一種人血清白蛋白負(fù)載喜樹堿類藥物的納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白蛋白負(fù)載喜樹堿類前藥納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明采用去溶劑法成功制備了白蛋白載藥納米粒，該法簡(jiǎn)單、易操作，重復(fù)性好。制備的白蛋白載藥納米粒具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力，證實(shí)白蛋白載藥納米粒具有廣闊的抗腫瘤應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種人血清白蛋白負(fù)載喜樹堿類藥物的納米顆粒及其制備方 法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物領(lǐng)域，具體涉及白蛋白載喜樹堿類抗腫瘤藥物納米顆粒的 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]利用納米載體及相關(guān)技術(shù)輸送抗癌藥物是目前腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究問題。納 米藥物主要有如下優(yōu)點(diǎn)：1)腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞間隙相對(duì)疏松，200nm以下的納米?？赏ㄟ^ 實(shí)體瘤的高通透與滯留效應(yīng)(EPR)被動(dòng)地進(jìn)入腫瘤組織。此外，納米粒本身可以被配體分子 修飾用于主動(dòng)靶向，無論是納米粒的主動(dòng)或被動(dòng)靶向作用，都可使藥物在腫瘤組織中富集， 在增加藥物療效的同時(shí)，相對(duì)減少了藥物劑量，使得抗癌藥物的毒副作用也大大降低。2)納 米?？梢蕴岣咚幬锏娜芙庑院头€(wěn)定性，為藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征不理想的藥物進(jìn)入臨床提供 可能性;尤其是對(duì)于水溶性極差的抗腫瘤藥物，通過納米技術(shù)，可提高難溶性藥物在水溶液 中的溶解性，達(dá)到增溶的目的。3)被納米粒包裹后的藥物降低了跟血液接觸的機(jī)會(huì)，使得藥 物在血液循環(huán)中的半衰期得以提高。通過對(duì)載藥納米粒進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)及載體的構(gòu)建，納 米載體及藥物已經(jīng)在抗腫瘤研究中取得了良好的應(yīng)用前景。
[0003]組成納米粒的各種物質(zhì)對(duì)最終制劑的性質(zhì)有很大影響，因此制備納米時(shí)應(yīng)考慮所 用的單體、聚合物及賦形劑的生物相容性、毒性等問題，優(yōu)先使用毒性低、內(nèi)源性或可被生 物降解成具有良好生理相容性的材料。
[0004] 白蛋白為內(nèi)源性物質(zhì)，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，具有安全無毒、可生物降解、 生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為理想的藥物載體（參考文獻(xiàn)4.0上12叩他 7，11.5&11^&11(1 N.A.Elgindy.Albumin-based nanoparticles as potential controlled release drug delivery systems. J.Controlled Release，2012,157，168_182·)。結(jié)合了納米粒載體和白 蛋白性質(zhì)兩方面優(yōu)勢(shì)白蛋白納米載藥系統(tǒng)近年來受到廣泛的關(guān)注，為難溶性藥物制劑的開 發(fā)提供了新的思路。其中由美國(guó)AbraxisBioSciencelnc.開發(fā)的紫杉醇人血清白蛋白納米 粒注射劑(Aferaxane 111)于2005年1月獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)上市，主要用于化療失敗的乳腺 癌患者的治療。Abraxane·是第一個(gè)上市的以nab技術(shù)為基礎(chǔ)的藥物。臨床研究顯示，該紫 杉醇蛋白納米粒比其聚氧乙烯蓖麻油制劑有更高的治療指數(shù)和安全性，并且避免了使用皮 質(zhì)類固醇的術(shù)前給藥，顯示了人血清白蛋白作為靜脈應(yīng)用載體的廣闊前景。因此，以蛋白質(zhì) 為基礎(chǔ)的納米醫(yī)學(xué)已迅速成為藥物遞送系統(tǒng)研究的最新熱點(diǎn)，具有非常重要的臨床應(yīng)用價(jià) 值。
[0005] 7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)是天然抗腫瘤藥物喜樹堿的半合成衍生物，具有抗 癌作用強(qiáng)、抗癌活性高的特點(diǎn)，可通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I引起細(xì)胞凋亡。該化合物的活性 是上市藥物伊立替康活性的100~1000倍。但SN38不溶于水及藥劑學(xué)可以接受的溶劑(如吐 溫或者聚氧乙烯蓖麻油），因此無法直接用于臨床注射。其水溶性衍生物伊立替康(CPT-11) 進(jìn)入體內(nèi)后不穩(wěn)定、消除快、血藥濃度維持時(shí)間短;此外在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成具有治療效果的SN38 依賴于羧酸酯酶的活性，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低于8 %，嚴(yán)重影響其療效。SN38由于其脂溶性較差，難 以直接與白蛋白溶液混合后被包埋進(jìn)入白蛋白納米粒中，因此，需要采用化學(xué)方法對(duì)藥物 分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，使其能夠被成功包埋，從而構(gòu)建白蛋白載藥納米粒。目前尚未見有將白 蛋白作為喜樹堿類抗腫瘤藥物載體的相關(guān)報(bào)道。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種人血清白蛋白負(fù)載喜樹堿類藥物的納米顆粒及其制備方法和 應(yīng)用，該方法步驟簡(jiǎn)單，可工業(yè)化大批量生產(chǎn)。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種白蛋白載藥納米粒在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯 示，使用本發(fā)明的人血清白蛋白包裹后的納米藥物，對(duì)比臨床藥物伊立替康具有更高的抗 腫瘤細(xì)胞活性。
[0009] -種白蛋白載藥納米粒的制備方法，包括：向抗腫瘤藥物和白蛋白的混合物中加 入無水乙醇，再加入交聯(lián)劑，透析后得到載藥納米粒；
[0010] 所述的抗腫瘤藥物為喜樹堿類抗腫瘤藥物。
[0011 ]作為優(yōu)選，所述的白蛋白為人血清白蛋白。
[0012]作為優(yōu)選，所述的喜樹堿類抗腫瘤藥物是由7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN38)通過酯 鍵與不飽和脂肪酸連接形成的藥物前體，結(jié)構(gòu)如式(I)所示：
[0013] (I)
[0014] 其中，R表示不飽和脂肪酸。
[0015]作為優(yōu)選，所述的不飽和脂肪酸為全反式維甲酸(RA)、二十二碳六烯酸(DHA)、亞 麻酸或亞油酸。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的交聯(lián)劑為戊二醛，進(jìn)一步優(yōu)選為濃度8 %的戊二醛溶液。
[0017] 作為優(yōu)選，混合物中抗腫瘤藥物與白蛋白的摩爾比為10:1~1:10。
[0018] 作為優(yōu)選，無水乙醇的體積是混合物體積的1~5倍。
[0019]作為優(yōu)選，每毫克白蛋白中加入的交聯(lián)劑體積在0.2~1.5yL之間。
[0020] 所述白蛋白載藥納米粒的具體制備方法如下：
[0021] (1)在人血清白蛋白與抗腫瘤藥物或抗腫瘤藥物前藥的混合溶液中，滴加無水乙 醇;該步驟中，無水乙醇為混合溶液的體積的1~5倍，進(jìn)一步優(yōu)選為3倍。
[0022] (2)在步驟(1)后，加入8 %戊二醛溶液;該步驟中戊二醛溶液的體積與人血清白蛋 白質(zhì)量的比例為(0.2~1.5)yL: lmg，進(jìn)一步優(yōu)選為1.4yL/mg。
[0023] (3)步驟(2)反應(yīng)后溶液，經(jīng)透析去除多余戊二醛和無水乙醇，得到白蛋白載抗腫 瘤藥物或抗腫瘤藥物前藥的納米粒溶液。
[0024] 本發(fā)明提供了一種所述的制備方法制備得到的白蛋白載藥納米粒。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種所述的白蛋白載藥納米粒在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明中，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，與腸癌細(xì)胞系HCT-116共培養(yǎng)48h后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)腫 瘤細(xì)胞的存活率都有一定的影響。其中，HSA-SN38-NPs對(duì)腸癌細(xì)胞系HCT-116的IC5Q值為 0.14μΜ，與SN38細(xì)胞毒性接近，但抗腫瘤細(xì)胞活性是CPT-11的233倍;與HCT-116共培養(yǎng)72h 后，HSA-SN38-NPs對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率影響更明顯，是CPT-11的464倍。
【附圖說明】
[0027] 圖1為RA-SN38的合成路線圖；
[0028]圖2為亞油酸-SN38的合成路線圖；
[0029]圖3為亞麻酸-SN38的合成路線圖；
[0030] 圖4為DHA-SN38的合成路線圖；
[0031]圖5為實(shí)施例9中制備的納米粒電鏡圖 [0032]圖6為實(shí)施例9中制備的納米粒粒徑圖 [0033]圖7為實(shí)施例10中制備的納米粒電鏡圖 [0034]圖8為實(shí)施例10中制備的納米粒粒徑圖
[0035]圖9實(shí)施例6制備的納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞HCT-116的抑制效果(48h);
[0036] 圖10實(shí)施例6制備的納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞HCT-116的抑制效果(72h);
[0037] 圖中，RA表示全反式維甲酸，SN38表示7-乙基-10-羥基喜樹堿，DISC表示N，N'_二 異丙基碳二酰亞胺，DMAP表示4-二甲氨基吡啶，DIEA表示N，N-二異丙基乙胺，anhydrous DMF表示無水N，N-二甲基甲酰胺，RA-SN38表示全反式維甲酸與SN38偶聯(lián)物。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不受其限 制。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] RA-SN38合成方法參考
【申請(qǐng)人】前期專利"一種全反式維甲酸-喜樹堿類抗癌藥物偶 聯(lián)物及其制備方法和應(yīng)用"，專利申請(qǐng)?zhí)柣驅(qū)＠?hào)為201410692682.7。
[0041] 合成路線如圖1所示。
[0042] 實(shí)施例2
[0043]亞油酸-SN38合成方法參考
【申請(qǐng)人】前期專利"7-乙基-10-羥基喜樹堿藥物前體及 其制備方法和應(yīng)用"，專利申請(qǐng)?zhí)枮?01410295432.X。
[0044] 合成路線如圖2所示。
[0045] 實(shí)施例3
[0046]亞麻酸-SN38合成方法參考
【申請(qǐng)人】前期專利"7-乙基-10-羥基喜樹堿藥物前體及 其制備方法和應(yīng)用"，專利申請(qǐng)?zhí)枮?01410295432.X。
[0047] 合成路線如圖3所示。
[0048] 實(shí)施例4
[0049] DHA-SN38合成方法參考
【申請(qǐng)人】前期專利，專利申請(qǐng)?zhí)枮?01410295432.X。
[0050]合成路線如圖4所示。
[0051 ] 實(shí)施例5
[0052] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比 10:1)
[0053] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實(shí)施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比10:1，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，粒徑101 ±35nm。
[0054] 實(shí)施例6
[0055] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比5:1)
[0056] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實(shí)施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比5:1，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，粒徑109 ± 16nm。
[0057] 實(shí)施例7
[0058] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比1:1)
[0059] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實(shí)施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比1:1，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500 )4h后得到納米粒溶液，粒徑97 ± 22nm。
[0060] 實(shí)施例8
[0061 ]制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比 1:5)
[0062] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實(shí)施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比1:5，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，粒徑107 ± 17nm。
[0063] 實(shí)施例9
[0064] 制備 HSA-RA-SN38 納米粒(HSA 與 RA-SN38 摩爾比 1:10)
[0065] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實(shí)施例1制備的RA-SN38(20mg/mL溶于DMS0)， HSA與SN38摩爾比1:10，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8 %戊二醛溶液，攪拌過 夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，由圖5可見，HSA-RA-SN38納米粒大小均勻，呈球 形，由圖6可見，納米粒分布均勾，粒徑102 ±34nm。
[0066] 實(shí)施例10
[0067] 制備HSA-亞油酸-SN38納米粒(HSA與亞油酸-SN38摩爾比1:10)
[0068] 稱取10mg HSA，溶于lmL水中，加入實(shí)施例7制備的亞油酸-SN38(20mg/mL溶于 DMSO)，HSA與SN38摩爾比1:10，攪拌20min，加入3mL無水乙醇，再加入14yL 8%戊二醛溶液， 攪拌過夜，透析(Mw 3500)4h后得到納米粒溶液，由圖7可見，HSA-亞油酸-SN38納米粒大小 均勾，呈球形，由圖8可見，納米粒分布均勾，粒徑153 ±35nm。
[0069] 實(shí)施例11
[0070] 考察實(shí)施例9中HSA-SN38-NPs對(duì)腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制作用，具體方法如下：
[0071 ]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板(5000個(gè)細(xì)胞/孔）。放入在37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱 中恒溫培養(yǎng)24h后，加入HSA-SN38-NPs，取7個(gè)濃度梯度，以SN38(溶于二甲亞砜)作為對(duì)照 組，每種藥每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù)值，加完藥后將96孔細(xì)胞板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48或72h后， 在96孔板的每孔內(nèi)加入30yL的四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，吸 棄培養(yǎng)基，每孔加入l〇〇yL二甲亞砜，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率，繪 制出細(xì)胞存活曲線（圖9-10)，得到藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的IC 5Q (半數(shù)抑制濃度）。HSA-SN38-NPs對(duì) 各種腫瘤細(xì)胞的體外毒性結(jié)果見表1。
[0072]表1各試驗(yàn)藥物的體外細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)結(jié)果(μΜ)
[0073]
[0074] 表1結(jié)果顯示，與腸癌細(xì)胞系HCT-116共培養(yǎng)48h后，各實(shí)驗(yàn)組對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率 都有一定的影響。其中，HSA-SN38-NPs對(duì)腸癌細(xì)胞系HCT-116的IC 5Q值為0.14μΜ，與SN38 (0.22μΜ)細(xì)胞毒性接近，但抗腫瘤細(xì)胞活性是CPT-11的233倍；與HCT-116共培養(yǎng)72h后， HSA-SN38-NPs對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率影響更明顯，是CPT-11的464倍。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明， HSA-SN38-NPs具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力，證實(shí)HSA-SN38-NPs具有廣闊的抗腫瘤 應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，包括：向抗腫瘤藥物和白蛋白的混 合物中加入無水乙醇，再加入交聯(lián)劑，得到載藥納米粒， 所述的抗腫瘤藥物為喜樹堿類抗腫瘤藥物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的白蛋白為 人血清白蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的喜樹堿類 抗腫瘤藥物是由7-乙基-10-羥基喜樹堿通過酯鍵與不飽和脂肪酸連接形成的藥物前體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的不飽和脂 肪酸為全反式維甲酸(RA)、二十二碳六烯酸(DHA)、亞麻酸或亞油酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)劑為 戊二醛。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，混合物中抗腫瘤 藥物與白蛋白的摩爾比為10:1~1:10。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，無水乙醇的體積 是混合物體積的1~5倍。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白蛋白載藥納米粒的制備方法，其特征在于，每毫克白蛋白中 加入的交聯(lián)劑體積在〇. 2~1.5yL之間。9. 一種如權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的白蛋白載藥納米粒。10. -種如權(quán)利要求9所述的白蛋白載藥納米粒在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105997943SQ201610496426
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】王杭祥, 陳建美
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)