抗vegf/pigf雙特異性抗體、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開(kāi)了一種能同時(shí)與兩種不同靶點(diǎn) 相結(jié)合的雙特異性抗體、其制備方法及其在腫瘤治療中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 新生血管生成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。當(dāng)腫瘤的體積超 過(guò)Imm3時(shí)，依靠組織滲透所獲得的營(yíng)養(yǎng)不能夠支撐腫瘤繼續(xù)發(fā)展對(duì)于營(yíng)養(yǎng)的需求。因此， 腫瘤組織需要通過(guò)新生血管的生成來(lái)獲取其發(fā)展所需要的各種養(yǎng)分。處于缺氧以及營(yíng)養(yǎng)缺 乏狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種促新生血管生成的因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)，成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)，人胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PIGF)，腫瘤壞死因子-α (TNF-α)等。在這些 生長(zhǎng)因子的作用下，通過(guò)一系列復(fù)雜的過(guò)程，包括血管內(nèi)皮基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、 內(nèi)皮細(xì)胞增殖、管道化分支形成血管環(huán)和新的基底膜等步驟來(lái)形成新的血管。由于新生血 管生成在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性，通過(guò)抑制腫瘤的新生血管生成來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)已經(jīng) 成為當(dāng)今腫瘤臨床治療的重要手段。
[0003] 在腫瘤細(xì)胞分泌的各種促新生血管生成的生長(zhǎng)因子中，VEGF是公認(rèn)的針對(duì)內(nèi)皮細(xì) 胞特異性最高，促血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的有絲分裂原。VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的兩種高親和 力受體VEGFRl和VEGFR2結(jié)合后，直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其遷移和形成管腔樣 結(jié)構(gòu)；同時(shí)還可增加微血管通透性，引起血漿蛋白（主要是纖維蛋白原）外滲，并通過(guò)誘導(dǎo)間 質(zhì)產(chǎn)生而促進(jìn)體內(nèi)新生血管生成。VEGF在血管發(fā)生和形成過(guò)程中起著中樞性的調(diào)控作用， 是關(guān)鍵的新生血管生成刺激因子。
[0004] 目前，Genetech公司開(kāi)發(fā)的針對(duì)VEGF的特異性單克隆抗體Bevacizumab (Avastin)在臨床治療中已經(jīng)取得積極效果，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)其與化療藥物聯(lián)合用于轉(zhuǎn)移 性結(jié)腸癌、肺癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤疾病的治療。但是由于腫瘤細(xì)胞所分泌的促血管新 生因子的多樣性，以及相關(guān)的各種因子在功能上具有一定的可替代性，因此通過(guò)抑制單個(gè) 促血管新生因子如VEGF的活性并不能完全阻斷腫瘤內(nèi)的新生血管的生成。臨床前動(dòng)物實(shí) 驗(yàn)表明，腫瘤組織在經(jīng)過(guò)Bevacizumab處理后，組織內(nèi)的其他促血管新生因子如PIGF，血管 生成素 _l(angiopoietin_l)，F(xiàn)GF 的表達(dá)量顯著上升，（Casanovas 0, Hicklin DJ, Bergers G，Hanahan D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell2005;8:299-309. )〇 此外，臨床試驗(yàn)也進(jìn)'一*步證明，在結(jié)腸癌患者中，經(jīng)過(guò)抗VEGF的治療后，患者體內(nèi)的PIGF 水平顯著升高（Willett CG，Boucher Y，Duda DG，di Tomaso E，Munn LL，et al. Surrogate markers for antiangiogenic therapy and dose-limiting toxicities for bevacizumab with radiation and chemotherapy: continued experience of phase I trial in rectal cancer patients. J Clin 0ncol2005;23:8136_9)。
[0005] 與VEGF不同的是，PIGF選擇性地與VEGFRl以及它的輔助受體神經(jīng)氈蛋 白-l(neuropilin-l)和神經(jīng)毯蛋白-2 (neuropilin-2)相結(jié)合，并且在巨嗤細(xì)胞、骨髓 前體細(xì)胞的表面表達(dá)大量的VEGFR1。功能上，PIGF除了能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移 外，還能夠通過(guò)趨化作用招募巨噬細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織，在腫瘤組織內(nèi)形成 一個(gè)有利于血管新生的微環(huán)境。依賴PIGF所招募的巨噬細(xì)胞以及相關(guān)髓系細(xì)胞在腫瘤 組織新生血管生成的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。研究表明，侵潤(rùn)進(jìn)入腫瘤組織的巨噬細(xì) 胞在相關(guān)微環(huán)境中被誘導(dǎo)成M2型巨噬細(xì)胞。與Ml型巨噬細(xì)胞主要起激活機(jī)體特異性免 疫應(yīng)答的作用不同，M2型巨噬細(xì)胞能夠大量合成和釋放各種抗炎細(xì)胞因子如白介素-10 (IL-10)、腫瘤生長(zhǎng)因子-β (TGF-β )等、免疫抑制因子以及多種促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞因 子，從而抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。通過(guò)氯膦酸鹽脂質(zhì)體（clodronate liposomes)或抗PIGF抗體去除侵潤(rùn)腫瘤組織的巨噬細(xì)胞后，組織內(nèi)的血管新生和腫瘤的 生長(zhǎng)被顯著抑制。此外，臨床前動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，在對(duì)抗VEGF抗體耐受的移植瘤模型中， 抗PIGF抗體和抗VEGF抗體聯(lián)用能夠顯著增強(qiáng)抗VEGF抗體的體內(nèi)抗腫瘤作用（Fischer Cj Jonckx Bj Mazzone M，Zacchigna Sj Loges S，et al.Anti-PIGF inhibits growth of VEGF(R)-inhibitor-resistant tumors without affecting healthy vessels. Cell2007; 131:463-75)。但是在臨床實(shí)踐中，一方面，由于聯(lián)合應(yīng)用兩種抗體造價(jià)太高，且 可用于組合治療的抗體數(shù)目有限，另一方面，臨床上兩種不同靶向抗體藥物進(jìn)行聯(lián)合治療 在安全性方面存在著諸多風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 因此，構(gòu)建一個(gè)能夠同時(shí)與VEGF和PIGF相結(jié)合的雙特異性抗體，進(jìn)而更有效地抑 制腫瘤生長(zhǎng)，一直是本領(lǐng)域的技術(shù)人員急待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了大量試驗(yàn)，得到了一個(gè)可以同時(shí)阻斷 VEGF和PIGF兩個(gè)靶點(diǎn)的雙特異性抗體，即本發(fā)明所述的"重組抗VEGF/PIGF雙特異性抗 體"，從而完成了本發(fā)明。
[0008] 具體地，本發(fā)明公開(kāi)了：
[0009] 1、一種抗VEGF/PIGF雙特異性抗體，其特征在于，所述抗體既能與VEGF結(jié)合，又能 與PIGF相結(jié)合。
[0010] 2、上述1所述抗VEGF/PIGF雙特異性抗體，其特征在于，所述雙特異性抗體氨基酸 序列包含抗VEGF單克隆抗體的可變區(qū)和抗PIGF單克隆抗體的可變區(qū)序列。
[0011] 3、上述1或2所述抗VEGF/PIGF雙特異性抗體，其特征在于，所述雙特異性抗體輕 鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:8所示，所述雙特異性抗體重鏈可變區(qū) 氨基酸序列為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 12所示。優(yōu)選地，
[0012] 所述雙特異性抗體還包括恒定區(qū)，且其輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:2所 示，重鏈恒定區(qū)氨基酸序列為SEQ ID N0:4所示。
[0013] 4、一種分離的核酸分子，其編碼上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體。 優(yōu)選地，所述核酸分子編碼所述雙特異性抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO: 7所示，編碼所述雙特異性抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11 所示。
[0014] 5、一種表達(dá)載體，含有上述4所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相 連的表達(dá)調(diào)控序列；優(yōu)選的，其所述載體可以為pCHOl. 0、pDRl、pcDNA3. 1 ( + )、pcDNA3. 1/ ZEO(+)或 pDHFR。
[0015] 6. -種宿主細(xì)胞，含有上述5所述的載體。優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。優(yōu) 選的，所述宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。最優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。7、一種制備上 述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體的方法，所述方法包括步驟：
[0016] a)在表達(dá)條件下，培養(yǎng)上述6所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)抗VEGF/PIGF雙特異性抗 體，
[0017] b)分離或純化所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體。
[0018] 8、一種組合物，含有上述1-3任一所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 9、上述1-3任一所述的抗VEGF/PIGF雙特異性抗體或上述8所述的組合物在制備 抗腫瘤藥物中的用途。
[0020] 10、上述9所述用途，還包括和其他的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用。
[0021] 本發(fā)明中，任何能夠同時(shí)和VEGF，P