一種高嶺土固定化gy2b菌的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物化固定技術領域，具體涉及一種高嶺土固定化GY2B菌的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]苯酚是一種重要的具有特殊氣味兼腐蝕性的有機原料，在醫(yī)藥、樹脂、滅菌劑等多方面被廣泛應用。苯酚對人體、環(huán)境中的大氣和水體都會產(chǎn)生極大威脅。與人體直接接觸輕則會導致體內(nèi)、體外的粘膜、皮膚腐蝕，重則導致中樞神經(jīng)處于抑制狀態(tài)、對外界刺激反應慢以及肝、腎功能損害，急性中毒甚至致命。不僅會污染河流湖泊，破壞生態(tài)景觀，抑制水生動植物生長，甚至導致死亡，更能夠隨食物鏈迀移而危害人體健康，不僅有使蛋白質(zhì)變性、長期飲用導致苯酚積累而引發(fā)慢性中毒的低濃度苯酚污染影響人們正常生命活動，更有使蛋白質(zhì)凝固、引起肌體組織損傷壞死、導致急性中毒的高濃度苯酚污染威脅生命安全。加之極高的常見性和極強的流動性，苯酚被列入129種有毒污染物和有限污染物，其處理受到重大關注。
[0003]含苯環(huán)有機物的如PAHs，苯酚等的微生物降解已成為國內(nèi)外污染環(huán)境修復的重要手段甚至首選的方法，生物處理法具有成本低廉、對環(huán)境干擾輕微、處理形式多樣、處理徹底等優(yōu)點。GY2B高效降解菌屬鞘氨醇單胞菌，被篩選并證實對包括菲等多種多環(huán)芳烴具有較高或一定的降解能力。降解通過細菌的攝入轉化，能有效開環(huán)降解，使多種帶苯環(huán)的有機污染物轉化成簡單無害或易處理的物質(zhì)。除菲等芳烴化合物外，GY2B菌對苯酚也可觀的降解能力。現(xiàn)階段，對有機污染物的降解多停留在單菌的投加和條件的維穩(wěn)，菌種降解效率的保證和提高也多涉及在生物增強劑、體系適宜條件、菌屬濃度、和部分協(xié)同作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術中游離GY2B菌降解過程中適應期較長以及對復雜惡劣環(huán)境下調(diào)節(jié)能力差等缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種制備高嶺土固定化GY2B菌的方法，該方法能顯著提升GY2B菌屬降解效率和速率，并在一定惡劣環(huán)境下維持降解能力。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法獲得的高嶺土固定化GY2B菌。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供上述高嶺土固定化GY2B菌的應用。
[0007]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0008]—種高嶺土固定化GY2B菌的制備方法，包括以下步驟:
[0009](I)將GY2B菌活化培養(yǎng)形成菌體，將菌體在含苯酚的富集培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)得到濃菌液，再用無菌生理鹽水離心洗滌濃菌液得到菌體，之后將洗得的菌體懸于無菌生理鹽水中得到菌懸液；
[0010](2)將滅菌處理后的高嶺土溶解于無菌MSM培養(yǎng)液中形成懸濁液，然后按接種量2?8%加入步驟(I)得到的菌懸液，吸附固定I?4小時，制得所述高嶺土固定化GY2B菌。
[0011]優(yōu)選的，步驟(I)所述GY2B菌活化培養(yǎng)的具體操作為:將平板儲存的GY2B菌落挑I?2環(huán)至含苯酚濃度50?200mg/L的無菌MSM培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)，搖床條件為避光25?350C UOO?200r/min ；8?16小時后取I?2mL菌液至新的含苯酚濃度50?200mg/L的無菌MSM培養(yǎng)液中接代培養(yǎng)，待8?16小時生長良好時再取I?2ml菌液至新的含苯酚濃度50?200mg/L的無菌MSM培養(yǎng)液中再次接代培養(yǎng)，按此重復接代培養(yǎng)2?5次(即把接待培養(yǎng)的步驟按相同條件重復進行2?5次)即得到具有穩(wěn)定降解苯酚能力的GY2B菌體，涂平板保存。
[0012]優(yōu)選的，步驟(I)中將菌體在含苯酚濃度50?200mg/L的富集培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)8?16h得到所述濃菌液。
[0013]步驟(I)中將菌體在含苯酚的富集培養(yǎng)液中擴大培養(yǎng)，是為了解決在無機鹽培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到菌體較少的缺陷，并且在制成濃菌液的同時保持其降解性能。
[0014]優(yōu)選的，步驟(I)中得到的菌懸液，于紫外分光光度計600nm處調(diào)節(jié)濃度，使其吸光度值為A = 0.8?1.5。所得的菌懸液保存在2?10°C冰箱備用。
[0015]優(yōu)選的，步驟(I)所述離心洗滌具體條件為:離心溫度為2?10°C，離心轉速為6000?12000r/min，離心時間為10?20分鐘，離心洗滌次數(shù)為2?5次。
[0016]優(yōu)選的，步驟(2)所述高嶺土的滅菌處理具體操作為:將高嶺土于100?150°C下蒸汽滅菌15?60min，然后于80?150°C烘干分散10?30min。滅菌后的高嶺土放于紫外光照射下冷卻備用。
[0017]優(yōu)選的，步驟⑵所述高嶺土目數(shù)為100?300目。
[0018]優(yōu)選的，步驟(2)所述吸附固定具體條件為:在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中進行，儀器參數(shù)為100?200r/min、25?35°C以及避光。
[0019]上述方法獲得的高嶺土固定化GY2B菌。
[0020]上述方法獲得的高嶺土固定化GY2B菌在處理含苯酚廢水中的應用。
[0021]優(yōu)選的，所述高嶺土固定化GY2B菌在處理含苯酚廢水時，高嶺土在體系中的濃度為15?30g/L ;所述體系的pH值為7?12，體系中苯酚濃度為O?300mg/L。所述體系包含用于溶解高嶺土的無菌MSM培養(yǎng)液、GY2B菌懸液和含苯酚廢水。
[0022]與GY2B菌單獨降解和其他對苯酚的降解方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果:
[0023](I)本發(fā)明方法中吸附固定過程簡單易行，操作精度不高，且所用原料取材簡易，價格低廉，成本底而降解條件平滑，在實際應用領域有較大優(yōu)勢。
[0024](2)本發(fā)明方法相比游離菌降解，能顯著提升降解效率并大大加快降解速率，固定后能將降解效率提升6?20%左右，降解時間可從10?18小時縮短至5?10小時左右。并因其微生物降解的特性，二次產(chǎn)物對環(huán)境影響微小。
[0025](3)本發(fā)明方法固定GY2B降解菌，除能在降解效率上提供促進外，還能在某些較惡劣環(huán)境條件如高濃度苯酚，堿性環(huán)境下保證菌體的降解性能，例如，在體系pH = 9?12、苯酚濃度為200?300mg/L時，也能保持其促進降解的作用，能將降解效率提升15?20%，且降解時間大大縮短，對實際應用有很大優(yōu)勢。
[0026](4)本發(fā)明方法中所用的高嶺土土樣經(jīng)回收處理可循環(huán)利用。
【附圖說明】
[0027]圖1為實施例2中不同高嶺土加入量對GY2B菌降解效率和速率的影響。
[0028]圖2為實施例2中不同濃度高嶺土對苯酚的吸附作用。
[0029]圖3為實施例3中游離GY2B菌對較高濃度苯酚體系的降解作用。
[0030]圖4為實施例3中高嶺土/GY2B復合體對較高濃度苯酚體系的降解作用。
[0031]圖5為實施例4中游離GY2B菌對不同pH下苯酚的降解作用。
[0032]圖6為實施例4中高嶺土 /GY2B復合體對不同pH下苯酚的降解作用。
[0033]圖7為實施例5中高嶺土循環(huán)利用次數(shù)與降解率的關系。
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0035]本發(fā)明實施例中所述MSM培養(yǎng)液包含以下濃度的成分:5.0mL/L磷酸鹽緩沖液(8.5g/L KH2PO4, 21.75g/L K2HPO4.H2O, 33.4g/L Na2HPO4.12H20，5.0g/LNH4Cl)，3.0ml/L MgSO4水溶液(22.5g/L)，1.0ml/L CaCl 2水溶液(36.4g/L)，1.0ml/L FeCl 3水溶液(0.25g/L)，1.0ml/L 微量元素溶液(39.9mg/L MnSO4.H20,42.8mg/L ZnSO4.H2O, 34.7mg/L (NH4) 6Μο7024.4Η20)，pH調(diào)為7.2 ;上述MSM培養(yǎng)液通過高溫蒸汽滅菌后得到試驗所需的無菌MSM培養(yǎng)液。其中是ml/L是指已配好的組分液在最終混合液體積為IL時的投加量，例如5.0ml/L磷酸鹽緩沖液是指最終混合液體積為IL時，緩沖液投加量為5mL。
[0036]本發(fā)明實施例中所述含100mg/L苯酚的無菌MSM培養(yǎng)液通過如下步驟制得:稱取一定量苯酚于燒杯中，以上述MSM培養(yǎng)液溶解，并轉移至容量瓶中，以上述MSM培養(yǎng)液定容使苯酚濃度為lg/L ;吸取1mL此定容后的溶液經(jīng)過濾滅菌后加入高溫蒸汽滅菌后的MSM培養(yǎng)液中，使苯酚終濃度為100mg/L，即可得到所述含100mg/L苯酚的無菌MSM培養(yǎng)液。
[0037]本發(fā)明實施例中所述富集培養(yǎng)液包含以下組分:1g蛋白胨，5g牛肉膏，5gNaCl，IL蒸餾水，調(diào)pH為7.0 ;上述富集培養(yǎng)液滅菌之后，加入過濾滅菌后的苯酚溶液，使終濃度為100mg/L，即得試驗所需的含苯酚濃度100mg/L的富集培養(yǎng)液。
[0038]本發(fā)明中所述的GY2B菌是鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)的菌株GY2B，于2006年在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC M 206019，已在申請?zhí)枮椤?00610034169.4”、名稱為“一株多環(huán)芳烴降解菌及其應用”的中國專利申請中公開。
[0039]實施例1
[0040]一種高嶺土固定GY2B菌的方法，包括以下步驟:
[0041](1)GY2B菌的活化培養(yǎng):將平板儲存的GY2B菌落挑一至兩環(huán)至含苯酚濃