一種用于鑒定西洋參的引物對及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒定西洋參的引物對及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參屬植物藥材的鑒定方法主要有形態(tài)鑒定、理化鑒定、細(xì)胞鑒定等，這些傳統(tǒng)的 鑒定手段由于易受環(huán)境條件的影響或植物本身的限制，人為干擾因素較多，無法直接體現(xiàn) 種質(zhì)的遺傳特征，有時難以得到準(zhǔn)確的結(jié)果（周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng) 用.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.)。
[0003]DNA分子標(biāo)記技術(shù)是近二十年來興起并不斷發(fā)展和完善的新檢測技術(shù)。近年來， DNA分子標(biāo)記技術(shù)在人參屬植物的許多研究中均有應(yīng)用，如中藥鑒定、遺傳多樣性與種質(zhì) 資源、物種進(jìn)化與親緣關(guān)系、野生類型與栽培品種的鑒別、道地性等。而就DNA分子標(biāo)記 技術(shù)在人參屬植物鑒定中的應(yīng)用而言，DNA分子標(biāo)記則是從分子水平上客觀地反映待測 材料基因片段之間的差異，鑒別結(jié)果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料來源的影響，一般通 過雜交或電泳等方式就能直觀地體現(xiàn)出來，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。因此，中藥鑒定也就成 為DNA分子標(biāo)記在人參屬植物中應(yīng)用最早且最多的領(lǐng)域。在DNA分子標(biāo)記技術(shù)中應(yīng)用最 多的是隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD)技術(shù)。Shaw和But于1995年首先采用RAPD方法明顯地 區(qū)分開人參屬的3種藥材人參、西洋參、三七和桔梗、紫茉莉、護(hù)蘭Talinumpaniculatum 及商陸PhytolaccaAcinosa4 種偽品（ShawPC,ButPP.AuthenticationofPanax speciesandtheiradulterantsbyrandom-primedpolymerasechainreaction.Planta Med，1995, 61 (5) :466.)。Kim等的研究表明RAH)標(biāo)記可以方便有效地將韓國人參和其他人 參屬植物鑒別開（KimHJ，LimCJ，ChoJH，etal.Moleculardifferentiationofpanax speciesbyRAPDanalysis.ArchPharmRes，2003,26(8):601.)。除RAPD技術(shù)外，隨機(jī) 引物PCR(AP-PCR)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)直接測序、rRNA和特征性片斷擴(kuò)增區(qū)域（SCAR) 等技術(shù)也被應(yīng)用在人參屬植物藥材的鑒定中。1994年，Cheung等首次將AP-PCR技術(shù)應(yīng)用 在人參與西洋參的藥材鑒別中（CheungKS，KwanHS，ButPP，elal.Pharmacognostical identificationofAmericanandOrientalginsengrootsbygenomicfingerprinting usingarbitrarilyprimedpolymerasechainreaction(AP-PCR).JournalofEthnop harmacology, 1994, 42 (1) : 67.)。崔光紅等利用多重等位基因特異PCR鑒別人參與西洋參 (崔光紅，唐曉晶，黃璐琦.利用多重等位基因特異PCR鑒別人參、西洋參，中國中藥雜志， 2006, 31 (23) : 1940)。詹鑫婕等依據(jù)人參和西洋參ITS2條形碼的專屬性鑒別位點，建立利 用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（PCR-SSCP)鑒別人參和西洋參的方法（詹鑫婕，田 程，張媛，等.基于ITS2條形碼SNPs的人參和西洋參PCR-SSCP分子鑒別研究，中國中藥雜 志，2012, 37(24) : 3748)。
[0004] 綜上所述，不同研究學(xué)者分別采用RAro法、AP-PCR法、PCR-SSCP法、多重PCR法等 DNA分子標(biāo)記技術(shù)對人參與人參屬中其它藥材進(jìn)行鑒定研究，但這些方法測試時間較長，且 均需要電泳檢測才可完成，因此相比較熒光染色方法繁瑣，不利于現(xiàn)場快速鑒別的應(yīng)用與 推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定西洋參的引物對。
[0006] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定西洋參的引物對，具體為由序列表中序列1 和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
[0007] 所述引物對中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨包裝，也可以按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定西洋參的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定西洋參的試劑盒，具體可含有所述引物對、 dNTP和DNA聚合酶。
[0010] 根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有熒光染料SYBRGreenI。
[0011] 制備所述引物對的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 制備所述引物對的方法，具體可包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別 單獨包裝的步驟。
[0013] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0015] A)將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的 dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個試劑盒內(nèi)：
[0016]B)將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨包裝后，與分別單獨包裝的dNTP、DNA聚合酶和SYBRGreenI包裝于同一個試劑盒內(nèi)。
[0017] 所述引物對，或所述試劑盒，在鑒定或輔助鑒定西洋參中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0018] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種利用所述引物對或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測樣品中是否含有西洋參的方法。
[0019] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測樣品中是否 含有西洋參的方法，具體可包括如下步驟：
[0020] (a)從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0021] (b)為如下（bl)或（b2):
[0022] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測樣品中是否含有 西洋參：若PCR產(chǎn)物中含有大小為100_500bp(如240-260bp)的DNA片段，則所述待測樣品 中含有或候選含有西洋參；若PCR產(chǎn)物中不含有大小為100_500bp(如240-260bp)的DNA 片段，則所述待測樣品中不含有或候選不含有西洋參；
[0023] 所述100-500bp(如240-260bp)的DNA片段具體為大小約為250bp的DNA片段 (在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)位于250bp處的條帶處于同一水平線上）。
[0024] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，得到含有熒光 染料的體系，按照如下方法確定待測樣品中是否含有西洋參：若觀察到所述含有熒光染料 的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品中含有或候選含有西洋參；若觀察不到所述含有熒 光染料的體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述