專利名稱：喜樹堿的聚合衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及20-O-[甘氨?；?氨?；?甘氨?；鵠喜樹堿的聚合共軛物。我們的WO-95/10304描述和要求保護(hù)通過(guò)肽基間隔基與一種聚合物連接的喜樹堿共軛物。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，以氨?；?甘氨酰基為間隔基的共軛物作為抗腫瘤劑具有特別的價(jià)值，與游離藥物相比，被賦予了顯著的抗腫瘤活性和降低了的毒性。
確切地說(shuō)，本發(fā)明提供了式(1)的聚合共軛物，由下列組成(i)85至97mol％的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元，由式(3)代表
(ii)3至15mol％的20-O-(N-異丁烯?；?甘氨酰基-氨?；?喜樹堿單元，由式(4)代表
其中n是2至8，-[O-CPT]代表式(2)的喜樹堿殘基
該殘基在C-20位上連接，其中R1、R2、R3、R4和R5是相同或不同的，它們各自是氫，C1-C12直鏈或支鏈烷基，硝基，氨基，(CH2)aNR6R7，其中a是0至4，R6和R7是氫，或者R6或R7之一是氫而R6或R7的另一個(gè)是C1-C6烷基，或者NR6R7代表可選被C1-C6直鏈或支鏈烷基取代的哌嗪子基或N-烷基-哌嗪子基環(huán)，或者代表哌啶子基環(huán)，(CH2)aNHCOR8，其中a是如上所定義的，R8是C1-C8直鏈或支鏈烷基或如上的基團(tuán)NR6R7，羥基或O-CO-R8，其中R8是如上所定義的或者代表1-哌啶子基環(huán)或1，4’-聯(lián)哌啶，或者R2與R3共同代表殘基O-(CH2)b-O，其中b是1或2，或者R4與R5代表殘基(CH2)m，其中m是2至4，或者代表殘基CH2-O-CH2或CH2NHCH2，以及(iii)0至12mol％的N-異丁烯?；?甘氨酸或N-(2-羥基丙基)異丁烯酰基-甘氨酰胺單元，由式(5)代表
其中[Z]代表羥基或式-NH-CH2-CH(OH)-CH3殘基。
式(1)的聚合共軛物可以表示為MAG-CPT(s)，也可以表示如下[(3)]x；[(4)]y；[(5)]z，其中(3)、(4)和(5)是如上所定義的各式單元，x是85至97mol％，y是3至15mol％，z是0至12mol％。
本發(fā)明化合物的優(yōu)選實(shí)施方案是，其中式(4)中的-[O-CPT]是式(2)的喜樹堿殘基，選自—喜樹堿[2aR1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H]；—9-氨基喜樹堿[2bR1＝R2＝R3＝R5＝H，R4＝NH2]；—9-硝基喜樹堿[2cR1＝R2＝R3＝R5＝H，R4＝NO2]；—7-乙基-10-羥基喜樹堿[2dR1＝R2＝R4＝H，R3＝OH，R5＝CH2CH3]；—7-乙基-10-[1，4’-聯(lián)哌啶基]羰基氧基喜樹堿[2eR1＝R2＝R4＝H，R3＝OCO-[1，4’-聯(lián)哌啶基]，R5＝CH2CH3]；—7-亞甲基二甲氨基-10-羥基喜樹堿[2fR1＝R2＝R4＝H，R3＝OH，R5＝CH2N(CH3)2]；和—7-[亞甲基-(4’-甲基哌嗪子基)]-9，10-亞乙二氧基喜樹堿[2gR1＝R4＝H，R2，R3＝O-CH2CH2-O，R5＝亞甲基-(4’-甲基哌嗪子基)]。
優(yōu)選地，式(1)的聚合共軛物含有由式(3)代表的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元的比例為90％或以上；更優(yōu)選為90％。共軛物也可以含有3至10mol％由式(4)代表的單元，更優(yōu)選為10mol％。優(yōu)選地，式(1)共軛物不含式(5)殘基，即z是0。
式(1)共軛物中式(2)活性喜樹堿衍生物的含量可以是2至15％(重量/重量)，更優(yōu)選為10％(w/w)。
可以通過(guò)下面的方法(這里稱為途徑I)進(jìn)行本發(fā)明化合物的制備，該方法包括使式(6)的20-O-(氨?；?甘氨?；?喜樹堿衍生物NH2-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](6)其中n和[OCPT]是如上所定義的，與聚合物(B)反應(yīng)，該聚合物(B)基本上由下列成分組成85至97mol％如上所定義的由式(3)代表的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元，和3至15mol％由式(7)代表的N-異丁烯?；?甘氨酰基衍生物單元
其中[Y]是一種活性酯的殘基、優(yōu)選為對(duì)硝基苯基酯，或羥基；并且可選地用1-氨基-2-丙醇置換殘留的活性酯基團(tuán)。
式(6)衍生物與式(B)聚合物的縮合反應(yīng)，是在能夠保持喜樹堿與氨?；?甘氨酰基間隔基之間的連接性質(zhì)以及共軛物性質(zhì)的條件下進(jìn)行的。
由式(3)代表的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元和式(7)代表的N-異丁烯?；?甘氨酸單元組成的式(B)聚合物，是通過(guò)N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺與N-異丁烯?；?甘氨酸或N-異丁烯酰基-甘氨酸活性酯衍生物的共聚反應(yīng)制備的，如《大分子化學(xué)》(Makromol.Chem.)178，2159(1977)所述。殘基[Y]可以代表苯氧基，在苯基環(huán)上被一個(gè)或多個(gè)吸電子基團(tuán)取代，例如硝基或鹵素。優(yōu)選地，殘基[Y]代表對(duì)硝基苯氧基。
(6)與(B)生成本發(fā)明的式(1)聚合藥物共軛物的反應(yīng)通?？梢栽?5至30℃的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在室溫下進(jìn)行15小時(shí)；然后可以在室溫下，在1-氨基-2-丙醇的存在下，使殘留的活性酯基團(tuán)進(jìn)行氨解0.5至1小時(shí)。共軛物適宜用乙酸乙酯沉淀出來(lái)，將其溶于乙醇，用乙酸乙酯再次沉淀。
例如，在室溫下，將濃度為15％(重量/體積)的其中[Y]代表一種活性酯殘基的聚合物(B)的無(wú)水二甲基亞砜溶液用3％(w/v)20-O-(氨酰基-甘氨?；?喜樹堿衍生物(6)處理15小時(shí)。然后加入0.1％(w/v)1-氨基-2-丙醇，反應(yīng)混合物在室溫下保持1小時(shí)?？梢杂靡宜嵋阴コ恋沓鼍酆纤幬锕曹椢颩AG-CPTs，收集，用乙酸乙酯洗滌，然后用絕對(duì)乙醇溶解，濃度為10％(重量/體積)，再次用乙酸乙酯沉淀，得到本發(fā)明的式(1)共軛物。
本發(fā)明聚合共軛物中喜樹堿的含量通過(guò)HPLC或吸光度光譜學(xué)分析法測(cè)定。
式(1)化合物也可以通過(guò)下面的方法(這里稱為途徑II)制備，該方法包括式(8)的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺
與式(9)的20-O-[異丁烯?；?甘氨?；?(氨酰基)-甘氨?；鵠喜樹堿衍生物
其中n和[OCPT]是如上所定義的，之間的聚合反應(yīng)，反應(yīng)在能夠保持喜樹堿與甘氨?；?氨酰基-甘氨?；g隔基之間的連接性質(zhì)以及共軛物性質(zhì)的條件下進(jìn)行。
(8)與(9)之間的反應(yīng)通常可以在催化劑(例如2，2’-偶氮二異丁腈)的存在下，在非質(zhì)子傳遞溶劑(例如二甲基亞砜)中，在50至70℃下、優(yōu)選為60℃，進(jìn)行6至24小時(shí)、優(yōu)選為15小時(shí)。共軛物用乙酸乙酯沉淀出來(lái)，將其溶于乙醇，再次用乙酸乙酯進(jìn)行沉淀。
例如，在60℃、氮?dú)庀?，加熱濃度?2％(w/v)的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺(8)與濃度為6％(w/v)的20-O-[異丁烯酰基-甘氨?；?(6-氨基己酰)-甘氨?；鵠喜樹堿衍生物(9)的無(wú)水二甲基亞砜溶液，然后加入濃度為1.3％(w/v)的2，2’-偶氮二異丁腈?；旌衔镌跀嚢柘卤３?4小時(shí)。之后，反應(yīng)混合物在室溫下冷卻，共軛物適宜用乙酸乙酯沉淀出來(lái)，將其溶于乙醇，再次用乙酸乙酯進(jìn)行沉淀，得到本發(fā)明的式(1)共軛物。
本發(fā)明也提供了如上所定義的20-O-酰氨基-甘氨?；?喜樹堿衍生物(6)和它們的鹽衍生物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于制備20-O-(氨?；?甘氨酰基)喜樹堿衍生物(6)的方法，該方法包括縮合如上所定義的式(2)殘基與式(10)的N-保護(hù)的氨?；?甘氨?；苌颮9-HN-(CH2)n-CO-Gly-[P](10)其中n是如上所定義的，R9代表一種氨基保護(hù)基團(tuán)，例如Boc、FMOC、三苯基甲硅烷基、二苯基亞甲基或三苯基甲基，[P]是一種活性酯的殘基，例如對(duì)硝基苯氧基或N-羥基琥珀酰亞胺基，得到由式(11)代表的化合物R9-NH-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](11)其中n、[OCPT]和R9是如上所定義的；以及從所得化合物中除去N-保護(hù)基團(tuán)。
式(10)化合物的制備遵循文獻(xiàn)已知的標(biāo)準(zhǔn)合成操作。合適的式(10)N-保護(hù)的-氨?；苌锇?-N-(三苯基甲基)己?；拾滨；鶎?duì)硝基苯基酯(10a)、6-N-(叔丁氧羰基)己?；拾滨；鶎?duì)硝基苯基酯(10b)。
例如，可以在4-二甲氨基吡啶的存在下，在無(wú)水溶劑例如無(wú)水二甲基亞砜中，使喜樹堿(2a)與摩爾過(guò)量的式(10)N-保護(hù)的-氨?；苌锓磻?yīng)，例如多達(dá)五倍摩爾過(guò)量或以上，尤其是2摩爾當(dāng)量。
反應(yīng)通常可以進(jìn)行8至48小時(shí)。反應(yīng)通常是在15至40℃的溫度下進(jìn)行。用一種適當(dāng)?shù)娜ケＷo(hù)劑除去臨時(shí)的氨基保護(hù)基團(tuán)R9，得到式(6a)的20-O-(氨?；?甘氨?；?喜樹堿。因此，通過(guò)酸處理可以實(shí)現(xiàn)去保護(hù)，例如在10至30℃的溫度下，用1.5N含水鹽酸的乙酸溶液或90％含水三氟乙酸處理1至6小時(shí)；優(yōu)選在室溫下處理2小時(shí)。
本發(fā)明也提供了如上所定義的20-O-[異丁烯?；?甘氨酰基-(氨?；?-甘氨酰基]喜樹堿衍生物(9)和它們的制備方法，該方法包括縮合如上所定義的式(6)喜樹堿衍生物與式(7’)的N-異丁烯酰基-甘氨?；?
其中[Y’]是一種離去基團(tuán)。例如，在當(dāng)量堿例如三乙胺的存在下，使?jié)舛葹?5％(w/v)的20-O-[氨?；?甘氨?；鵠喜樹堿(6a)的無(wú)水二甲基亞砜溶液與13％(w/v)N-(異丁烯?；?甘氨酰基)對(duì)硝基苯基酯((7’)，[Y’]＝對(duì)硝基苯酚)在室溫下反應(yīng)15小時(shí)。用沉淀法分離最終的衍生物，用色譜法純化。
式(8)化合物和聚合物(B)是已知的，或者可以按照已知的合成方法制備。
所有式(2)喜樹堿衍生物都是已知的，例如參見《醫(yī)藥研究評(píng)論》(Medicinal Research Reviews)17卷4期367-425，1997，或者可以利用熟知操作制備。
式(1)的與聚合物結(jié)合的共軛物的分子量在5,000至45,000范圍內(nèi)，優(yōu)選為18,000至35,000。式(1)聚合藥物共軛物是水溶性的，與游離喜樹堿相比，顯示出顯著的抗腫瘤活性和降低了的毒性。
抗腫瘤活性通過(guò)i.v.途徑比照游離藥物試驗(yàn)了化合物A1對(duì)移植到裸鼠中的人結(jié)腸癌(HT29)的作用。發(fā)現(xiàn)A1是無(wú)毒的，在全部試驗(yàn)劑量下得到＞95％腫瘤抑制率，另外在試驗(yàn)結(jié)束(90天)時(shí)，異常大量的動(dòng)物已無(wú)腫瘤存在，見表1。還比照游離7-乙基-10-羥基喜樹堿(2d)在相同模型中試驗(yàn)了化合物A2的作用，發(fā)現(xiàn)其是有活性且無(wú)毒的，在40mg/kg的最高試驗(yàn)劑量下，得到98％腫瘤抑制率(表2)。
還通過(guò)i.v.途徑試驗(yàn)了化合物A1對(duì)多種其他人腫瘤模型的作用A2780卵巢癌、MX1乳房癌、A549 NSC肺癌和M14黑素瘤。相對(duì)于對(duì)應(yīng)的游離喜樹堿(2a)而言，化合物A1具有更高活性，治愈了大量動(dòng)物。
表3、4和5分別報(bào)告了對(duì)抗MX1乳房癌、A2780卵巢癌和M14黑素瘤的活性，與游離喜樹堿進(jìn)行了比較?；衔顰1對(duì)抗這些腫瘤模型的活性非常高，按照q4dx6方案以1 5或20mg/kg反復(fù)i.v.給藥，觀察到對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的總抑制率達(dá)到總計(jì)7/7和8/8治愈了的小鼠。
還發(fā)現(xiàn)化合物A1在20mg/kg(iv q4dx6)下具有對(duì)抗NSC肺癌的活性，TI％為94，明顯延緩腫瘤生長(zhǎng)70天，這是用其他有用的化療劑所從沒(méi)有觀察到的(表6)。
表1比較A1與(2a)對(duì)人結(jié)腸癌(HT29)的抗腫瘤活性。iv q4dx6治療方案。
sc植入腫瘤斷片。當(dāng)可觸摸到腫瘤時(shí)開始治療。
在第37天計(jì)算TI％(腫瘤抑制％)。
ΔTGD接受治療動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)延緩—對(duì)照動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)延緩。表2比較A2與(2d)對(duì)人結(jié)腸癌(HT29)的抗腫
腫瘤斷片。當(dāng)可觸摸到腫瘤時(shí)開始治療。
在第37天計(jì)算TI％(腫瘤抑制％)。
ΔTGD接受治療動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)延緩—對(duì)照動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)延緩。
表3比較A1與喜樹堿(
組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。無(wú)腫瘤腫瘤植入后第90天治愈了的小鼠。表4比較A1與喜樹堿(2a)對(duì)抗A2780人卵巢癌的抗腫瘤活性。
sc植入腫瘤斷片，當(dāng)可觸摸到腫瘤時(shí)開始治療。劑量以喜樹堿等價(jià)量表示。TI％最后一次治療后1周的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。Tox因毒性而死亡的小鼠數(shù)/總小鼠數(shù)。ΔTGD治療組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。無(wú)腫瘤腫瘤植入后第90天治愈了的小鼠。表5比較A1與喜樹堿(2a)對(duì)抗M14人黑素瘤的抗腫瘤活性。
sc植入腫瘤斷片，當(dāng)可觸摸到腫瘤時(shí)開始治療。劑量以喜樹堿等價(jià)量表示。TI％最后一次治療后1周的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。Tox因毒性而死亡的小鼠數(shù)/總小鼠數(shù)。ΔTGD治療組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。無(wú)腫瘤腫瘤植入后第90天治愈了的小鼠。表6比較A1與喜樹堿(2a)對(duì)抗A549人NSC肺癌的抗腫瘤活性。<
sc植入腫瘤斷片，當(dāng)可觸摸到腫瘤時(shí)開始治療。劑量以喜樹堿等價(jià)量表示。TI％最后一次治療后1周的腫瘤生長(zhǎng)抑制率。Tox因毒性而死亡的小鼠數(shù)/總小鼠數(shù)。ΔTGD治療組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)延緩。無(wú)腫瘤腫瘤植入后第90天治愈了的小鼠。
因此，本發(fā)明化合物可用于白血病和固體腫瘤的治療，例如結(jié)腸、結(jié)腸-直腸、胃、卵巢、乳房、前列腺、肺、腎腫瘤以及黑素瘤。因此能夠用這樣一種方法治療人，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明聚合共軛物對(duì)其給藥。于是可以改善病人的病情。適用的劑量范圍將取決于給藥途徑和所治療患者的年齡、體重和病情。通常將式(1)聚合共軛物以胃腸外途徑給藥，例如肌內(nèi)、靜脈內(nèi)給藥或通過(guò)大丸劑注入。合適的劑量范圍是1至1000mg喜樹堿等價(jià)量每m2體表面積，例如10至100mg/m2。
可以將式(1)聚合共軛物與藥學(xué)上的載體或稀釋劑一起配制成藥物組合物。通常，將它們配制成胃腸外給藥的劑型，例如溶解在注射用水或生理鹽水中。
下列實(shí)施例闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1
N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己?；?甘氨?；鶎?duì)硝基苯基酯[10an＝5，R9＝Boc，P＝對(duì)硝基苯酚]的制備將鹽酸甘氨酸乙酯(9.55g，68.4mmol)用二甲基甲酰胺(100ml)溶解，加入三乙胺(9.5ml，68.4mmol)，然后加入遵循我們的E.P.N°0673258中所述相同操作制備的N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己?；鶎?duì)硝基苯基酯(19g，54mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下保持兩小時(shí)，然后在減壓下除去溶劑。將殘余物用乙酸乙酯(300ml)溶解，按順序用冷1N含水鹽酸(3×200ml)、水(100ml)、5％碳酸氫鈉水溶液(2×200ml)和水(2×200ml)洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，然后在減壓下除去溶劑。殘余物從乙醚中結(jié)晶，得到N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己?；?甘氨?；阴?15g；Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脫系統(tǒng)為乙醚，Rf＝0.3)，將其用乙醇(150ml)懸浮，在攪拌下用1N含水氫氧化鈉(48ml，48mmol)處理。一小時(shí)后，向反應(yīng)中加入1N含水鹽酸(48ml，48mmol)，在減壓下蒸餾。將殘余物用無(wú)水四氫呋喃(200ml)懸浮，加入對(duì)硝基苯酚(6.53g，47mmol)，在0℃下冷卻，然后加入1，3-二環(huán)己基-碳二亞胺(9.7g，47mmol)在四氫呋喃(100ml)中的溶液。在相同條件下靜置反應(yīng)過(guò)夜，然后在燒結(jié)玻璃漏斗上過(guò)濾。在減壓下除去溶劑。殘余物從乙醚中結(jié)晶，得到17.5g標(biāo)題化合物(10a)。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脫系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(95/5v/v)，Rf＝0.34。1H-NMR(200MHz，DMSO)δ1.34(s，9H，t-Bu)；1.0-1.7[m，6H，NH-CH2-(CH2)3-CH2-CO]；2.15(t，J＝7.2Hz，2H，NH-(CH2)4-CH2-CO)；2.85[q，J＝6.5Hz，2H，NH-CH2-(CH2)4-CO]；4.11(d，J＝5.5Hz，2H，CONHCH2COO)；6.70[bs，1H，NH-(CH2)5-CO]；7.40(m，2H，芳香2，6-H)；8.30(m，2H，芳香3，5-H)；8.43(t，J＝5.5Hz，1H，CONHCH2COO)實(shí)施例220-O-[(N-叔丁氧羰基)-6-氨基己?；?甘氨酰基]喜樹堿[11an＝5，R9＝t-Boc，OCPT＝(2a)]的制備將喜樹堿(2a；3.4g，10mmol)用二甲基亞砜(50ml)懸浮，用N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己?；?甘氨酰基對(duì)硝基苯基酯(10a；6.3g，15mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.4g，20mmol)處理。反應(yīng)混合物保持24小時(shí)，然后加入另一部分N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨?；鶎?duì)硝基苯基酯(6.3g，15mmol)。48小時(shí)后，反應(yīng)混合物用二氯甲烷(500ml)稀釋，用0.2N含水鹽酸(2×250ml)和水(2×250ml)洗滌。有機(jī)相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，然后在減壓下除去溶劑。將殘余物用二氯甲烷(100ml)溶解，加入乙醚(500ml)，在0℃下保持過(guò)夜，得到5g固體形式的標(biāo)題化合物(11a)。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脫系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(95/5v/v)，Rf＝0.44。
實(shí)施例320-O-(6-氨基己?；?甘氨酰基)喜樹堿[6an＝5，OCPT＝(2a)]的制備將20-O-[(N-叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨?；鵠喜樹堿(11a；5g)用90％含水三氟乙酸(40ml)處理一小時(shí)，然后在減壓下除去溶劑。殘余物用乙醚(300ml)研制，過(guò)濾出來(lái)。將固體溶于甲醇(200ml)，在減壓下濃縮至小體積(50ml)，加入乙醚(300ml)。收集沉淀，得到3.9g標(biāo)題化合物(6a)。
Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脫系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(80/20/7/3v/v)，Rf＝0.83。
實(shí)施例420-O-[異丁烯?；?甘氨?；?(6-氨基己酰基)-甘氨?；鵠喜樹堿[9an＝5，OCPT＝(2a)]的制備將20-O-(6-氨基己?；?甘氨?；?喜樹堿三氟乙酸鹽(6a；2.53g，4mmol)用無(wú)水二甲基亞砜(10ml)溶解，加入如《大分子化學(xué)》178，2159(1977)中所述制備的異丁烯?；?甘氨?；鶎?duì)硝基苯基酯(1.32g，5mmol)和三乙胺(0.56ml，4mmol)。在室溫下保持過(guò)夜后，將溶液傾入水(100ml)中，收集沉淀，用水(2×100ml)洗滌。固體物質(zhì)經(jīng)過(guò)硅膠快速色譜，使用二氯甲烷/乙醇混合物(95/5v/v)作為洗脫系統(tǒng)，得到2.2g標(biāo)題化合物(9a)。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脫系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇(9/1v/v)，Rf＝0.62。1H-NMR(200MHz，DMSO)δ0.90(t，J＝7.3Hz，3H，CH3-18)；1.1-1.6[m，6H，NHCH2-(CH2)3-CH2CO]；2.0-2.2[m，4H，CH2-19+NH-(CH2)4-CH2-CO]；2.95(q，J＝6.3Hz，2H，NH-CH2-(CH2)4CO)3.63(d，J＝5.8Hz，2H，CONH-CH2-CONH)；3.97(dd，J＝17.8，5.9Hz，1H，CONHCHaCHbCOO)；4.15(dd，J＝17.8，5.9Hz，1H，CONHCHaCHbCOO)；5.29(s.2H，CH2-5)；5.33[q，J＝1.6Hz，1H，CH3CH＝C(Ha)(Hb)]；5.48(s，2H，CH2-17)；5.69[m，1H，CH3CH＝C(Ha)(Hb)]；7.15(s，1H，H-14)；7.6-7.9(m，3H，H-10+H-11+NH-(CH2)5CO]；8.0(t，J＝5.8Hz，1H，CO-NH-CH2CONH)；8.15(m，2H，H-9+H-12)；8.32(t，J＝5.9Hz，1H，CO-NH-CHaCHbCOO)；8.69(s，1H，H-7).
實(shí)施例57-乙基-10-羥基-20-O-(6-氨基己酰基-甘氨?；?喜樹堿三氟乙酸鹽[6bn＝5，OCPT＝(2d)]的制備將7-乙基-10-羥基喜樹堿(2d，0.8g，2mmol)、N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨?；鶎?duì)硝基苯基酯(10a；2.5g，6mmol)和4-二甲氨基吡啶用無(wú)水二甲基亞砜(30ml)溶解，在室溫下攪拌下保持3天。之后將反應(yīng)混合物傾入0.1N含水鹽酸(500ml)，得到沉淀，收集之，然后將其溶于二氯甲烷(300ml)，用水(2×100ml)洗滌。分離有機(jī)相，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，在減壓下蒸發(fā)。殘余物用90％含水三氟乙酸(40ml)處理三小時(shí)，然后在減壓下除去溶劑，殘余物經(jīng)過(guò)硅膠快速色譜，使用二氯甲烷/乙酸/甲醇混合物(100/5/20v/v)作為洗脫系統(tǒng)。匯集含有標(biāo)題化合物的級(jí)分，在減壓下蒸發(fā)，得到1.02g(6b)，為三氟乙酸鹽衍生物。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脫系統(tǒng)為二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(80/20/7/3v/v)，Rf＝0.4。1H-NMR(200MHz，DMSO)δ0.89(t，J＝7.2Hz，3H，CH3-CH2-20)；1.1-1.5(m，9H，NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2+CH3-CH2-7)；1.80(s，3H，CH3-COOH)；2.10(m，4H，CH3-CH2-20+CH2-CONH)；2.53(t，6.8Hz，2H，CH2-NH2)；3.06(m，2H，CH3-CH2-7)；3.98，4.13(two-dd，J＝17.6，5.7Hz，2H，CONH-CH2-CO)；5.27(s，2H，CH2-5)；5.46(s，2H，CH2-17)；7.01(s，1H，H-14)；7.40(m，2H，H-9+H-11)；7.99(d，J＝9.8Hz，1H，H-12)；8.33(t，J＝5.7Hz，1H，CONH-CH2-CO)實(shí)施例6鹽酸7-乙基-10-羥基-20-O-(6-氨基己?；?甘氨酰基)喜樹堿[6bn＝5，OCPT＝(2d)]的制備如實(shí)施例5所述，使7-乙基-10-羥基喜樹堿(2d，0.8g，2mmol)與N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨?；鶎?duì)硝基苯基酯(10a；2.5g，6mmol)和4-二甲氨基吡啶反應(yīng)。反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取，得到粗物質(zhì)，將其溶于1.5N鹽酸和乙酸(20ml)混合物中。在室溫下攪拌下放置一小時(shí)后，溶液蒸餾至小體積，加入乙醚(100ml)。收集沉淀，用乙醚(2×50ml)洗滌，得到1g標(biāo)題化合物(6h)，為游離氨基衍生物。
實(shí)施例7通過(guò)途徑I制備MAG-喜樹堿[A1n＝5，OCPT＝(2a)]將如《大分子化學(xué)》178，2159(1977)中所述制備的聚合物前體B(R2＝對(duì)硝基苯氧基，2.58g，含有1.16×10-3當(dāng)量對(duì)硝基苯基酯殘基)用無(wú)水二甲基亞砜(15ml)溶解，加入20-O-(6-氨基己?；?甘氨?；?喜樹堿三氟乙酸鹽(6a；0.63g，1mmol)，然后加入三乙胺(0.14ml，1mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌下保持22小時(shí)，然后加入2-丙醇胺(0.05ml)，混合物再攪拌下放置一小時(shí)。之后，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(200ml)進(jìn)行沉淀，攪拌下放置30分鐘。在燒結(jié)玻璃漏斗上收集固體物質(zhì)，用乙酸乙酯(200ml)和乙醚(100ml)洗滌，然后用乙醇(30ml)溶解。在攪拌下，醇溶液用磺酸型濕DOWEX-50(1.2g)處理30分鐘，之后，滴加到正己烷(200ml)中。在燒結(jié)玻璃漏斗上收集沉淀，用乙醚洗滌，干燥至恒重，得到2.68g標(biāo)題化合物(A1)。
重均分子量(Mw)19,800。多分散性(Mw/Mn)1.5。堿解后測(cè)定喜樹堿含量為10％w/w。
實(shí)施例8
通過(guò)途徑I制備MAG-(7-乙基-10-羥基喜樹堿)[A2n＝5，OCPT＝(2d)]將如《大分子化學(xué)》178，2159(1977)中所述制備的聚合物前體(B)(R2＝對(duì)硝基苯氧基，2.58g，含有1.16×10-3當(dāng)量對(duì)硝基苯基酯殘基)用無(wú)水二甲基亞砜(15ml)溶解，加入7-乙基-10-羥基-20-O-(6-氨基己?；?甘氨?；?喜樹堿三氟乙酸鹽(6b；0.68g，1mmol)，然后加入三乙胺(0.14ml，1mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌下保持22小時(shí)，然后加入2-丙醇胺(0.05ml)，混合物在攪拌下再放置一小時(shí)。之后，反應(yīng)混合物用乙酸乙酯(200ml)進(jìn)行沉淀，攪拌下放置30分鐘。在燒結(jié)玻璃漏斗上收集固體物質(zhì)，用乙酸乙酯(200ml)和乙醚(100ml)洗滌，然后用乙醇(30ml)溶解。在攪拌下，醇溶液用磺酸型濕DOWEX-50(1.2g)處理30分鐘，之后，滴加到正己烷(200ml)中。在燒結(jié)玻璃漏斗上收集沉淀，用乙醚洗滌，干燥至恒重，得到2.68g標(biāo)題化合物(A2)。
重均分子量(Mw)20,500。多分散性(Mw/Mn)1.87。堿解后測(cè)定7-乙基-10-羥基-喜樹堿含量為10％w/w。
實(shí)施例9通過(guò)途徑II制備MAG-喜樹堿[A1n＝5，OCPT＝(2a)]將20-O-[異丁烯酰基-甘氨?；?(6-氨基己酰基)-甘氨?；鵠喜樹堿(9a；1.26g，2mmol)、如《大分子化學(xué)》178，2159(1977)中所述制備的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺(8，4.4g，31mmol)和2，2’-偶氮二異丁腈(0.26g，1.6mmol)用無(wú)水二甲基亞砜(20ml)溶解，保持在60℃、氮?dú)庀?，攪?4小時(shí)。之后，反應(yīng)混合物在室溫下冷卻，傾入乙酸乙酯(500ml)中。收集沉淀，用乙醇(50ml)溶解，加入乙酸乙酯(500ml)再次進(jìn)行沉淀。收集固體，用乙酸乙酯乙醚(2×100ml)洗滌，得到5g標(biāo)題化合物(A1)。
權(quán)利要求
1.聚合共軛物，由下列組成(i)85至97mol％的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元，由式(3)代表
(ii)3至15mol％的20-O-(N-異丁烯?；?甘氨?；?氨?；?-喜樹堿單元，由式(4)代表
其中n是2至8，-[O-CPT]代表式(2)的喜樹堿殘基
該殘基在C-20位上連接，其中R1、R2、R3、R4和R5是相同或不同的，它們各自是氫，C1-C12直鏈或支鏈烷基，硝基，氨基，(CH2)aNR6R7，其中a是0至4，R6和R7是氫，或者R6或R7之一是氫而R6或R7的另一個(gè)是C1-C6烷基，或者NR6R7代表可選被C1-C6直鏈或支鏈烷基取代的哌嗪子基或N-烷基-哌嗪子基環(huán)，或者代表哌啶子基環(huán)，(CH2)aNHCOR8，其中a是如上所定義的，R8是C1-C8直鏈或支鏈烷基或如上的基團(tuán)NR6R7，羥基或O-CO-R8，其中R8是如上所定義的或者代表1-哌啶子基環(huán)或1，4’-聯(lián)哌啶，或者R2與R3共同代表殘基O-(CH2)b-O，其中b是1或2，或者R4與R5代表殘基(CH2)m，其中m是2至4，或者代表殘基CH2-O-CH2或CH2NHCH2，以及(iii)0至12mol％的N-異丁烯?；?甘氨酸或N-(2-羥基丙基)異丁烯酰基-甘氨酰胺單元，由式(5)代表
其中[Z]代表羥基或式-NH-CH2-CH(OH)-CH3殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合共軛物，它含有摩爾比例為90％的由式(3)代表的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合共軛物，它含有10mol％由式(4)代表的單元。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合共軛物，其中不存在式(5)單元。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合共軛物，其中式(4)中的-[O-CPT]是式(2)的喜樹堿殘基，選自喜樹堿、9-氨基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、7-乙基-10-羥基喜樹堿、7-乙基-10-[1，4’-聯(lián)哌啶基]羰基氧基喜樹堿、7-亞甲基二甲氨基-10-羥基喜樹堿和7-[亞甲基-(4’-甲基哌嗪子基)]-9，10-亞乙二氧基喜樹堿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合共軛物，其中式(2)活性喜樹堿衍生物的含量為10％(w/w)。
7.用于制備如權(quán)利要求1所定義的聚合共軛物的方法，該方法包括使式(6)的20-O-(氨?；?甘氨酰基)喜樹堿衍生物NH2-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](6)其中n和[O-CPT]是如權(quán)利要求1所定義的，與聚合物(B)反應(yīng)，該聚合物(B)基本上由下列成分組成85至97mol％如權(quán)利要求1所定義的由式(3)代表的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺單元，和3至15mol％由式(7)代表的N-異丁烯酰基-甘氨?；苌飭卧?br> 其中[Y]是一種活性酯的殘基或羥基；并且可選地用1-氨基-2-丙醇置換殘留的活性酯基團(tuán)。
8.用于制備如權(quán)利要求1所定義的聚合共軛物的方法，該方法包括式(8)的N-(2-羥基丙基)異丁烯酰胺
與式(9)的20-O-[異丁烯酰基-甘氨?；?(氨?；?-甘氨?；鵠喜樹堿衍生物
其中n和[OCPT]是如權(quán)利要求1所定義的，之間的聚合反應(yīng)，反應(yīng)在能夠保持喜樹堿與甘氨?；?氨?；?甘氨?；g隔基之間的連接性質(zhì)以及共軛物性質(zhì)的條件下進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求7所定義的式(6)的20-O-酰氨基-甘氨酰基-喜樹堿衍生物或其鹽。
10.用于制備如權(quán)利要求7所定義的式(6)化合物的方法，該方法包括縮合如權(quán)利要求1所定義的式(2)衍生物與式(10)的N-保護(hù)的氨酰基-甘氨?；苌颮9-HN-(CH2)n-CO-Gly-[P] (10)其中n是如權(quán)利要求1所定義的，R9代表一種氨基保護(hù)基團(tuán)，[P]是一種活性酯的殘基，得到由式(11)代表的化合物R9-NH-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](11)其中n和R9是如上所定義的，[OCPT]是如權(quán)利要求1所定義的；以及從所得化合物中除去N-保護(hù)基團(tuán)。
11.如權(quán)利要求8所定義的式(9)的20-O-[異丁烯酰基-甘氨?；?(氨酰基)-甘氨?；鵠喜樹堿衍生物或其鹽。
12.用于制備如權(quán)利要求11所定義的式(9)衍生物的方法，該方法包括縮合如權(quán)利要求7所定義的式(6)喜樹堿衍生物與式(7’)的N-異丁烯?；?甘氨?；?br> 其中[Y’]是一種離去基團(tuán)。
13.藥物組合物，包含一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體，以及如權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)所定義的聚合共軛物或如權(quán)利要求9和11所定義的式(6)或(9)化合物作為活性成分。
全文摘要
喜樹堿的水溶性聚合共軛物包含通過(guò)式－Gly－(CH
文檔編號(hào)C08F220/60GK1272796SQ98809774
公開日2000年11月8日 申請(qǐng)日期1998年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月3日
發(fā)明者F·安格露西, F·奧基, G·法琴, V·凱奧法, M·加麥, A·索拉托 申請(qǐng)人:法瑪西雅厄普約翰公司