轉(zhuǎn)化植物。利用Northern法分析RNA，或用Western或ELISA法分析蛋白質(zhì)，鑒定出表達(dá)CMTI的植物。將表達(dá)該蛋白的植物與表達(dá)B.t.k.或B.t.t.蛋白的植物雜交。鑒定出表達(dá)這兩個基因的子代，它比只表達(dá)B.t.的親本植物顯示出更高水平的殺蟲活性。
此外，也可將CMTI基因?qū)胍粋€植物表達(dá)載體中，該載體含有一個不為卡那霉素抗性的可選擇標(biāo)記，如慶大霉素抗性或潮霉素抗性。用該載體來轉(zhuǎn)化前面鑒定為表達(dá)B.t.k.或B.t.t.的植物。雙轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)出比只表達(dá)B.t.的親本植物更高水平的活性。
另一個利用合成CMTI基因的方案是產(chǎn)生一個CMTI與B.t.k.或B.t.t.的融合蛋白。制備該融合蛋白時可使CMTI處于融合產(chǎn)物的N末端或C末端。如果是B.t.k.，適當(dāng)?shù)娜诤衔稽c(diǎn)可以在C端607位氨基酸后的任一點(diǎn)，或者在N端29位氨基酸尤其是25位氨基酸前的任一點(diǎn)。將抑制劑順序置于25位氨基酸上游可保持B.t.k.順序被昆蟲腸蛋白酶在28和29位氨基酸間切開。保持這一順序?qū)⒛軌蛘_切割融合蛋白中的B.t.k.，這對于昆蟲毒性是必需的。此外，在這一位點(diǎn)進(jìn)行切割將使活化的B.t.k.和CMTI都釋放到昆蟲的腸內(nèi)。如果是B.t.t.，融合蛋白也把CMTI順序置于B.t.t.蛋白的末端而進(jìn)行C末端融合。對N末端B.t.t.融合來說，將CMTI緊置于48位氨基酸的上游(條帶3的氨基末端)將使它能夠象上述的B.t.k.一樣在昆蟲腸內(nèi)被切割而分離出CMTI和B.t.t.。
為了在不同的位點(diǎn)產(chǎn)生這些融合蛋白，需要在合成基因的末端稍作修飾，摻入一些適當(dāng)?shù)捻樞?，使其與B.t.基因融合，而同時又使融合蛋白讀碼保持完整。這些操作既可以通過重新合成用來構(gòu)建基因的寡核苷酸來完成，也可以通過在合成基因的一個克隆的拷貝上進(jìn)行定點(diǎn)誘變而完成。
(ⅱ)cDNA克隆的制備如果已測定了抑制劑蛋白的N末端順序，則可根據(jù)N末端氨基酸順序設(shè)計出合成DNA的簡并寡核苷酸探針。用這些探針借助噬菌斑雜交來篩選cDNA文庫。典型探針的長度為15至30個核苷酸。為減少探針的簡并性，優(yōu)選的氨基酸順序區(qū)應(yīng)由具有最少簡并密碼子的氨基酸組成。一般是用兩個或更多個得自不同蛋白質(zhì)順序區(qū)的探針依次篩選噬菌斑，但用一個探針進(jìn)行篩選也是可行的。與一個探針雜交的噬菌斑則通過與第二個探針雜交進(jìn)行再篩選。對那些與兩個或更多個探針雜交的噬菌斑進(jìn)一步進(jìn)行定性。
為了清楚和簡潔，有關(guān)的方法將參照大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑來說明，這是已知氨基酸順序的抑制劑(見圖1)。相應(yīng)于大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的62至66位氨基酸(TyrArgIlbArgPhe)、114至118位氨基酸(MetAspGlyTrpPhe)和125至130位氨基酸(AspAspGluPheAsnAsn)合成探針。這幾個氨基酸區(qū)的簡并性相對較低。但也可以用其它一些區(qū)域來設(shè)計探針。相應(yīng)于這些區(qū)域的簡并探針為
TAYAGRATHAGRTTY62至6615聚體48倍簡并TyrArgIleArgPheATGGAYGGNTGGTTY114至11815聚體16倍簡并MetAspGlyTrpPheGAYGAYGARTTYAAYAAY125至13018聚體64倍簡并AspAspGluPheAsnAsn其中Y＝C或TR＝A或GH＝A或C或TN＝A或G或C或T由表達(dá)高水平Kunitz型抑制劑的組織構(gòu)建一個cDNA文庫。適當(dāng)?shù)膩碓唇M織是未成熟的種子、未成熟的胚或成熟中期的子葉。
(1)多聚AmRNA如Goldberg(1981)所述，從來源組織中分離總RNA。如Depicker(1982)所述，用一個CsCl墊進(jìn)一步沉降總RNA。利用寡聚dT纖維素層析選擇多聚AmRNA。
(2)RNA的凝膠處理用乙醇沉淀來源組織的10μg多聚A RNA，并再懸浮于含50%甲酰胺和2.2M甲醛的1×MOPS緩沖液中(20mM嗎啉代丙磺酸，pH7.0，5mM乙酸鈉和1mM EDTA，pH8.0)。于65℃下加熱10分鐘使RNA變性。然后加入五分之一體積的上樣緩沖液，其中含有50%甘油、1mM EDTA、0.4%溴酚藍(lán)和0.4%二甲苯苯胺。在含有1.1M甲醛的1.3%瓊脂糖凝膠上分級分離RNA，直到溴酚藍(lán)接近底部。用經(jīng)HaeⅢ消化的、32P標(biāo)記的φ×174DNA作分子量標(biāo)準(zhǔn)。DNA標(biāo)記指示了RNA條帶的近似分子量。
(3)RNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素用20×SSC(1×SSC為0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)作轉(zhuǎn)移緩沖液，通過吸印凝膠過夜而將RNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(＃BA85，SchleicherandSchuell，Keene，NH)。轉(zhuǎn)移后，將濾膜風(fēng)干，并在80℃真空爐中烘2-3小時。
(4)與放射性探針預(yù)雜交在6×SSC、10×Denhardt′s溶液(1×Denhardt′s溶液為0.02%聚蔗糖、0.02%聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清清蛋白)、0.5%NP-40和200μg/ml大腸桿菌轉(zhuǎn)移RNA中，使濾膜在50℃下預(yù)雜交4小時。于32℃下，在含有2×106cpm/ml所選探針的新鮮溶液中進(jìn)行雜交48小時。每種情況下所用的雜交溫度(32℃)，都比計算的GC含量最低的寡核苷酸混合物的解離溫度(Td)低約10℃。探針的Td由下式估算2℃×(A+T)+4℃×(G+C)。
(5)濾膜洗滌在室溫下，用6×SSC洗滌濾膜兩次15-20分鐘，然后在37℃下洗滌5分鐘并輕輕振蕩。然后把濾膜包上膠片，加兩個增感屏在-70℃下放射自顯影12-14小時。這便能測定蛋白酶抑制劑mRNA的大小和含量。
B.λgt10cDNA文庫的制備(1)所用的材料AMV反轉(zhuǎn)錄酶可從SeikagakuAmerica公司(St.Petersburg，F(xiàn)lorida)購得;DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow聚合酶)購自NewEnglandNuclear(Boston，MA);S1核酸酶和tRNA購自SigmaChemical(St.Louis，MO);AcA34柱床樹脂購自LKB(Gathersburg，MD);EcoRI、EcoRI甲基化酶和EcoRI連接子購自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA);RNasin(核糖核酸酶抑制劑)購自PromegaBiotech(Madison，WI);放射性化合物購自Amersham(ArlingtonHts.，IL)。
λgt10載體(ATCC40179)具有三個重要特點(diǎn)(1)它具有一個獨(dú)特的EcoRI插入位點(diǎn)，因此在插入新DNA前不需要從該噬菌體DNA中除去中心部分的DNA;(2)可以用此載體克隆大小為0至約8，000堿基的DNA;(3)可以用此載體克隆一個文庫，如MA150細(xì)胞(ATCC53104)，以除去不含DNA插入片段的克隆。
(2)cDNA第一條鏈的合成如上所述制備多聚A mRNA，并將其再懸浮于50mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl2、4mM DTT、40mM KCl、500μM d(AGCT)TP、10μg/ml dT12-18引物和27.5單位/ml RNA酶抑制劑中。在120μl的反應(yīng)體積中，每5μg多聚A RNA加入70單位反轉(zhuǎn)錄酶。一個反應(yīng)管中含有α-32P-dCTP(5μCi/120μl反應(yīng)物)。為破壞mRNA的二級結(jié)構(gòu)，將mRNA在水中于70℃保溫3分鐘，然后把反應(yīng)管置于冰上冷卻。加入反轉(zhuǎn)錄酶，在42℃下進(jìn)行cDNA合成60分鐘。加入EDTA至50mM終止反應(yīng)。在反應(yīng)開始和60分鐘后取樣用TCA沉淀法檢查cDNA的生成。cDNA合成后，cDNA以cDNA-RNA雜交分子形式存在。在沸水浴中加熱該混合物1.5分鐘使cDNA-RNA雜交分子變性，然后在冰上冷卻。
(3)第二條鏈的合成和甲基化在Savant真空干燥器中將第一條鏈干燥至約10μl。
體積物質(zhì)終濃度/量3.8μlcDNA～500ng第一條鏈10μl10×第二條鏈緩沖液1×0.8μl5mMdNTP各40μM81.5μl水加至終體積為100μl2μlDNA聚合酶Ⅰ(NEB)20單位0.4μl大腸桿菌DNA連接酶(NEB)2單位0.5μlRNA酶H(BRL)1單位3μl32P dCTP 30μCi1μlBSA(BRL，1∶10稀釋)50μg/mlNEB＝NewEnglandBiolabs，Beverly，MA.
BRL＝BethesdaResearchLabs，Gaithersberg，MD.
將反應(yīng)物在14℃下保溫60分鐘，然后在室溫下保溫60分鐘。
加入下列物質(zhì)0.5μl5mMdNTP1μl T4DNA聚合酶(NEB)將反應(yīng)物在室溫下保溫30分鐘。
加入下列物質(zhì)1.2μl1mMS-腺苷基12μML-甲硫氨酸(Sigma)1.0μlEcoRI甲基化酶(NEB)20單位2.4μl0.5MEDTA12mM取5μl反應(yīng)液加到260ng野生型λDNA(NEB)中作為甲基化反應(yīng)的對照。
將反應(yīng)物在37℃下保溫45分鐘。
將主要反應(yīng)和試驗反應(yīng)在68℃下加熱10分鐘使酶失活。
10×第二條鏈緩沖液200mMTris-HClpH7.4-7.51M貯液50mM MgCl21M貯液1.0MKCl4M貯液100mM硫酸銨1M貯液1.5mMβ-NAD150mM貯液測定甲基化反應(yīng)的完全性將下列物質(zhì)加入經(jīng)熱處理的試驗甲基化反應(yīng)液中2μl 100mM Tris-HCl pH7.6/100mM MgCl2/1.0NaCl12μl水
1μlEcoRI(20單位BRL)0.5μlpUC19(0.5μg，NEB)將反應(yīng)物在37℃下保溫1小時。產(chǎn)物在瓊脂糖微凝膠上進(jìn)行電泳，用未消化的pUC19和用EcoRI和HindⅢ消化的λ作為分子量標(biāo)記。反應(yīng)中的pUC19應(yīng)消化完全，表明EcoRI有效地發(fā)揮了作用;λDNA應(yīng)保持完全未消化，表明它已由于甲基化反應(yīng)而受到保護(hù)。這證明甲基化酶有效地阻斷了cDNA中的EcoRI位點(diǎn)，使其不被消化。
(5)將EcoRI連接子加入cDNA為了將雙鏈cDNA插入λgt10的EcoRI位點(diǎn)，在甲基化反應(yīng)后將平末端EcoRI連接子加到雙鏈cDNA中。將雙鏈cDNA與磷酸化的平末端EcoRI連接子混合。該連接子是合成8聚體p(dGGAATTCC)的自身退火混合物。一般采用的連接子的摩爾數(shù)至少比雙鏈cDNA過量10倍。連接子和cDNA的連接在20μl反應(yīng)液中進(jìn)行，該反應(yīng)液中含有10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT，以及足量的T4DNA連接酶以確保反應(yīng)至少90%完全。反應(yīng)液在14℃下保溫過夜。加入連接子后，用EcoRI切割該連接子使它能夠連接到EcoRI切割的λgt10中。
(6)λgt10克隆的組裝將雙鏈cDNA與1μg經(jīng)EcoRI切割的λgt10 DNA混合，用乙醇沉淀后離心。沉淀用70%乙醇洗滌一次，然后將DNA沉淀風(fēng)干并再懸浮于4.5μl 10mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、50mM NaCl中。為了將cDNA插入片段退火并連接至λgt10 DNA的左右臂上，將混合物在70℃下加熱3分鐘，然后在50℃下加熱15分鐘。將混合物置冰上冷卻，加入各0.5μl的10mM ATP、0.1M DTT和足以確保反應(yīng)至少90%完全的T4DNA連接酶。將反應(yīng)物在14℃下保溫過夜，使雙鏈cDNA插入λgt10 DNA的EcoRI位點(diǎn)。將所得DNA用Scherer(1981)所述方法體外包裝入噬菌體顆粒中。
(7)除去不帶插入片段的噬菌體cDNA插入λgt10的EcoRI位點(diǎn)導(dǎo)致C1基因失活。帶有失活的C1基因(即帶有插入片段)的λgt10噬菌體在大腸桿菌MA150細(xì)胞中正常復(fù)制。相反，不帶插入片段的λgt10噬菌體不能在大腸桿菌MA150菌株中復(fù)制。這便提供了一種除去不帶插入片段的λgt10克隆的方法。
文庫中的噬菌體首先在大腸桿菌C600(M+R-)細(xì)胞中復(fù)制，該細(xì)胞對λgt10DNA進(jìn)行修飾，從而保護(hù)它不受大腸桿菌MA150限制系統(tǒng)的作用。感染一定數(shù)目的大腸桿菌C600細(xì)胞，然后與過量20倍的MA150(M+R-)細(xì)胞一起鋪平板。這樣，M+R-細(xì)胞發(fā)生初次感染，所有噬菌體都將在其中生長，但MA150細(xì)胞中發(fā)生的連續(xù)的幾輪復(fù)制卻阻止了不帶插入片段的噬菌體的復(fù)制。從平板中收集擴(kuò)增后的噬菌體文庫，離心除去瓊脂和其它污染物后，重組噬菌體便可用于篩選實驗。
(8)cDNA文庫的篩選將約6000個噬菌體(每平板)鋪在10cm×10cm方形固體NZY瓊脂(含0.7%瓊脂糖)平板上，平板中含有生長于其上的大腸桿菌MA150細(xì)胞的半透明菌苔(Maniatis，1982)。噬菌體感染并殺死大腸桿菌細(xì)胞的區(qū)域由稱為“噬菌斑”的清晰區(qū)顯現(xiàn)出來，這些噬菌斑在平板于37℃下保溫過夜后就能在菌苔襯托下見到。以此方式制備若干平板。用預(yù)先剪好的硝酸纖維素濾膜壓噬菌斑約30分鐘。這就形成了噬菌斑的對稱印跡。為了固定噬菌體DNA，將濾膜用0.5M NaOH和2.5M NaCl處理5分鐘。然后將濾膜依次用1.0M Tris-HCl(pH7.5)和含2.5M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH7.5)處理以中和NaOH。然后把濾膜放在氯仿中浸泡以除去細(xì)菌碎片。然后風(fēng)干并于80℃下真空烘2小時，再使其冷卻至室溫。然后如前述使濾膜與32P標(biāo)記的抑制劑探針(2×106cpm/濾膜)雜交。雜交48小時后，濾膜在室溫下用6×SSC洗兩次20分鐘，然后在37℃下洗滌5分鐘。這些洗滌操作除去了非特異結(jié)合的探針分子，而具有確切的相應(yīng)順序的探針分子則結(jié)合在濾膜上的噬菌體DNA上。最后一次洗滌后，用放射自顯影法分析濾膜。從平板中取出線放射自顯影測定給出陽性雜交信號的噬菌斑，以100-200個噬菌斑/平板的密度重新鋪在新鮮平板上。用上述方法篩選這些平板。選擇出陽性雜交噬菌體。從每個克隆中分離DNA，并用EcoRI消化以測定cDNA插入片段的大小。
對那些cDNA插入片段的大小根據(jù)上面測定的mRNA的大小而判斷為全長cDNA大小的噬菌體進(jìn)行進(jìn)一步的分析。利用瓊脂糖凝膠電泳純化出相應(yīng)于cDNA插入片段的EcoRI片段，從凝膠中回收DNA。將cDNA插入片段插入線狀噬菌體載體如M13mp18的EcoRI位點(diǎn)。對插入的cDNA的末端進(jìn)行DNA順序分析。插入片段的兩個末端的順序都進(jìn)行測定。將該DNA順序與蛋白酶抑制劑的已知N末端氨基酸順序作比較，確定翻譯起始密碼子的位置。測定足夠的DNA順序以進(jìn)一步確定蛋白酶抑制劑編碼順序末端的位置。
(9)蛋白酶抑制劑的植物表達(dá)載體的構(gòu)建改造蛋白酶抑制劑的cDNA，使限制位點(diǎn)的位置剛好鄰接編碼順序。一般是采用BglⅡ位點(diǎn)。如下所述，通過寡核苷酸指導(dǎo)的誘變把這些位點(diǎn)引入cDNA。以BglⅡ片段分離出改造后的編碼順序，并將其插入盒式表達(dá)載體如pMDN316(見圖2)的BglⅡ位點(diǎn)，從而把cDNA置于植物啟動子如CaMV35S的控制下。采用多種啟動子如NOS、MAS、或CaMV35S，提供了一種在轉(zhuǎn)化植物中獲得不同水平的蛋白酶抑制劑的手段。
C.B.t.毒素結(jié)構(gòu)基因的構(gòu)建(1)鞘翅目型B.t.毒素在Trypsticase Soybroth(TSB)培養(yǎng)基中培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌黃粉 亞種，以分離蛋白晶體。鱗翅目型晶體可以用常規(guī)方法在由Renografin、Hypaque或NaBr形成的梯度上分離，但B.t.t.晶體卻溶于這些梯度介質(zhì)。B.t.t.晶體在蔗糖梯度中穩(wěn)定，因此用蔗糖梯度來分離B.t.t.晶體。
利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析純化的晶體的蛋白組成。這些實驗的結(jié)果表明，B.t.t.晶體中含有至少兩種蛋白成分，其分子量分別約為68-70千道爾頓(KDa)和60KDa。這兩個成分的相對含量在每次制備中各不相同。此外，有人認(rèn)為分子量較高的成分可能由不止一種蛋白組成。Bernhard(1986)報導(dǎo)了約68KDa和50KDa的蛋白為B.t.t.晶體的成分。Herrnstadt等人(1986)報導(dǎo)了蘇云金芽孢桿菌圣地亞哥變種的晶體由一種約64KDa的蛋白組成。相反，鱗翅目型B.t.菌株如戈爾斯德亞種，一般含有一種分子量較高的蛋白(130KDa至140KDa)。這個結(jié)果表明，鱗翅目和鞘翅目毒素蛋白的結(jié)構(gòu)明顯不同。
采用若干方法來純化晶體中的各個蛋白成分。等電聚焦不行，因為所有蛋白都沉淀。在MonoQ柱上進(jìn)行陰離子交換高壓液相層析(HPLC)不能分辨各成分。在4M脲存在下用MonoS柱進(jìn)行陽離子交換HPLC分辨出五個峰。利用SDS凝膠電泳分析各峰，表明峰A只含有全部晶體中的高分子量條帶。峰B富含此高分子量條帶，并有少量低分子量條帶。峰C富含低分離條帶，并有大量上部條帶。峰D和E為兩條帶的混合物。在多數(shù)制備物中，相應(yīng)于峰A和B的高分子量條帶是晶體中的主要蛋白。就HPLC所分離出的物質(zhì)而言，峰A和B占回收蛋白的一多半。
測定相應(yīng)于峰A和B的N末端氨基酸順序。發(fā)現(xiàn)峰A和B具有相同的N末端順序。所測定的順序為峰A和B151015Met Asn Pro Asn Arg Ser Glu His Asp Thr Ile Lys Thr Thr利用這個N末端蛋白順序信息，設(shè)計合成DNA探針用于分離含B.t.t.毒素基因的克隆。按Maniatis(1982，同上)的方法用〔γ-32P〕ATP對探針進(jìn)行末端標(biāo)記。在37℃下將B.t.黃粉 變種培養(yǎng)6小時以分離總DNA，培養(yǎng)基為添加有0.1%酵母抽提物和0.1%葡萄糖的Spizizen培養(yǎng)基(Spizizen，J.，P.N.A.S.USA 441072-1078，1958)(SPY)。利用Kronstad(1983，同上)的方法，從B.t.t.中分離總DNA。在Luria瓊脂平板上培養(yǎng)細(xì)胞，以分離用于毒性研究的B.t.t.晶體。
用常規(guī)方法在LuriaBroth(LB)中培養(yǎng)大腸桿菌培養(yǎng)物，培養(yǎng)基中加入了氨芐青霉素(Ap，200μg/ml)、卡那霉素(Km，50μg/ml)或慶大霉素(Gm，15μg/ml)，以利于質(zhì)粒的選擇和保留。
DNA的分離和操作利用Birnboim和Doly的方法(Nucleic Acid Res.71513-1524，1979)，從大腸桿菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，并利用MACS-52樹脂(BRL)按廠商說明進(jìn)行大量純化。限制性核酸內(nèi)切酶、小牛堿性磷酸酯酶和T4DNA連接酶都按廠商說明(NEB)使用。在0.8%瓊脂糖凝膠上用Tris-乙酸緩沖液進(jìn)行電泳，分析限制性消化產(chǎn)物。用凍融法從瓊脂糖中純化出用于克隆的DNA片段。按照Maniatis(1982，同上)的方法構(gòu)建重組DNA分子。按Maniatis(1982，同上)的方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中。
利用修改的干燥凝膠法(Conner等人，1983)進(jìn)行Southern分析(J.Mol.Biol.98503-507，1975)。為檢測B.t.t.毒素克隆而進(jìn)行的菌落濾膜雜交則采用氯化四甲銨法(Woodetal.，P.N.A.S.USA851585-1588，1985)。
將BamHⅠ和HindⅢ消化的B.t.t.總DNA進(jìn)行Southern分析，鑒定出與合成A1探針雜交的5.8kbBamHⅠ片段和3.0kbHindⅢ片段。用瓊脂糖凝膠純化出B.t.t.DNA的BamHⅠ片段，并將其連接到經(jīng)堿性磷酸酯酶處理的、BamHⅠ消化的pUC119上。pUC119的制備方法是分離出噬菌體M13的476bpHgiAI/DraⅠ片段，并用T4DNA聚合酶(NEB)修平該片段的兩個末端。然后將此片段插入已用NdeI消化并用Klenow DNA聚合酶(NEB)填平的pUC19中。然后用連接后的B.t.t.和pUC119 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM101細(xì)胞。經(jīng)過幾次努力，只得到150個Ap抗性菌落。此外還將B.t.t.DNA的HindⅢ片段(2.8-3.5kb)克隆到pUC119的HindⅢ位點(diǎn)中，獲得1100個菌落。利用菌落與基于1-6位氨基酸的A1探針的雜交篩選所有菌落。
A1探針ATGAATCCTAATAATCGCCCCAG有十一個HindⅢ克隆表現(xiàn)出強(qiáng)雜交，但沒有一個BamHⅠ菌落表現(xiàn)出任何雜交。然后利用基于8-13位氨基酸的合成A2探針篩選通過與A1雜交鑒定出的菌落。
A2探針GAACATGATACAATTAAGCCGCA有兩個菌落表現(xiàn)出與第二個探針的雜交。這兩個菌落的限制性消化圖譜表明，它們都含有同樣的3.0kbHindⅢ片段，但取向相反。這些克隆定名為pMON5420和pMON5421。為證實這兩個克隆確實含有B.t.t.毒素蛋白基因，利用簡便的探針A1和A2作引物進(jìn)行雙脫氧測序，測定這兩個克隆的單鏈DNA的順序(Sanger，etal.，P.N.A.S.USA745463-5467，1977)。用A1探針作引物所做的順序分析揭示出一個開放讀碼(ORF)，其順序與對純化的B.t.t.毒素蛋白峰A和峰B所測定的氨基酸順序的9至15位氨基酸相同。用A2探針得出的DNA順序起始于所測的氨基酸順序的末端之外，但此DNA順序與用A1探針得出的順序相同。這些結(jié)果證實了所要的B.t.t.毒素基因被克隆。
對pMON5420中所含的B.t.t.毒素基因進(jìn)行修飾以摻入植物表達(dá)載體中。參見圖7，利用Kunkel的位點(diǎn)特異性誘變方案(P.N.A.S.USA82488-492，1985)，將一個BglⅡ位點(diǎn)引入緊靠ATG密碼子上游，該密碼子確定了全長的B.t.t.毒素蛋白(稱為條帶1)的翻譯起始。B.t.t.毒素基因在起始密碼子ATG區(qū)的順序為ATGATAAGAAAGGGAGGAAGAAAAATGAATCCGAACAATCGAAGTGAACATGATACAATAMetAsnProAsnAsnArgSerGluHisAspThrIle此誘變的引物(bttbgl)為27個核苷酸長，其順序為CGGATTCATTTTAGATCTTCCTCCCTT誘變后，用BglⅡ消化鑒定出含有新的BglⅡ位點(diǎn)的質(zhì)粒，并利用DNA順序分析確證這一變化。所得質(zhì)粒含有帶新BglⅡ位點(diǎn)的B.t.t.毒素基因，定名為pMON9758。
將pMON9758中的B.t.t.毒素基因插入盒式表達(dá)載體pMON316中(Sanders，etal.，NucleicAcidsRes.151543-1558，1987)。pMON316含有CaMV35S啟動子和胭脂堿合酶(NOS)基因的3′端，并帶有一個BalⅡ位點(diǎn)可供在這兩個成分中間插入基因。用BglⅡ消化質(zhì)粒pMON9758，分離出一個約2.3kb的片段。此片段由緊靠ATG密碼子上游的BglⅡ位點(diǎn)延伸至距B.t.t.毒素基因的終止密碼子下游約350bp處的BglⅡ位點(diǎn)。因此，此片段含有B.t.t.基因的完整編碼順序，以及從非編碼順序3′端到終止密碼子的約350bp。將此BglⅡ片段與BglⅡ消化的pMON316連接。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中后，鑒定出一個菌落，其中B.t.t.毒素基因被插入到pMON316中，使得毒素基因的5′端與CaMV35S啟動子相鄰。此質(zhì)粒定名為pMON9753。分離出一個在pMON316中含有B.t.t.毒素基因但取向相反的質(zhì)粒，定名為pMON9754。
利用三親本雜交法，將pMON9753和pMON9754都導(dǎo)入含去致瘤力Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌ASE菌株中。利用Fraley等人所述的方法(Bio/Technology，3629-635，1985)，鑒定出pMON9753或pMON9754與去致瘤力Ti質(zhì)粒的共合體，并通過農(nóng)桿菌總DNA的Southern分析證實它們的結(jié)構(gòu)。
pMON9753含有終止密碼子之外的約400bp3′非編碼順序。由于此區(qū)域并非產(chǎn)生毒素所必需，所以將它從插入pMON893的B.t.t.毒素基因片段中除去。為產(chǎn)生一個不含3′鄰接順序的B.t.t.毒素基因，利用Kunkel的方法(P.N.A.S.USA，82488-492，1985)，將一個BglⅡ位點(diǎn)引入緊靠終止密碼子之后。終止密碼子附近的B.t.t.毒素基因的順序為GTTATATAGACAAAATTGAATTTATTCCAGTGAATTAAATTAACTAGAAAGTAAAGAAGValTyrIleAspLysIleGluPheIleProValAsnEnd用具有下列順序的引物(B.t.t.C末端)進(jìn)行誘變CTTTCTAGTTAAAGATCTTTAATTCACTG
在pMON9758中進(jìn)行B.t.t.毒素基因的誘變。將含有新BglⅡ位點(diǎn)的質(zhì)粒定名為pMON9787(圖12)。由于pMON9787在緊靠ATG起始密碼子上游處含有一個BglⅡ位點(diǎn)，所以在約1940bp的BglⅡ片段上含有整個B.t.t.毒素基因編碼順序，并基本上不帶5′或3′鄰接順序。
從pMON9787中分離出這個1940bp片段，將其與經(jīng)BglⅡ消化的pMON893連接。鑒定出一個質(zhì)粒，其中B.t.t.毒素基因的5′端與增強(qiáng)的CaMV35S啟動子相鄰。將該質(zhì)粒定名為pMON9791(圖12)。
參見圖13，表達(dá)盒pMON893由增強(qiáng)的CaMV35S啟動子和包括一些多聚腺苷酸化信號在內(nèi)的3′端組成，所述多聚腺苷酸化信號來自編碼β-conglycininα′亞基的大豆基因(以下稱為“7S基因”)。在pMON893的上述兩個組成成分之間，是一個含有多個可供基因插入的限制位點(diǎn)的多連接子。
如下構(gòu)建增強(qiáng)的CaMV35S啟動子。以前，Odell等人(Nature313810-812，1985)曾在pUC13中構(gòu)建出位于-343和+9位之間的CaMV35S啟動子片段。此片段含有一個被Odell等人鑒定為CaMV35S啟動子的最大表達(dá)所必需的區(qū)域。把它作為ClaⅠ-HindⅢ片段切下，用DNA聚合酶I(Klenow片段)將其修成平末端，然后插入pUC18的HincⅡ位點(diǎn)。從該質(zhì)粒中切下35S啟動子的上游區(qū)，為一個HindⅢ-EcoRV片段(從-343到-90)。將其插入同樣質(zhì)粒的HindⅢ和PstⅠ位點(diǎn)之間。這樣，增強(qiáng)的CaMV35S啟動子便在-343位和-90位之間含有重復(fù)順序(見圖14)。
7S基因的3′端得自定名為17.1的克隆上所含的7S基因(Schuler，etal.，NucleicAcidsResearch108225-8244，1982)。這個含有多聚腺苷酸化信號的3′端片段，從位于克隆17.1中的β-conglycinin基因終止密碼約30bp處的AvaⅡ位點(diǎn)，延伸至位于該終止密碼子下游約450bp處的EcoRI位點(diǎn)。
pMON893的其余部分含有pBR322的一個片段，該片段提供在大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)和可供與去致瘤力T-DNA在農(nóng)桿菌ACO菌株中同源重組的區(qū)域;廣宿主范圍質(zhì)粒RK2的oriV區(qū);Tn7的鏈霉素抗性/壯觀霉素抗性基因;以及含有CaMV35S啟動子和胭脂堿合酶(NOS)3′端的嵌合NPTⅡ基因，它在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞刑峁┛敲顧乜剮浴 在大腸桿菌中可由第二個甲硫氨酸起始密碼子產(chǎn)生全長B.t.t.毒素的變異體。已發(fā)現(xiàn)這個稱為“條帶3”的蛋白和全長毒素(“條帶1”)一樣對馬鈴薯甲蟲有毒。有可能象B.t.k.基因的情況一樣，截短形式的B.t.t.基因可能更易于在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。因此，構(gòu)建了一個修飾的B.t.t.毒素基因，在其中除去了條帶3ATG密碼子上游的區(qū)域。為除去這一順序，利用Kunkel(1985)的方法，將一個BglⅡ位點(diǎn)插入到緊靠條帶3ATG的上游。條帶3ATG附近的順序為CCAAATCCAACACTAGAAGATTTAAATTATAAAGAGTTTTTAAGAATGACTGCAGATAATProAsnProThrLeuGluAspLeuAsnTyrLysGluPheLeuArgMetThrAlaAspAsn用具有下列順序的引物(B.t.t.N末端)進(jìn)行誘變ATCTGCAGTCATTGTAGATCTCTCTTTATAATTT
用這個引物在pMON5420中所含的B.t.t.毒素基因上進(jìn)行誘變。含有新BglⅡ位點(diǎn)的質(zhì)粒定名為pMON9788。截短的B.t.t.毒素基因起始于條帶3BglⅡ位點(diǎn)，延伸至遠(yuǎn)離pMON9787中的終止密碼子的BglⅡ位點(diǎn)。該基因在pMON893中的構(gòu)建如下。用BglⅡ和XbaⅠ消化的pMON9788(圖15)，分離出一個約1250bp的片段。此片段從條帶3ATG延伸至B.t.t.毒素基因中間的獨(dú)特XbaⅠ位點(diǎn)。將pMON9787也用BglⅡ和XbaⅠ消化，分離出一個約550bp的片段。此片段從毒素基因中間的獨(dú)特XbaⅠ位點(diǎn)延伸至遠(yuǎn)離終止密碼子的BglⅡ位點(diǎn)。將這兩個片段混合起來并與BglⅡ消化的pMON893連接。鑒定出一個質(zhì)粒，其中毒素基因的5′端與增強(qiáng)的CaMV35S啟動子相鄰，該質(zhì)粒定名為pMON9792。pMON9792含有B.t.t.毒素基因的N末端截短衍生物(圖15)，它只編碼條帶3。
將pMON9791和pMON9792都導(dǎo)入含有去致瘤力Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌ACO菌株中。已選擇出共合體并用來轉(zhuǎn)化蕃茄和馬鈴薯。
ACO是一個類似于Fraley等人所述的pTiB6SE(Bio/Technology3625-635，1985)的去致瘤力菌株。構(gòu)建ACO的起始農(nóng)桿菌菌株為含有胭脂堿型Ti質(zhì)粒的A208菌株。以類似于Fraley等人所述的方式使Ti質(zhì)粒去致瘤力，這樣便去掉了基本上所有的天然T-DNA，只保留了左邊界和左邊界內(nèi)幾百個堿基對的T-DNA。其余的延伸到右邊界外某點(diǎn)的T-DNA被一段新DNA代替，這段DNA包括(從左至右)一段pBR322、質(zhì)粒RK2的oriⅤ區(qū)、Tn601的卡那霉素抗性基因。pBR322和oriⅤ片段與pMON893中的某些片段相似，這兩個片段為形成共合體提供了一個同源區(qū)。ACOTi質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示于圖16。
(2)鱗翅目型B.t.毒素編碼蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白的DNA順序的分離方法在技術(shù)上是公知的。上面鑒定的B.t.亞種的編碼順序同源性很強(qiáng)，尤其是在編碼順序的N末端區(qū)?？衫眠@種同源性來分離其它毒素蛋白編碼順序，因為用于分離如下所述的B.t.戈爾斯德HD-1亞種的DNA探針也能用于分離其它亞種的毒素編碼順序。
(ⅰ)B.t.戈爾斯德HD-1亞種按照Hunkapiller等人的方法(Methods Enzymol.91399-413，1983)，部分測定從蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德HD-1亞種中分離出的晶體蛋白毒素的氨基酸順序。利用Wong等人公開的晶體蛋白基因NH2末端部分的DNA順序(J.Biol.Chem.2581960-1967，1983)驗證這些順序。按照Beaucage等人的方法(Tetrahedron Lett.221859，1981;此外請參看Adams，S.P.et al.JACS，105661-663，1983)，根據(jù)從晶體蛋白多肽測得的氨基酸順序，制備合成寡核苷酸順序。制得的寡核苷酸探針如下面的表Ⅰ所示。
表Ⅰ合成寡核苷酸探針大小探針順序B.t.蛋白的區(qū)域14-聚體TGGGGACCGGATTC1200bp區(qū)14-聚體 GAA AGA ATA GAA AC-＊27-31 氨基酸區(qū)21-聚體 CCT GAA GTA GAA-＊19-25 氨基酸區(qū)GTATTAGGT＊從NH2末端編號按照Kronstad等人的方法(J.Bacteriol.154419-428，1983)，從1-2升培養(yǎng)物中純化出蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德HD-1亞種的質(zhì)粒DNA。所有質(zhì)粒制備物都至少一次在CsCl/溴化乙錠梯度中形成條帶。優(yōu)先分離大小為30兆道爾頓和更大的質(zhì)粒。
按照供貨商(BoehringerMannheim)推薦的條件進(jìn)行限制酶EcoRI、PstI、HindⅢ、BamHI和SmaI的水解反應(yīng)。用大腸桿菌JM101菌株(Messingetal.NucleicAcidsResearch9309-321，1981)和SR-200菌株作轉(zhuǎn)化步驟的受體。按標(biāo)準(zhǔn)方法(Dagertatal.Gene623，1979)制備感受態(tài)細(xì)胞。把用質(zhì)粒pUC8轉(zhuǎn)化的菌落涂布在加有100μg/ml氨芐青霉素和40μl4%5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的L-瓊脂上。
按照Southern方法(J.Molec.Biol.98503-517，1975)將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。于37℃下將硝酸纖維素濾膜與轉(zhuǎn)移至其上的結(jié)合DNA一起保溫2-4小時進(jìn)行預(yù)雜交，預(yù)雜交在預(yù)雜交液、10×Denhardt′s(0.2%BSA、0.2%聚蔗糖、0.2%聚乙烯吡咯烷酮)和6×SSC(0.9MNaCl、0.09M檸檬酸鈉)中進(jìn)行。進(jìn)行雜交時，將硝酸纖維素濾膜與10-11ml預(yù)雜交流和標(biāo)記的探針一起保溫8-10小時。用6×SSC在逐漸升高的溫度下(30-45℃)洗滌幾次后，將濾膜對X-光膠片曝光。
將用堿性磷酸酯酶(Boehringer Mannheim)處理過的BamHI限制的pBR328(100ng)與500ng用BamHI限制的蘇云金芽孢桿菌質(zhì)粒DNA混合并連接。借助氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化并選擇用CaCl2制備的感受態(tài)大腸桿菌SR200，并篩選對四環(huán)素敏感的細(xì)胞。用微量質(zhì)粒制備法(Maniatis et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，396，1982，Cold Spring Harbor，N.Y.)進(jìn)行分析，鑒定出兩個具有正確16kb插入片段的克隆。用表Ⅰ的放射標(biāo)記探針進(jìn)行Southern雜交分析，證明含有與合成探針雜交的順序的DNA片段已被亞克隆。這兩個質(zhì)粒定名為pMAP1和pMAP2，它們的區(qū)別僅在于DNA片段在載體中的取向不同。在按照Western吸印法(Geshoni et al.Anal.Biochem.1311-15，1983)進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，這些質(zhì)粒構(gòu)建體產(chǎn)生與B.t.晶體蛋白毒素抗體交叉反應(yīng)的物質(zhì)。制作所插入的B.t.片段的限制圖譜，有四個EcoRI(E)位點(diǎn)和三個HindⅢ(H)位點(diǎn)位于兩個BamHI(B)位點(diǎn)之間。這可用簡圖表示如下
含有pMAP2的大腸桿菌SR200菌株已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852USA，以下稱為“ATCC”)，指定的登記號為ATCC39800。
將pMAP2從制備性瓊脂糖凝膠電洗脫到按制造商(SchleicherandSchuell，Keene，NH03431)說明使用的DEAE膜上，從而用BamHI-PstI消化pMAP2，然后分離出一個8.1kbBamHI-PstI片段。用質(zhì)粒pUC8亞克隆攜帶B.t.基因的pMAP2的BamHI-PstI片段。將用BamHI和PstI消化的pUC8與純化的8.1kbBamHI-PstI片段連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101。根據(jù)氨芐青霉素抗性和β-半乳糖苷酶活性的缺乏選擇轉(zhuǎn)化體。分離出一個克隆，證實它含有所要的質(zhì)粒。此構(gòu)建體定名為pMAP3。含pMAP3的大腸桿菌JM101菌株已保藏在ATCC，指定的登記號為ATCC39801。
通過缺失SmaI-HpaI片段，使pMAP3的蘇云金芽孢桿菌的DNA插入片段從8.1kb減少到4.6kb。用SmaI和HpaI限制酶消化通過CsCl梯度離心而純化出的質(zhì)粒pMAP3DNA，并重新連接。用得到的DNA片段轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM101細(xì)胞。利用微量質(zhì)粒制備物的瓊脂糖電泳篩選氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。鑒定出一個克隆，其中所含的質(zhì)粒具有預(yù)期的DNA限制酶切圖譜。此構(gòu)建體定名為pMAP4。
為制備編碼B.t.毒素蛋白的嵌合基因，將一個NcoI位點(diǎn)引入編碼B.t.毒素的DNA的翻譯起始密碼子(ATG)處，使ATG密碼子包含在NcoI識別位點(diǎn)(CCATGG)內(nèi)。對起始密碼子附近的毒素基因區(qū)進(jìn)行DNA順序分析，揭示出如下的順序5′-GAGATGGAGGTAACTTATGGATAACAATCCGA-3′MetAspAsnAsnPro為引入所需的NcoI位點(diǎn)，需要將ATG附近的順序從TTATGG改變?yōu)镃CATGG。參見圖3，將含有翻譯起始區(qū)的340bpDraI-EcoRI片段從pMAP4亞克隆到線狀噬菌體載體M14mp8的SmaI位點(diǎn)和EcoRI位點(diǎn)之間。該質(zhì)粒定名為pMON9732。該構(gòu)建體的單鏈?zhǔn)删wDNA含有毒素基因順序的非編碼鏈。
利用Zoller和Smith的方法(MethodsEnzymol.100468-500，1983)，在上述構(gòu)建體的單鏈DNA上進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變，利用具有如下順序的合成寡核苷酸作引物5′-GAGATGGAGGTAACCCATGGATAACAATCC-3′誘變后，利用NcoI消化鑒定出一個含有所需突變的克隆。通過DNA順序分析證實NcoI位點(diǎn)的存在。此克隆定名為pMON9733。
構(gòu)建一個完整的毒素基因，該基因由上述位點(diǎn)特異性誘變摻入了NcoI位點(diǎn)。參見圖4，用BamHI和ClaI消化pMAP4，分離出一個含有pUC8載體和毒素基因的片段，該基因從1283位的ClaI位點(diǎn)到該基因末端之外的PstI位點(diǎn)。從pMON9733分離出一個185bp片段，此片段從位于mp8多連接子中的BamHI位點(diǎn)延伸到106的ClaI位點(diǎn)。把這兩片段連在一起生成pMAP16。pMAP16含有位于ATG處的NcoI位點(diǎn)，但丟失了106位和1283位的兩個ClaI位點(diǎn)間的毒素基因片段。從pMAP4中分離出這個ClaI片段，并與ClaI消化的pMAP16連接。鑒定出一個含有這個插入的ClaI片段的質(zhì)粒，該片段的取向正確地重新構(gòu)建出一個功能性毒素基因。該質(zhì)粒定名為pMAP17。含有此質(zhì)粒的大腸桿菌產(chǎn)生一個約134，000道爾頓的蛋白，該蛋白與用蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德HD-1亞種的純化晶體毒素蛋白制備的抗體反應(yīng)，而且該蛋白的水平與含pMAP4的大腸桿菌所產(chǎn)生的該蛋白差不多。含pMAP17的大腸桿菌對鱗翅目幼蟲煙草天蛾有毒。
為便于在植物轉(zhuǎn)化載體中構(gòu)建嵌合毒素基因，將BamHI和BglⅡ位點(diǎn)引入到緊靠毒素基因的NcoI位點(diǎn)的上游。參見圖5，用質(zhì)粒pMON146作合成連接子的來源，該連接子含有如下所示的BamHI、BalⅡ、XbaI和NcoI限制位點(diǎn)5′-GGATCCAGATCTGTTGTAAGGAGTCTAGACCATGGATC-3′BamHIBglⅡXbaINcoI用PstI部分消化pMON146，然后用NcoI消化至完全，分離出一個3.5kbNcoI-PstI片段。從pMAP17中分離出含整個毒素基因的4.5kbNcoI-PstI片段，將此片段與3.5kbpMON146片段相連。含有這兩個片段的質(zhì)粒定名為pMON294。在pMON294中，有一個BamHI位點(diǎn)和一個BglⅡ位點(diǎn)緊接毒素蛋白起始密碼子的上游，有一個BamHI位點(diǎn)緊接PstI位點(diǎn)的下游。
為在植物中表達(dá)B.t.毒素基因而構(gòu)建一個質(zhì)粒，方法是pMON294的含毒素基因的4.5kbBamHI片段連入已用BglⅡ消化的pMON316中。通過用EcoRI消化鑒定出一個質(zhì)粒，它所含的毒素基因的取向使得翻譯密碼子與CaMV35S啟動子相鄰。該質(zhì)粒定名為pMON8053。制備另一個含全長構(gòu)建體的嵌合植物基因，其中B.t.毒素的結(jié)構(gòu)性編碼順序在3479位的DraI位點(diǎn)被截斷。此位點(diǎn)對B.t.戈爾斯德亞種基因的全長編碼順序但很小的3′鄰接順序來說，位于距編碼順序的翻譯終止密碼子10個核苷酸處。此構(gòu)建體定名為pMON9712。
利用核酸內(nèi)切酶DraI消化pMON294而制備質(zhì)粒pMON9712。合成具有下列順序的一對互補(bǔ)寡核苷酸5′-TAGTAGGTAGCTAGCCA-3′3′-ATCATCCATCGATCGGTCTAG-5′這兩個寡核苷酸彼此退火后，編碼所有三個讀碼中的翻譯終止密碼子。退火后的寡核苷酸對一端為平末端，另一端則有一個能與BglⅡ消化的DNA連接的四核苷酸單鏈區(qū)。使這兩個寡核酸彼此退火并與已用DraI消化的pMON294DNA相連。連接后的DNA用BglⅡ消化，分離出一個含所需的B.t.毒素編碼順序的約3.5kbBglⅡ片段。此片段從緊接翻譯起始密碼子上游的BglⅡ位點(diǎn)延伸到由該寡核苷酸對產(chǎn)生的BglⅡ位點(diǎn)。將此BglⅡ片段與BglⅡ消化的pMON316連接。利用EcoRI消化鑒定出一個克隆，其中毒素基因的翻譯起始密碼子與35S啟動子相鄰。
以前的工作證明，從翻譯起始密碼子上游延伸到2170位的KpnI位點(diǎn)的B.t.毒素編碼順序片段，在大腸桿菌中表達(dá)時產(chǎn)生一種對煙草天蛾有毒的蛋白。如下所述構(gòu)建摻入這樣一種截短的B.t.毒素編碼基因的植物表達(dá)載體。根據(jù)毒素基因在2170位KpnI位點(diǎn)的DNA順序，合成如下所示的一對互補(bǔ)寡核苷酸，它們在彼此退火并與毒素基因的KpnI位點(diǎn)連接后，將編碼毒素編碼順序讀碼內(nèi)的兩個翻譯終止密碼子。
5′-CTAGTAAA-3′3′-CATGGATCATTTCTAG-5′退火后的寡核苷酸一端有一個能與KpnI消化的毒素基因連接的四核苷酸單鏈區(qū)，另一端有一個能與BglⅡ消化的DNA連接的四核苷酸單鏈區(qū)。使這兩個寡核苷酸彼此退火并與已用KpnI消化的pMON294連接。然后用BglⅡ消化這個連接后的DNA，分離出一個2.2kbBglⅡ片段。此片段從緊靠毒素基因翻譯起始密碼子上游的BglⅡ位點(diǎn)延伸至由該核苷酸對產(chǎn)生的BglⅡ位點(diǎn)。
為在植物中表達(dá)在KpnI位點(diǎn)截斷的B.t.毒素基因，將2.2kbBglⅡ位點(diǎn)與BglⅡ消化的pMON316連接而構(gòu)建出一個質(zhì)粒。利用EcoRI消化鑒定出一個克隆，其中毒素基因的翻譯起始密碼子與CaMV35S啟動子相鄰。該克隆定名為pMON9711。
(ⅱ)B.t.戈爾斯德HD-73亞種以與上述方法相似的方式，制備一個編碼B.t.kHD-73毒素的植物基因。參見圖6，從B.t.k.HD-73中分離DNA，用HPaI切割并連入用SmaI切割的pUC119中。利用定點(diǎn)誘變將一個BglⅡ位點(diǎn)引入起始密碼子(ATG)上游。將一個終止密碼子(TAG)和BglⅡ位點(diǎn)引入毒素編碼順序的KpnI位點(diǎn)。
用于昆蟲測試的人工飼料下面表1列出飼料的各成分(Marroneetal.，J.Econ.Entomol.78290-293，1985)。由于試樣是直接摻入飼料中，所以去掉了20%的補(bǔ)充水。制備出飼料后，將其倒入放置于40℃水浴中的500ml塑料擠瓶中。在試驗當(dāng)天配制蛋白毒素溶液。一般將4ml裝在50ml錐形離心管中的毒素溶液與16ml人工飼料混合。充分?jǐn)噭蚝?，?ml樣品在硬化前迅裝分裝到每個小孔中。加滿96孔淺盤后，在豎式通風(fēng)櫥中使其干燥。每個小孔中加一只昆蟲，一般每次處理16只幼蟲。
表1人工飼料介質(zhì)成分量Phytagar14.48g去離子水840ml全麥胚(磨碎)27.48gD-蔗糖38.50g無維生素酪蛋白32.25gAlphacel13.75g混合鹽w9.25g對羥基苯甲酸甲酯0.60-1.0g山梨酸0.38-0.64g膽固醇0.06g粗亞麻籽油0.40ml鏈霉素0.064g氯四環(huán)素0.064gVanderzants混合維生素9.0g10%KOH8.5ml福爾馬林(37.7%)1.0ml
昆蟲毒素測試(ⅰ)鱗翅目型毒素活性用新孵化的煙芽夜蛾(TBW)幼蟲，以上述人工飼料測試法測試鱗翅目毒素活性(B.t.k.HD-73和HD-1)。TBW卵用1%Clorox(5分鐘)、0.25%過乙酸(2分鐘)進(jìn)行表面消毒，并放在濾紙片上置于25℃、80%相對濕度下孵育5-6天，直至孵化。制備飼料介質(zhì)，取1ml分裝到16個小孔中。在每個小孔中用漆刷放入一只新生幼蟲，用加熱的烙鐵(tackingion)把這些盤用MYLAR(DuPontCo.)密封起來。每個小孔用無菌探針刺一個孔供通氣。6天后，用Abbott公式計算校正后的死亡百分率(Abbott，W.S.，J.Econ.Entomol.18265-267，1925)。對于那些以幼蟲體重下降來測定B.t.k.效力的實驗，是在每次處理的第7天用分析天平稱量幼蟲。計算每只昆蟲的平均體重，并與僅用毒素蛋白所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖10)比較。
(ⅱ)鞘翅目型毒素活性用新孵化的馬鈴薯甲蟲幼蟲以蕃茄葉攝食試驗測試鞘翅目毒素活性(B.t.t.)。在試驗當(dāng)天，制備單獨(dú)的B.t.t.樣品、單獨(dú)的純化種子抑制劑樣品或這兩種蛋白的結(jié)合樣品。加入吐溫-20(0.3%)，把約0.5ml樣品涂到放在襯有濕濾紙的9cm培養(yǎng)皿中的蕃茄葉上。每片葉上放10只馬鈴薯甲蟲幼蟲。四天后，用Abbott公式計算校正的死亡百分率(占對照中存活昆蟲的百分比)。進(jìn)行兩次重復(fù)測試并將數(shù)據(jù)合并。
實例用多種來源的胰蛋白酶抑制劑來增強(qiáng)分離自B.t.k.HD-1和B.t.k.HD-73的表4各種抑制劑對HD-73的增效作用抑制劑來源活性增強(qiáng)倍數(shù)紅豆2.4豇豆1.8南瓜3.3胰腺組織3.4卵類粘蛋白2.2大豆Bowman-Birk型3.3大豆Kunitz型3.9實例6從多個種子來源提取胰蛋白酶抑制劑。如前述由1g種子在5ml緩沖液中制備抑制劑粗提物，不作進(jìn)一步純化。用種子粗提物在上述測試中增強(qiáng)B.t.k.HD-73(煙芽夜蛾)和B.t.t.(馬鈴薯甲蟲)二者的毒性，并在該測試中測定死亡率。增效結(jié)果示于圖11。在所有情況下抑制劑粗提物都增強(qiáng)B.t.t.和B.t.k.毒素的活性。
實例7用大豆Kunitz型和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑增強(qiáng)以DIPEL 商品名(Abbott Labs，Chicago，IL)出售的市售B.t.毒素制劑的活性。將DIPEL加入人工飼料中至終濃度為20μg/ml，這一濃度只造成很小的幼蟲體重下降。加入胰蛋白酶抑制劑的終濃度對Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑為0.37mg/ml(0.2%)，對Kunitz型胰蛋白抑制劑為強(qiáng)B.t.t.活性2至10倍。
實例3圖10顯示了煙芽夜蛾幼蟲體重對B.t.k.毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用B.t.k.HD-73和HD-1進(jìn)行增效實驗。所測試的HD-73毒素既有全長毒素原和截短的蛋白產(chǎn)物(～80kd)，也有活化的(經(jīng)粉紋夜蛾腸汁消化的)HD-73毒素。所測試的HD-1毒素既有全長毒素原，也有胰酶消化的毒素。加入各種不同濃度的本身只產(chǎn)生很小的幼蟲體重下降的Kunitz或Bowman-Birk大豆胰蛋酶抑制劑，使毒素增效。計算各抑制劑濃度的平均增效作用，總結(jié)于下列表2。所觀察到的增效作用在1.3至4.2倍以上變化。
表2B.t.k.活性的增效幼蟲體重下降測試B.t.k.蛋白B.t.增強(qiáng)倍數(shù)(μg/ml)Bowman-Birk＊Kunitz＊HD-73(全長)11.42.8HD-73(截短)0.14.23.9HD-73(粉紋夜蛾腸汁消化)0.13.33.9HD-1(全長)11.32.5HD-1(經(jīng)胰酶消化)0.023.23.3＊濃度為4.0μM。
實例4利用實例3所述的方法，研究各種不同濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑對B.t.k.HD-73的增效作用。活化的(經(jīng)粉紋夜蛾腸汁消化鱗翅目型B.t.毒素的活性。將抑制劑以不同濃度加入含B.t.毒素的上述人工飼料中，B.t.毒素的水平本身只造成很小的死亡率。在上述飼料摻合測試中，純化的胰蛋白酶抑制劑使鱗翅目型毒素對煙芽夜蛾的毒性效果提高了2-10倍。所觀察的毒性效果或者是死亡率的提高，或者幼蟲體重的下降。在很低的蛋白酶抑制劑濃度下(0.000003-0.03mg/ml或飼料重量的2.0×10-6-2.0×10-2%)就觀察到增效作用，這些濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對胰蛋白酶抑制劑本身所報導(dǎo)的殺蟲水平(飼料重量的2-5%)。
實例1大豆胰蛋白酶抑制劑對B.t.戈爾斯德HD-73對煙芽夜蛾的活性的增效作用示于圖8。分離出B.t.毒素，用粉紋夜蛾的腸汁進(jìn)行蛋白水解斷裂使其活化，以各種不同的濃度摻入人工飼料測試中。選擇一個只造成微小死亡率的濃度(0.5μg/ml)用于增效實驗中。在0.5μg/ml的B.t.毒素中添加各種不同濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑(Kunitz型和Bowman-Birk型)。所給出的數(shù)值為幾次實驗的平均值?？偟膩碚f，胰蛋白酶抑制劑增強(qiáng)B.t.k.HD-73的活性1.5至8倍。
實例2大豆胰蛋白酶抑制劑(Kunitz型)對蘇云金芽孢桿菌對馬鈴薯甲蟲活性的增效作用示于圖9。分離出B.t.t.毒素后以各種不同濃度摻入葉片測試。選擇一個只造成微小死亡率的濃度(2.5μg/ml)用于增效實驗。在2.5μg/mlB.t.t.毒素中添加各種不同濃度的大豆胰蛋白酶抑制劑(Kunitz型)。所給出的數(shù)值為幾個實驗的平均值?？偟膩碚f，Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制劑增的)HD-73毒素的終濃度約為0.02μg/ml。下面表3所示的結(jié)果為對每一抑制劑濃度所作 -4次實驗的平均值。
表3大豆胰蛋白酶抑制劑對HD-73活性的增效作用抑制劑濃度活性增加倍數(shù)Bowman-Birk0.4uM(0.002%)8.20.04uM(0.0002%)6.90.004uM(0.00002%)3.80.0004uM(0.000002%)2.8Kunitz0.4uM(0.006%)6.20.04uM(0.0006%)6.20.004uM(0.00006%)4.20.0004uM(0.000006%)3.5實例5利用實例3所述方法，證實各種來源的部分純化或純化的胰蛋白酶抑制劑對B.t.k.HD-73的增效作用?；罨?粉紋夜蛾腸汁消化的)HD-73毒素的濃度約為0.02μg/ml。抑制劑分離自各種來源，包括紅豆、豇豆、南瓜、胰腺組織和大豆。根據(jù)產(chǎn)色活性調(diào)整抑制劑活性，使抑制劑活性對所有樣品都相同，但并未測定比活性。增效作用在約2至4倍間變化。結(jié)果示于下面表4。
0.1mg/ml(0.6%)。抑制劑的存在使DIPEL對煙芽夜蛾的活性分別增強(qiáng)約2.3和3.2倍。
權(quán)利要求
1.一種利用蘇云金芽孢桿菌的毒素蛋白防治昆蟲的方法，其改進(jìn)包括同時給昆蟲施用一種增效量的胰蛋白酶抑制劑。
2.一種權(quán)利要求1的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)化一種植物使其表達(dá)蘇云金芽孢桿菌的毒素蛋白，包括轉(zhuǎn)化所述植物使其同時表達(dá)增效量的一種胰蛋白酶抑制劑。
3.一種權(quán)利要求2的方法，其特征在于，胰蛋白抑制劑的來源選自豌豆、豇豆、裂莢老豌豆、小扁豆、斑豆、利馬豆、綠豆、芥豆、大豆、紅豆、 蒿、卡瓊麻豆、稻、棉花、玉米、小麥、高梁、油菜、栗、大豆和南瓜。
4.一種權(quán)利要求2的方法，其特征在于，毒素蛋白來自選自下列亞種的蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德HD-1亞種、戈爾斯德HD-73亞種、猝倒亞種、柏氏亞種、蘇云金亞種、多窩亞種、松蠋亞種、阿萊亞種、蠟螟亞種、鲇澤亞種、亞毒亞種。
5.權(quán)利要求2的方法，其特征在于，毒素蛋白來自蘇云金芽孢桿菌黃粉 亞種或圣地亞哥亞種。
6.一種權(quán)利要求2的方法，其特征在于，毒素蛋白來自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種。
7.一種植物細(xì)胞，它已被轉(zhuǎn)化而表達(dá)有效殺蟲量的一種蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白和增效量的胰蛋白酶抑制劑。
8.一種權(quán)利要求7的植物細(xì)胞，其特征在于，胰蛋白抑制劑的來源選自豌豆、豇豆、裂莢老豌豆、小扁豆、斑豆、利馬豆、綠豆、芥豆、大豆、紅豆、 蒿、卡瓊麻豆、稻、棉花、玉米、小麥、高梁、油菜、栗、大麥和南瓜。
9.一種權(quán)利要求7的植物細(xì)胞，其特征在于，毒素蛋白選自如下亞種的蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德HD-1亞種、戈爾斯德HD-73亞種、猝倒亞種、柏氏亞種、蘇云金亞種、多窩亞種、松蠋亞種、阿萊亞種、蠟螟亞種、鲇澤亞種、亞毒亞種。
10.一種權(quán)利要求7的植物細(xì)胞，其特征在于，毒素蛋白來自蘇云金芽孢桿菌黃粉 亞種或圣地亞哥亞種。
11.一種權(quán)利要求7的植物細(xì)胞，其特征在于，毒素蛋白來自蘇云金芽孢桿菌以色列亞種。
12.一種含權(quán)利要求7的植物細(xì)胞的昆蟲抗性植物。
13.一種權(quán)利要求12的植物，其特征在于，它含有權(quán)利要求8的植物細(xì)胞。
14.一種權(quán)利要求12的植物，其特征在于，它含有權(quán)利要求9的植物細(xì)胞。
15.一種權(quán)利要求12的植物，其特征在于，它含有權(quán)利要求10的植物細(xì)胞。
16.一種權(quán)利要求13的植物，其特征在于，它含有權(quán)利要求11的植物細(xì)胞。
17.一種組合物，其中含有一種蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白和增效量的一種胰蛋白酶抑制劑。
18.一種權(quán)利要求17的組合物，其特征在于，抑制劑與毒素的摩爾比在約1/1至104/1的范圍。
19.一種權(quán)利要求18的組合物，其特征在于，毒素蛋白的來源選自下列亞種的蘇云金芽孢桿菌戈爾斯德HD-1亞種、戈爾斯德HD-73亞種、猝倒亞種、柏氏亞種、蘇云金亞種、多窩亞種、松蠋亞種、阿萊亞種、蠟螟亞種、鲇澤亞種、亞毒亞種、以色列亞種、黃粉 亞種、圣地亞哥亞種。
20.一種權(quán)利要求18的組合物，其特征在于，胰蛋白酶抑制劑的來源選自豌豆、豇豆、裂莢老豌豆、小扁豆、斑豆、利馬豆、綠豆、芥豆、大豆、紅豆、 蒿、卡瓊麻豆、稻、棉花、玉米、小麥、高梁、油菜、栗、大麥和南瓜。
全文摘要
公開了一種增強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌蛋白毒素的殺蟲活性的方法。將增效量的胰蛋白酶抑制劑與B.t.毒素一起施用于昆蟲。還公開了改進(jìn)的殺蟲劑組合物，其中含有殺蟲量的蘇云金芽孢桿菌蛋白毒素和增效量的胰蛋白酶抑制劑。
文檔編號C08K3/00GK1038114SQ89103320
公開日1989年12月20日 申請日期1989年5月18日 優(yōu)先權(quán)日1988年5月26日
發(fā)明者羅伊·李·富克斯, 甘尼舒·默菲·基肖爾斯, 蘇珊·卡里爾·麥金托什 申請人:孟山都公司