專利名稱：一種喜樹堿及其衍生物的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥及化工技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)計喜樹堿及其衍生物的純化方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿及其衍生物具有下面的五環(huán)母體結(jié)構(gòu)
一般由下列幾類方法純化 重結(jié)晶
喜樹堿類化合物游離狀態(tài)時一般水溶性、脂溶性均較差，故給一般溶劑體系的重結(jié)晶帶 來很大難度。通常以有機酸醋酸、極性非質(zhì)子溶劑DMF,DMSO等進行反復(fù)重結(jié)晶，效果粗略，
不能準確做到對特定雜質(zhì)有針對性地分離純化，亦難以通過控制純化條件得到不同質(zhì)量規(guī)
格的精制品。且母液中的樣品與溶劑均不易回收套用。
化學(xué)純化
2002年專利CN1491228A報道，通過3步化學(xué)方法進行喜樹堿的純化將喜樹堿溶解于 堿溶液，使其內(nèi)酯開環(huán)，再催化加氫還原，最后酸化水相使喜樹堿結(jié)晶析出。此方法僅針 對喜樹堿粗原料中的特殊雜質(zhì)，通用性有限，且需要特殊的加氫設(shè)備和貴金屬催化劑，成 本較高。 色譜純化
利用制備或半制備色譜柱進行純化，能夠針對粗原料和雜質(zhì)的特性優(yōu)化色譜條件，以獲得較好的分離度和洗脫效果，盡量減少主成分與雜質(zhì)的交匯；同時可以通過跟蹤監(jiān)測洗脫 產(chǎn)品的色譜峰形來分類、分段收集不同規(guī)格的產(chǎn)品，或富集雜質(zhì)。較好的色譜系統(tǒng)可以實 現(xiàn)快速、高效的分離，能夠快速再生、循環(huán)使用；交匯部分的產(chǎn)品以及常規(guī)的有機洗脫劑 均能回收套用。
較常見的色譜方法是正相硅膠柱分離，以氯仿/甲醇洗脫(安輝，7-乙基-10-羥基喜樹 堿的合成，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005, 36(5) 264-265)。此法常用于研發(fā)，大生產(chǎn)時大量 使用氯仿毒性過大，且溶劑價格昂貴。硅膠柱難以重復(fù)利用，分離速度慢。
2005年的專利CN1834097A[3]，利用正相硅膠柱進行HCPT的分離，使用大量DMF， DMS0 等強極性溶劑洗脫，在硅膠柱中易產(chǎn)生拖尾，且價格較高，通用性不強。
2005年的專利CN1760195A[4]，用硅膠柱分離9一硝基喜樹堿，乙酸乙酯/正己烷洗脫， 此體系對大多數(shù)喜樹堿類物質(zhì)溶靜性很差，無法推廣。
因此，增加喜樹堿類物質(zhì)在洗脫體系中的溶解性，優(yōu)化洗脫條件，是提高色譜分離效率 的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以精密、穩(wěn)定的方法實現(xiàn)喜樹堿及其衍生物的快速、連續(xù)分離純化，顯 著提高收率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本，使之更適應(yīng)于工業(yè)生產(chǎn)。高質(zhì)量、高收率的喜樹堿系 列中間體是滿足喜樹堿類藥物生產(chǎn)要求和進出口需要的有力保障。
為達到精細分離，保證一次分離精品純度99%以上并保證收率，本發(fā)明采用了制備色譜 純化方法。但是，由于喜樹堿類物質(zhì)的低脂溶性， 一般正相洗脫劑溶解性差，如使用氯仿/ 甲醇體系，大量使用氯仿毒性高，且溶劑價格貴，回收不易。研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿類物質(zhì)在 中性至堿性環(huán)境下，內(nèi)酯環(huán)易開環(huán)失活，穩(wěn)定性差；而在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且溶解性 增加。此外，進一步的研究亦發(fā)現(xiàn)，用酸性水/醇體系的反相高效液相條件對喜樹堿類物質(zhì) 進行微量純度分析，通常有更好的分離效果。根據(jù)上述性質(zhì)和發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在反相制備液 相的醇/水或乙腈/水洗脫劑基礎(chǔ)上引入緩沖體系，調(diào)節(jié)PH值至酸性，以助溶并起穩(wěn)定喜樹 堿內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的作用，必要時加入離子對試劑優(yōu)化分離效果，最終獲得了良好的純化效果。
本發(fā)明公開了一種喜樹堿及其衍生物的純化方法，為利用制備色譜柱進行分離純化，包 括樣品溶解、上柱、洗脫及組分收集，其中，色譜柱洗脫采用的洗脫液為醇/水體系(即醇 與水相混合后的體系)或乙腈/水體系(即乙腈與水相混合后的體系)，在醇/水體系中，醇
選自甲醇、乙醇、異丙醇、乙二醇或丁醇等C5以下的醇，且水相pH為2-5，優(yōu)選2.5-3.7。 上述樣品溶解的溶劑即為洗脫液。
上述制備色譜柱為常壓、中壓或高壓制備色譜柱，其固定相填料可選自大孔樹脂、反相 硅填料或酸性氧化鋁，其中反相硅填料為球形或無定形的C18填料、C8填料、苯基填料或 氰基填料。
上述醇/水體系中，水相為酸性緩沖溶液，其中，配制緩沖溶液的酸選自鹽酸、磷酸、 硼酸、甲酸、醋酸、三氟醋酸、鄰苯二甲酸或酒石酸中的一種或多種；配制緩沖溶液的鹽 選自磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硼砂、碳酸氫鈉、碳酸鈉、甲 酸鈉、甲酸銨、醋酸鈉、醋酸銨、三氟醋酸鈉、三氟醋酸銨、鄰苯二甲酸氫鈉、鄰苯二甲 酸二鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、鄰苯二甲酸二鉀、酒石酸氫鉀、酒石酸氫鈉、酒石酸氫鉀、酒 石酸二鈉或酒石酸二鉀中的一種或多種。如水相中含有甲酸-甲酸銨、醋酸-醋酸鈉或醋酸 銨、磷酸一磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀，或三氟醋酸一三氟醋酸銨等緩沖對。
必要時，上述洗脫液中還可再添加微量C4-C20的烷基磺酸鈉等離子對試劑，以增加保 留，改善分離效果，其中，C4-C20的烷基磺酸鈉在洗脫液中的重量百分含量為萬分之零點 二 萬分之二十。
較佳的，上述醇/水或乙腈/水體系中，有機相與水相的體積比為9: 1 1: 9之間，優(yōu) 選7: 3 3: 7。
組分收集時，可分段收集洗脫液，以做到分離不同組分或得到不同純度水平的產(chǎn)品。 收集的中段洗脫液經(jīng)濃縮蒸除大部分醇或乙腈，并加水稀釋，所收集的醇或乙腈可回收 套用。水相調(diào)PH至中性后，直接析出產(chǎn)品晶體；或以常用二鹵、三卣代烴(如二氯甲烷、 1， 2 —二氯乙垸、三氯甲烷等)萃取，濃縮后得到產(chǎn)品晶體。所得晶體經(jīng)不良溶劑如甲醇、
乙醇、乙酸乙酯、正己垸、丙酮等洗滌后，即得到99%以上的精品。 一次收率60—95%左 右。含有產(chǎn)品的前、后段洗脫液可合并收集，作為新的批次循環(huán)純化，以進一步提高收率， 避免浪費。
當(dāng)喜樹堿衍生物是鹽的形式時，經(jīng)分離及收集、后處理后成為游離堿?？梢圆捎猛ㄓ玫?成鹽方法使其重新成鹽。如將產(chǎn)物溶解或混懸于甲醇、乙醇等溶劑，攪拌下通入氯化氫氣 體，使其成為鹽酸鹽后，過濾，丙酮洗滌即可。
本發(fā)明中，喜樹堿及其衍生物在喜樹堿五環(huán)結(jié)構(gòu)母體基礎(chǔ)上，Rl代表H, C1-C20的烷基、 C1-C20的取代垸基，垸氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮，羧基，酯基，羥基，芐基或取代 芐基，氰基，硝基，鹵素原子，雜環(huán)取代基等，
R2代表H， CI-C20的烷基，CI-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，鹵素原子，雜環(huán)取代基等，
R3代表H， CI-C20的垸基，C1-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子，哌啶基哌啶，以及其它雜 環(huán)取代基等，
R4代表H, C1-C20的垸基，C1-C20的取代烷基，垸氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子，雜環(huán)取代基等，
R5代表H， CI-C20的垸基，CI-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛，酮， 羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子，雜環(huán)取代基等，
R6選自H， C1-C20的垸基，C1-C20的取代烷基，?；?，
R7選自H， C1-C20的垸基，Q-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子，或雜環(huán)取代基， 以及上述物質(zhì)可能的鹽形式。
上述喜樹堿及其衍生物包括但不限于喜樹堿、7—乙基喜樹堿、5—羥基喜樹堿、10— 羥基喜樹堿、IO—甲氧基喜樹堿、5， IO—二羥基喜樹堿、5—羥基一9一溴一10—甲氧基喜 樹堿、7—乙基—IO—羥基喜樹堿、7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜樹堿、9一氨基喜 樹堿、12 —硝基喜樹堿、12 —氨基喜樹堿、9一硝基一10—羥基喜樹堿、9-硝基-10-烯丙基 喜樹堿、9一硝基一10—炔丙基喜樹堿、9一烯丙基喜樹堿、9一炔丙基喜樹堿、9一烯丙基 一10—羥基喜樹堿、9一炔丙基一10—羥基喜樹堿、10_ (3—烯丙氧基)喜樹堿、IO— (3 一炔丙氧基)喜樹堿、20—乙酰氧基喜樹堿。
本純化方法能夠針對產(chǎn)品和雜質(zhì)的特性優(yōu)化色譜條件， 一次分離純度可達99%以上，即 能夠做到精密地分離主產(chǎn)物和雜質(zhì)。 一次收率可高達90%以上，交匯和雜質(zhì)部分均能夠分 段收集、循環(huán)純化，避免浪費。所用色譜柱能夠重復(fù)使用，洗脫劑低毒價廉，其中有機相 可以回收套用，經(jīng)濟環(huán)保。分離周期短，能夠快速穩(wěn)定進行規(guī)模化生產(chǎn)。


圖1:喜樹堿及其衍生物的純化的工藝流程圖
具體實施例方式
以下列舉具體實施例以進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解實施例并非用于限制本發(fā)明的保護范圍。
下述實施例的工藝流程圖均如圖1所示。
實施例1
洗脫液配制
將250克甲酸銨溶解于25L水，加入甲酸調(diào)節(jié)PH值至3，再加入2. 5克庚垸磺酸鈉， 溶解至澄清。取此緩沖液與甲醇按照體積比40/60混合得到30L洗脫液，超聲10分鐘待用。 色譜柱裝填
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1.5KG C18球形反相硅填料(10—20 um， 120A),加入4. 5L甲 醇，攪拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為10cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭， 以600ml/min流速，泵入洗脫液，30分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至53bar， 再以400ml/min流速活化1小時。 樣品分離
取7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜樹堿鹽酸鹽粗原料(含量89.9%) 20克，溶解 在300ml洗脫液中，過濾，以300ml/min流速泵入柱內(nèi)，以400ml/min流速等度洗脫，在 紫外檢測器下用350nm波長監(jiān)測，38min時，7-乙基-10-(4'-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜樹堿峰 出現(xiàn)并上升，收集組分I，直至48min時，主峰逐漸下降至峰高的1/3處。繼續(xù)收集組分 II，直至7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜樹堿成分完全流出。整個分離過程約60分 鐘。
后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收甲醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至6—7，以二氯 甲垸萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮至干， 得黃色固體。最后以正己垸100ml洗滌并過濾，得7-乙基-10- (4'-哌啶基哌啶-)羰酰氧基喜 樹堿精品16.4克，HPLC檢測，純度99.4%，最大單一雜質(zhì)0.08%，收率91.2%。洗脫液 II同法處理，蒸除二氯甲烷后得固體約1.42克，待分離15批后，合并所有組分II為新一 批粗品，進行再次純化。
收集所得產(chǎn)品均已轉(zhuǎn)化為游離堿形式。將10克該游離堿溶解于80ml乙醇，攪拌下通入 干燥的氯化氫氣體，漸漸析出黃色固體。4小時后，成鹽完畢，過濾，以30ml丙酮洗滌濾 餅。濾餅6(TC真空干燥4小時，即得到7-乙基-10- (4，-哌啶基哌啶-)羰酰氧基喜樹堿鹽酸鹽。
實施例2 洗脫液配制-
取無水醋酸鈉600克，加水9L溶解后，加入冰醋酸2. 1L，再加水稀釋至30L，溶液PH 值為3.7。再將此緩沖液與乙醇按照體積比50/50混合為30L洗脫液，超聲10分鐘待用。 色譜柱裝填
在10L的大燒杯內(nèi)，稱取已經(jīng)鹽酸、乙醇預(yù)處理的1.5KG弱極性大孔樹脂，加入6L乙 醇，攪拌均勻后裝填入直徑為10cra的中壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以 400ml/min流速，泵入洗脫液，30分鐘后，柱內(nèi)乙醇被替換完全。將柱壓調(diào)至30bar，再以 300ml/min流速活化1小時。 樣品分離-
取7—乙基一10—羥基喜樹堿粗原料20克(含量87.7%)，溶解在400ml洗脫液中，過 濾，以200ml/min流速泵入柱內(nèi)，以300ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用348nm 波長監(jiān)測，28min時，7—乙基一10—羥基喜樹堿峰出現(xiàn)并上升，收集為組分I，直至42min 時，主峰逐漸下降至峰高的1/2處。繼續(xù)收集，合并為組分II，直至7—乙基一10—羥基 喜樹堿成分完全流出。整個分離過程約50分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收大部分乙醇，再加入1L水稀釋，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié) 水相PH值至6—7。析出黃色固體。過濾，固體以甲醇30ml洗滌，干燥，得16.1克精品， HPLC檢測，純度99.2%,最大單一雜質(zhì)O. 10%，收率91.8%。洗脫液II同法處理，過濾 后得固體約1.2克，待分離17批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純化。
實施例3 洗脫液配制
取磷酸二氫鉀3kg，溶解于2.4L水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2. 5，以水稀釋至30L。再將 此緩沖液與甲醇按照體積比50/50混合為60L洗脫液，超聲10min待用。 色譜柱裝填-
在10L的大燒杯內(nèi)，稱取2.5KG酸性氧化鋁填料，加入6L甲醇，攪拌成勻漿，超聲后 裝填入直徑為12cm的中壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。配制蓋上法蘭，以200ml/min流速， 泵入洗脫液，30分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全，再以200ml/min流速沖洗30分鐘。
樣品分離
取IO—羥基喜樹堿粗原料40克(含量72.3%)，溶解在800ml洗脫液中，過濾，以 100ml/min流速泵入中壓制備柱內(nèi)，以100ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用267nm 波長監(jiān)測，95min時，IO —羥基喜樹堿逐漸出現(xiàn)并上升，收集組分I。至llOmin分鐘，開 始收集組分II。直至180min時，主峰逐漸下降至峰高的1/4處。繼續(xù)收集組分III，直至 10—羥基喜樹堿成分完全流出。整個分離過程約240分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液n蒸除并回收甲醇，再加入2L水稀釋，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相ra
值至6_7。析出黃色固體。過濾，固體以甲醇400ml洗滌，干燥，得23.4克精品，HPLC 檢測，純度99. 1%，最大單一雜質(zhì)O. 10%，收率80.9%。洗脫液I、 III同法處理，過濾 后得固體約4.2克，待分離10批后，合并所有組分I和組分III為新一批粗品，進行再次 純化。
實施例4
將200克三氟醋酸銨溶解于25L水，加入三氟醋酸酸調(diào)節(jié)PH值至3. 7，再加入2. 0克十 二烷磺酸鈉，溶解至澄清。取此緩沖液與異丙醇按照體積比40/60混合得到30L洗脫液， 超聲10分鐘待用。 色譜柱裝填-
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1KG C8球形反相硅填料(10—20um， 200A)，加入4. 5L異丙 醇，攪拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為8cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭， 以400ml/min流速，泵入洗脫液，15分鐘后，柱內(nèi)異丙醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至 55bar，再以300ml/min流速活化20分鐘。 樣品分離
取9-烯丙基-10-羥基喜樹堿粗原料(含量65. 0%) 20克，溶解在300ml洗脫液中，過濾， 以250ml/min流速泵入柱內(nèi)，以250ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用267nm波長 監(jiān)測，28min時，9-烯丙基-10-羥基喜樹堿出現(xiàn)并上升，收集組分I，直至48min時，主峰 逐漸下降至峰高的1/3處。繼續(xù)收集組分II，直至9-烯丙基-10-羥基喜樹堿成分完全流出。 整個分離過程約65分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收異丙醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至6—7，以三
氯甲垸萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮至 干，得黃色固體。最后以丙酮80ml洗滌并過濾，得9-烯丙基-10-羥基喜樹堿精品9.8克， HPLC檢測，純度99.2%，最大單一雜質(zhì)O. 15%，收率75.3%。洗脫液II同法處理，蒸除 三氯甲烷后得固體約2.6克，待分離8批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純 化。
實施例5
洗脫液配制
取磷酸二氫鈉3kg，溶解于2.4L水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5,以水稀釋至30L。再將 此緩沖液與甲醇按照體積比45/55混合為60L洗脫液，超聲10min待用。 色譜柱裝填
在10L的大燒杯內(nèi)，稱取1.5KG C18球形反相硅填料(20 — 50 um， 200A)，加入4. 5L 甲醇，攪拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為10cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法 蘭，以600ml/min流速，泵入洗脫液，20分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào) 至53bar，再以400ml/min流速活化30分鐘。 樣品分離
取喜樹堿粗原料30克(含量65. 5%)，溶解在1000ml洗脫液中，過濾，以400ml/min 流速泵入中壓制備柱內(nèi)，以300ml/niin流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254nm波長監(jiān)測， 35min時，喜樹堿逐漸出現(xiàn)并上升，收集組分I。至42min分鐘，開始收集組分II。直至 70min時，主峰逐漸下降至峰高的1/3處。繼續(xù)收集組分III，直至喜樹堿成分完全流出。 整個分離過程約90分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收大部分甲醇，再加入1L水稀釋，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié) 水相ra值至6。析出黃色固體。過濾，固體分別以甲醇30ni1,丙酮60ml洗滌，干燥，得 14.0克精品，HPLC檢測，純度99.2%，最大單一雜質(zhì)0.38%，收率71.2%。洗脫液I和 III同法處理，過濾后得固體約5.2克，待分離6批后，合并所有組分I和III為新一批粗 品，進行再次純化。
實施例6
洗脫液配制
取醋酸銨500克，加水9L溶解后，加入冰醋酸1.0L，再加水稀釋至30L，并以冰醋酸調(diào) 節(jié)溶液PH值為5. 0。再將此緩沖液與乙醇按照體積比40/60混合為60L洗脫液，超聲10分 鐘待用。 色譜柱裝填
在10L的大燒杯內(nèi)，稱取己經(jīng)鹽酸、乙醇預(yù)處理的1.5KG弱極性大孔樹脂，加入6L乙 醇，攪拌均勻后裝填入直徑為10cm的中壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以 400ml/min流速，泵入洗脫液，15分鐘后，柱內(nèi)乙醇被替換完全。將柱壓調(diào)至30bar，再以 300ml/min流速活化20分鐘。
取20—乙酰氧基喜樹堿粗原料20克(含量90.0%)，溶解在350ml洗脫液中，過濾， 以300ml/min流速泵入柱內(nèi)，以300ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254nm波長 監(jiān)測，25min時，20—乙酰氧基喜樹堿峰出現(xiàn)并上升，收集為組分I，直至40min時，主峰 逐漸下降至峰高的l/4處。繼續(xù)收集，合并為組分II，直至20—乙酰氧基喜樹堿成分完全 流出。整個分離過程約50分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收異丙醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至7，以三氯 甲烷萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮至干， 得黃色固體。過濾，固體分別以丙酮30ml，正己垸30ml洗滌，干燥，得16.2克精品，HPLC 檢測，純度99.7%，最大單一雜質(zhì)0.04%，收率90.0%。洗脫液II同法處理，過濾后得 固體約1.68克，待分離12批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純化。
實施例7 洗脫液配制
將200克三氟醋酸銨溶解于25L水，加入三氟醋酸酸調(diào)節(jié)PH值至2.3，溶解至澄清。取 此緩沖液與甲醇按照體積比30/70混合得到60L洗脫液，超聲IO分鐘待用。
在10L的大燒杯內(nèi)，稱取2.5KG酸性氧化鋁填料，加入6L甲醇，攪拌成勻漿，超聲后 裝填入直徑為12cm的中壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。配制蓋上法蘭，以200ml/min流速， 泵入洗脫液，30分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全，再以200ml/min流速沖洗30分鐘。 樣品分離-取IO—甲氧基喜樹堿粗原料30克(含量85. 3%)，溶解在800ml洗脫液中，過濾，以 100ml/min流速泵入中壓制備柱內(nèi)，以100ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254咖 波長監(jiān)測，75min時，IO—甲氧基喜樹堿逐漸出現(xiàn)并上升，收集組分I。直至120min時， 主峰逐漸下降至峰高的1/3處。繼續(xù)收集組分II，直至10—甲氧基喜樹堿成分完全流出。 整個分離過程約200分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收甲醇，再加入2L水稀釋，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH 值至6 — 7。析出黃色固體。過濾，固體以甲醇100ml洗滌，干燥，得22.0克精品，HPLC 檢測，純度99.3%，最大單一雜質(zhì)0.10%，收率86.0%。洗脫液II同法處理，過濾后得 固體約2.4克，待分離12批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純化。
實施例8 洗脫液配制-
取醋酸銨500克，加水9L溶解后，加入冰醋酸1.0L，再加水稀釋至30L，并以冰醋酸調(diào) 節(jié)溶液PH值為5.0。再將此緩沖液與甲醇按照體積比50/50混合為50L洗脫液，超聲10分 鐘待用。 色譜柱裝填
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1.2KGC18球形反相硅填料(10—20um， 120A)，加入6L甲醇， 攪拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為8cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以 400ml/min流速，泵入洗脫液，20分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至50bar， 再以300ml/min流速活化30分鐘。 樣品分離
取9-氨基喜樹堿粗原料(含量72.0% )30克，溶解在500ml洗脫液中，過濾，以300ml/min 流速泵入柱內(nèi)，以300ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254nm波長監(jiān)測，23min時， 9-氨基喜樹堿出現(xiàn)并上升，收集組分I，直至48min時，主峰逐漸下降至峰高的1/3處。繼 續(xù)收集組分II，直至9一氨基喜樹堿成分完全流出。整個分離過程約60分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收甲醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至7，以三氯甲垸 萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮至干，得
黃色固體。最后以丙酮80ml洗滌并過濾，得9-氨基喜樹堿精品19.8克，HPLC檢測，純度 99.5%,最大單一雜質(zhì)O. 13%，收率91.67%。洗脫液II同法處理，蒸除三氯甲烷后得固 體約1.6克，待分離19批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純化。
實施例9 洗脫液配制
.取磷酸二氫鈉3kg，溶解于2.4L水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5,以水稀釋至60L。再將 此緩沖液與甲醇按照體積比30/70混合為60L洗脫液，超聲lOmin待用。 色譜柱裝填
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1.5KG C8無定形反相硅填料(10—20um)，加入6L甲醇，攪 拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為8cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以 400ml/min流速，泵入洗脫液，20分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至50bar， 再以300ml/min流速活化30分鐘。 樣品分離
取12-硝基喜樹堿粗原料(含量82. 7% )40克，溶解在900ml洗脫液中，過濾，以300ml/min 流速泵入柱內(nèi)，以300ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254nm波長監(jiān)測，20min時， 12—硝基喜樹堿出現(xiàn)并上升，收集組分I，直至40min時，主峰逐漸下降至峰高的1/4處。 繼續(xù)收集組分II，直至12—硝基喜樹堿成分完全流出。整個分離過程約60分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收甲醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至6，析出棕黃色 固體。過濾，固體以甲醇100ml洗滌，干燥，得26. 5克精品，HPLC檢測，純度99. 3%， 最大單一雜質(zhì)0.20%，收率80.0%。洗脫液II同法處理，過濾后得固體約4.9克，待分 離10批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純化。
實施例10
將200克三氟醋酸銨溶解于25L水，加入三氟醋酸酸調(diào)節(jié)PH值至3.4，再加入1.5克十二 烷磺酸鈉，溶解至澄清。取此緩沖液與異丙醇按照體積比50/50混合得到40L洗脫液，超
聲io分鐘待用。
色譜柱裝填
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1KG氰基無定形反相硅填料(20—50ixm)，加入5L異丙醇，攪 拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為8cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以 400ml/min流速，泵入洗脫液，15分鐘后，柱內(nèi)異丙醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至55bar， 再以300ml/min流速活化20分鐘。 樣品分離
取5_羥基一9_溴_10—甲氧基喜樹堿粗原料(含量95.0%) 10克，溶解在200ml洗 脫液中，過濾，以250ml/min流速泵入柱內(nèi)，以250ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器 下用267nm波長監(jiān)測，28rnin時，5—羥基一9一溴一10—甲氧基喜樹堿出現(xiàn)并上升，收集組 分I，直至50min時，主峰逐漸下降至峰高的1/4處。繼續(xù)收集組分II,直至5—羥基一9 一溴一10—甲氧基喜樹堿成分完全流出。整個分離過程約65分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收異丙醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至6—7，以l， 2 — 二氯乙垸萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃 縮至干，得黃色固體。最后以丙酮30ml洗滌并過濾，得5 —羥基一9一溴一IO—甲氧基喜樹 堿精品9.2克，HPLC檢測，純度99.5%，最大單一雜質(zhì)O. 15%，收率96.8%。洗脫液II 同法處理，蒸除二氯甲烷后得固體約0.22克，待分離50批后，合并所有組分II為新一批 粗品，進行再次純化。
實施例11 洗脫液配制
取醋酸銨500克，加水9L溶解后，加入冰醋酸1.0L，再加水稀釋至30L，并以冰醋酸調(diào) 節(jié)溶液PH值為5.0。再將此緩沖液與甲醇按照體積比50/50混合為50L洗脫液，超聲10分 鐘待用。 色譜柱裝填
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1.2KG苯基球形反相硅填料(10 — 20^m， 200A)，加入6L甲醇， 攪拌成勻漿，超聲后裝填入直徑為8cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以 300ml/min流速，泵入洗脫液，20分鐘后，柱內(nèi)甲醇被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至60bar， 再以200ml/min流速活化30分鐘。 樣品分離
取10— (3—炔丙氧基)喜樹堿(粗原料(含量92. 0%) 20克，溶解在350ral洗脫液中，
過濾，以200ml/min流速泵入柱內(nèi)，以200ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254nm 波長監(jiān)測，16min時，IO— (3—炔丙氧基)喜樹堿出現(xiàn)并上升，收集組分I，直至28min 時，主峰逐漸下降至峰高的1/3處。繼續(xù)收集組分II，直至10— (3—炔丙氧基)喜樹堿 成分完全流出。整個分離過程約45分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收甲醇，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至6.5，以二氯甲 烷萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮至干， 得黃色固體。最后以丙酮30ml洗滌并過濾，得10— (3—炔丙氧基)喜樹堿精品16.4克， HPLC檢測，純度99.5%，最大單一雜質(zhì)O. 12%，收率89. 1%。洗脫液II同法處理，蒸除 三氯甲烷后得固體約1.6克，待分離12批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次 純化。
實施例12
將100克鄰苯二甲酸二鈉溶解于25L水，加入鄰苯二甲酸調(diào)節(jié)PH值至5，再加入1.0克己 垸磺酸鈉，溶解至澄清。取此緩沖液與乙腈按照體積比35/65混合得到40L洗脫液，超聲 IO分鐘待用。 色譜柱裝填
在5L的大燒杯內(nèi)，稱取1KG C18無定形反相硅填料(10—20!im)，加入5L乙腈，攪拌 成勻漿，超聲后裝填入直徑為8cm的高壓不銹鋼色譜柱內(nèi)，抽取液體。蓋上法蘭，以400ml/min 流速，泵入洗脫液，15分鐘后，柱內(nèi)乙腈被替換完全并活化。將柱壓調(diào)至60bar，再以 300ml/min流速活化20分鐘。 樣品分離
取20—乙酰氧基喜樹堿粗原料(含量93.0%) 15克，溶解在200ral洗脫液中，過濾， 以250ml/min流速泵入柱內(nèi)，以250ml/min流速等度洗脫，在紫外檢測器下用254nm波長 監(jiān)測，28min時，20—乙酰氧基喜樹堿出現(xiàn)并上升，收集組分I，直至45min時，主峰逐漸 下降至峰高的l/3處。繼續(xù)收集組分II，直至20—乙酰氧基喜樹堿成分完全流出。整個分 離過程約65分鐘。 后處理
減壓濃縮洗脫液I蒸除并回收乙腈，以飽和小蘇打溶液調(diào)節(jié)水相PH值至7，以三氯甲烷 萃取3次，合并有機相，水洗1次，無水硫酸鈉干燥4小時。濾除干燥劑，濃縮至干，得
黃色固體。最后以正己烷30ml洗滌并過濾，得20—乙酰氧基喜樹堿精品12.3克，HPLC檢 測，純度99.5%，最大單一雜質(zhì)0.13%，收率88. 1%。洗脫液II同法處理，蒸除三氯甲 烷后得固體約0.58克，待分離25批后，合并所有組分II為新一批粗品，進行再次純化。
權(quán)利要求
1. 一種喜樹堿及其衍生物的純化方法，為利用制備色譜柱進行分離純化，包括樣品溶解、上柱、洗脫及組分收集，其特征在于，色譜柱洗脫采用的洗脫液為醇/水體系或乙腈/水體系，水相pH為2-5，在醇/水體系中，醇選自C5以下的醇。
2. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述醇/水體系中的醇 選自甲醇、乙醇、異丙醇、乙二醇或丁醇。
3. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述制備色譜柱為常壓、 中壓或高壓制備色譜柱。
4. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述制備色譜柱的固定 相填料選自大孔樹脂、反相硅填料或酸性氧化鋁。
5. 如權(quán)利要求4所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述反相硅填料選自C18 填料、C8填料、苯基填料或氰基填料。
6. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述醇/水或乙腈/水體 系中，水相為酸性緩沖溶液，其中，配制緩沖溶液的酸選自鹽酸、磷酸、硼酸、甲酸、 醋酸、三氟醋酸、鄰苯二甲酸或酒石酸中的一種或多種；配制緩沖溶液的鹽選自磷酸氫 二鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硼砂、碳酸氫鈉、碳酸鈉、甲酸鈉、甲 酸銨、醋酸鈉、醋酸銨、三氟醋酸鈉、三氟醋酸銨、鄰苯二甲酸氫鈉、鄰苯二甲酸二鈉、 鄰苯二甲酸氫鉀、鄰苯二甲酸二鉀、酒石酸氫鉀、酒石酸氫鈉、酒石酸氫鉀、酒石酸二 鈉或酒石酸二鉀中的一種或多種。
7. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述洗脫液中含有C4-C20 的烷基磺酸鈉。
8. 如權(quán)利要求7所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述C4-C20的烷基磺 酸鈉在洗脫液中的重量百分含量為萬分之零點二 萬分之二十。
9. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述醇/水或乙腈/水體 系中，有機相與水相的體積比在9: 1 1: 9之間，有機相即為醇或乙腈。
10. 如權(quán)利要求I所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述組分收集為分段收 集洗脫液。
11. 如權(quán)利要求l所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，組分收集后還包括將收 集的中段洗脫液濃縮蒸除大部分醇或乙腈，并加水稀釋，水相調(diào)節(jié)pH至中性后，直接 析出產(chǎn)品晶體。
12. 如權(quán)利要求1所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，組分收集后還包括將收 集的中段洗脫液以二鹵代烴或三鹵代烴萃取，濃縮后得到產(chǎn)品晶體。 13.如權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述喜樹堿及其衍生物具有下面的五環(huán)母體結(jié)構(gòu)其中，Rl選自H, C1-C20的烷基，C1-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛 基，酮基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子或雜環(huán)取代基， R2選自H， C1-C20的垸基，CI-C20的取代垸基，垸氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，鹵素原子或雜環(huán)取代基， R3選自H， C1-C20的烷基，CI-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子，哌啶基哌啶，或其 它雜環(huán)取代基，R4選自H, CI-C20的垸基，CI-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子或雜環(huán)取代基， R5選自H， C1-C20的垸基，CI-C20的取代烷基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子或雜環(huán)取代基， R6選自H， Cl-C20的烷基，C1-C20的取代烷基，酰基，R7選自H, C卜C20的垸基，CI-C20的取代垸基，烷氧基，烯丙基，炔丙基，醛基，酮 基，羧基，酯基，羥基，芐基或取代芐基，氰基，硝基，鹵素原子，或雜環(huán)取代基， 以及上述物質(zhì)可能的鹽形式。 14.如權(quán)利要求13所述喜樹堿及其衍生物的純化方法，其特征在于，所述喜樹堿及其衍生 物選自喜樹堿、7—乙基喜樹堿、5—羥基喜樹堿、5—羥基一9一溴一10—甲氧基喜樹堿、 IO—羥基喜樹堿、IO—甲氧基喜樹堿、5， IO—二羥基喜樹堿、7—乙基一10—羥基喜樹 堿、7-乙基-10-(4，-哌啶基哌啶)羰酰氧基喜樹堿、9一氨基喜樹堿、12 —硝基喜樹堿、12 一氨基喜樹堿、9一硝基—IO—羥基喜樹堿、9-硝基-10-烯丙基喜樹堿、9一硝基一10 — 炔丙基喜樹堿、9一烯丙基喜樹堿、9一炔丙基喜樹堿、9一烯丙基一10—羥基喜樹堿、9 一炔丙基一10—羥基喜樹堿、10— G—烯丙氧基)喜樹堿、10— (3—炔丙氧基)喜樹 堿、20—乙酰氧基喜樹堿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種喜樹堿及其衍生物的純化方法，為利用制備色譜柱進行分離純化，包括樣品溶解、上柱、洗脫及組分收集，其中，色譜柱洗脫采用的洗脫液為醇/水體系或乙腈/水體系，水相pH為2-5，在醇/水體系中，醇選自C5以下的醇。本發(fā)明的方法能夠針對產(chǎn)品和雜質(zhì)的特性優(yōu)化色譜條件，一次分離純度可達99％以上，且經(jīng)濟環(huán)保，分離周期短，能夠快速穩(wěn)定進行規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號C07D491/22GK101376659SQ200810200658
公開日2009年3月4日 申請日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者婧 孫, 康立濤, 平 張, 張五軍, 倩 李 申請人:上海北卡醫(yī)藥技術(shù)有限公司