一種雨生紅球藻的破壁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雨生紅球藻的破壁方法，屬于生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 雨生紅球藻是一種生活在淡水中的單細胞綠藻，在特定條件下能積累大量的類胡 蘿卜素（可達干重的2% -5%)，其中80%以上為蝦青素及其酯類D。雨生紅球藻的生活 周期主要分為營養(yǎng)細胞和厚壁孢子，一般認為環(huán)境有利時，形成營養(yǎng)孢子；環(huán)境不利時，形 成厚壁孢子并大量累積蝦青素。蝦青素（Astaxanthin)可作為脂溶性的色素，具有艷麗的 紅色和強的抗氧化性能；在食品工業(yè)中，不僅能有效起到保鮮、保色、保味、保質(zhì)等作用，而 且能為多類食品著色，增加食品的色澤美感；另外動物實驗表明蝦青素有抑制腫瘤發(fā)生、增 強免疫功能等多方面的生理作用，因此蝦青素在功能食品和醫(yī)藥等方面應(yīng)用廣泛。利用有 機溶劑可以直接從雨生紅球藻細胞中提取蝦青素，但是由于雨生紅球藻的厚壁孢子具有堅 韌的細胞壁，若直接利用將導(dǎo)致其生物有效利用率降低，而厚壁孢子結(jié)構(gòu)又阻礙了有機溶 劑進入細胞內(nèi)提取蝦青素，因而蝦青素提取率較低。故在蝦青素提取前必須先進行孢子態(tài) 細胞的破壁處理，以破壞雨生紅球藻的細胞結(jié)構(gòu)，特別是其細胞壁的結(jié)構(gòu)，而雨生紅球藻的 破壁方法對于蝦青素的提取率和質(zhì)量至關(guān)重要。
[0003] 目前，雨生紅球藻的破壁方法主要有物理機械破壁方法、酶解法和化學法：酶解方 法對于蝦青素的破壞最小，但是破壁率較低并且增加了后續(xù)分離的難度，不適合大規(guī)模的 工業(yè)化生產(chǎn)；化學方法比較系統(tǒng)，但是在其過程中使用了有機溶劑，不但成本較高并且不環(huán) 保，不能達到食品生產(chǎn)的綠色標準；物理機械破壁方法綠色環(huán)保，分離簡單，適合大規(guī)模的 工業(yè)化生產(chǎn)，但是目前，細胞的破壁率較低，通常為70%，而達到90%的破壁方法耗能嚴重、 成本昂貴。
[0004] 雨生紅球藻的物理機械破壁方法主要包括高壓勻質(zhì)方法、超聲波法、研磨法、勻 漿法、凍融解凍法和微波破解法，歐陽琴(福州大學學報，2005, 33 (I) :111-115)等研究 后發(fā)現(xiàn)，高壓勻質(zhì)方法最適合雨生紅球藻的破壁，可以達到92. 9%的破壁率，但是蝦青素 的提取率并不理想僅為28. OPg/mg (細胞干重）；而周湘池(海洋與湖沼，2006, 37 (5): 424-428)等研究表明，勻漿法和超聲波法對于后續(xù)蝦青素提取和分離有影響，而直接研磨 在破壁過程中降低了蝦青素的活性，加液氮低溫研磨法無污染并且最大限度的保留了蝦青 素的生理活性，但是液氮低溫研磨法只適用于研究室而不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。專利 CN101691348A采用超臨界C02萃取直接提取雨生紅球藻干粉，該工藝綠色環(huán)保并且對蝦青 素的生理活性影響較小，但是該方法所用設(shè)備昂貴，成本很高，物特殊的破壁工藝且蝦青素 的提取率低。
[0005] 目前，急需要一種綠色環(huán)保、成本低廉、對蝦青素生理活性無影響且蝦青素提取率 低的雨生紅球藻破壁方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種破壁率高、綠色環(huán)保無公害、成本低、適用 于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)的雨生紅球藻的機械破壁方法，通過該方法對雨生紅球藻進行破壁， 對蝦青素的生理活性影響最低，蝦青素的提取率高并且符合食品生產(chǎn)的綠色標準。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案： 一種雨生紅球藻的破壁方法，包括以下步驟： (1) 、藻種培養(yǎng)：培養(yǎng)池自然培養(yǎng)6?8天增殖后，向池水中加入磷酸二氫鉀和硝酸鈉， 并在池上覆蓋紅色薄膜，在波長為630nm?760nm光照射下將雨聲紅球藻培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化態(tài)； 然后向池水中繼續(xù)添加磷酸二氫鉀，并在池上覆蓋藍色薄膜，在波長為430nm?490nm光波 照射下，讓雨生紅球藻細胞養(yǎng)至成熟態(tài)； (2) 藻種預(yù)處理：收集步驟1中成熟的雨生紅球藻，在300-500r/min下離心l〇-15min 后棄去上清液制備藻液；收集藻液，繼續(xù)在3000-3500r/min下離心10-15min,之后去除上 清液收集沉淀形成濃縮藻液； (3) 去除葉綠素：向濃縮藻液中加入20%甲醇和5%氫氧化鉀的混合液，在60-65°C下攪 拌處理10-20min從而去除葉綠素，最后在300-500r/min條件下離心5-10min，棄上清液得 孢子態(tài)藻細胞懸浮液； (4) 細胞破壁：將步驟3中所得的孢子態(tài)藻細胞懸浮液與冰醋酸混合均勻，在-4-0°C下 冰浴10-20min，然后向上述混合液中加入去離子水并且置于勻漿機中勻漿5-10min得藻漿 液，向藻漿液中加入液氮混勻后靜置5-10min后得破壁海藻液。
[0008] 優(yōu)選的，步驟1中，向池水中加入磷酸二氫鉀和硝酸鈉，使磷酸二氫鉀在池水中的 密度為〇. 005?0. 01克/升、硝酸鈉在池水中的密度為0. 005-0. 008克/升；所述的向池 水中繼續(xù)添加磷酸二氫鉀，使磷酸二氫鉀在池水中的密度為0. 01?0. 015克/升。
[0009] 優(yōu)選的，步驟4中，所述的孢子態(tài)藻細胞懸浮液與冰醋酸、去離子水的體積比為 1:2-5:1-3。
[0010] 優(yōu)選的，步驟4中，所述的冰醋酸的濃度為0. 3%-1%。
[0011] 優(yōu)選的，步驟4中，所述的液氮的加入體積為：100mL藻漿液中加入2-5mL液氮。
[0012] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果： 冰浴條件下，冰醋酸可以更快的滲透到雨生紅球藻細胞的表層；在勻漿過程中，利用螺 旋槳施加的攪拌離心力、擠壓力、剪切力對海藻細胞進行破碎,并且物料之間的摩擦力加速 細胞表面的冰醋酸對細胞壁結(jié)構(gòu)中糖蛋白的破壞；同時，由于冰浴的醋酸的介入避免了勻 漿過程中溫度的升高，最大程度的保護了蝦青素的理化活性，所得的蝦青素提取物為暗紅 色粘稠物質(zhì)。本發(fā)明所述的破壁方法，細胞的破壁率高達97. 7%。
【具體實施方式】
[0013] 以下通過實施例進一步闡述本發(fā)明的有益效果： 實施例1 : 一種雨生紅球藻的破壁方法，包括以下步驟： (1)、藻種培養(yǎng)：培養(yǎng)池自然培養(yǎng)6?8天增殖后，向池水中加入磷酸二氫鉀和硝酸 鈉(使磷酸二氫鉀在池水中的密度為〇. 005?0. 01克/升、硝酸鈉在池水中的密度為 0. 005-0. 008克/升)，并在池上覆蓋紅色薄膜，在波長為630nm?760nm光照射下將雨聲 紅球藻培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化態(tài)；然后向池水中繼續(xù)添加磷酸二氫鉀(使磷酸二氫鉀在池水中的密度 為0· Ol?0· 015克/升)，并在池上覆蓋藍色薄膜，在波長為430nm?490nm光波照射下， 讓雨生紅球藻細胞養(yǎng)至成熟態(tài)； (2) 藻種預(yù)處理：收集步驟1中成熟的雨生紅球藻，在400r/min下離心15min后棄去 上清液制備藻液；收集藻液，繼續(xù)在3000r/min下離心lO