射器往細(xì)胞培養(yǎng)層模具腔體內(nèi)注入水凝膠材料，使水凝膠材料完全填充滿腔體。然后將細(xì)胞培養(yǎng)層模具整體置于一密閉空間內(nèi)，采用紫外燈垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜表面30分鐘，使水凝膠材料固化，在固化過(guò)程中始終充氮?dú)獗Ｗo(hù)。待水凝膠固化成型后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)層掩摸，得到細(xì)胞培養(yǎng)層6。
[0024]被細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜不透光部位覆蓋的位置由于無(wú)法接收到紫外線的照射而形成凹孔或凹槽。本實(shí)施例中，與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓對(duì)應(yīng)的位置形成凹孔，該凹孔為細(xì)胞培養(yǎng)室1，與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的矩形對(duì)應(yīng)位置形成凹槽，該凹槽為代謝物收集池a部2。采用本發(fā)明水凝膠材料的配比、厚度以及紫外線照射時(shí)間，可保證固化而成的細(xì)胞培養(yǎng)層上形成預(yù)期的凹孔或凹槽而不被洞穿，以利于后期的細(xì)胞培養(yǎng)及代謝液的收集。固化而成的細(xì)胞培養(yǎng)層厚度為1_，采用該厚度，既節(jié)約材料，又能保證芯片的韌性，使芯片不容易裂解。紫外燈可采用氮?dú)馓畛浔銛y式紫外燈，其可在氮?dú)獯嬖诘那闆r下，進(jìn)行紫外光照，氮?dú)鉃槎栊詺怏w，其可隔絕氧氣，防止因氧氣的參與而發(fā)生氧阻聚。
[0025]制備微通道層:將微通道層掩膜置于制得的細(xì)胞培養(yǎng)層6之上，微通道層掩膜距離細(xì)胞培養(yǎng)層1mm，微通道層掩膜上的圓與細(xì)胞培養(yǎng)層上的凹孔相重合，微通道層上的矩形與細(xì)胞培養(yǎng)層上的凹槽相重合；將細(xì)胞培養(yǎng)層與微通道層掩膜四周封閉，其內(nèi)形成一水凝膠灌注腔體，得到微通道層模具。在避光條件下采用注射器往微通道層模具腔體內(nèi)注入水凝膠材料，使水凝膠材料完全填充滿腔體。然后將微通道層模具整體置于一密閉空間內(nèi)，采用紫外燈垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜表面10~20分鐘，使水凝膠材料固化，在固化過(guò)程中始終充氮?dú)獗Ｗo(hù)。待水凝膠固化成型后，去掉微通道層掩摸，得到微通道層7。
[0026]被微通道層掩膜不透光部位覆蓋的位置由于無(wú)法接收紫外線的照射而形成洞穿的孔或槽。本實(shí)施例中，與微通道層掩膜上的網(wǎng)狀線路對(duì)應(yīng)的位置形成流體微通道3，與微通道層掩膜上的矩形對(duì)應(yīng)的位置形成代謝物收集池b部5，該代謝物收集池b部5與代謝物收集池a部2結(jié)合形成代謝物收集池，該代謝物收集池與流體微通道3相連通，與微通道層掩膜上的圓對(duì)應(yīng)的位置形成細(xì)胞捕獲孔5。
[0027]洗脫及制備封蓋層:將制得的微通道層置于PBS緩沖液中進(jìn)行洗脫，去除未反應(yīng)完全的水凝膠材料，再用PDMS封蓋，形成封蓋層8。在PDMS封蓋層8上開設(shè)有通孔12和檢測(cè)窗口 10，檢測(cè)窗口 10對(duì)應(yīng)于代謝液收集池位置，該檢測(cè)窗口 10為鏤空結(jié)構(gòu)。在檢測(cè)窗口10上設(shè)有可覆蓋該檢測(cè)窗口的門9，該門9與封蓋層8滑動(dòng)配合，可通過(guò)推拉方式打開或關(guān)閉檢測(cè)窗口 10。在門9上設(shè)有通氣孔12和泵孔13。至此，完成微流控芯片的制備。
[0028]由本發(fā)明方法制得的微流控芯片為三層結(jié)構(gòu)，底層為設(shè)置有多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室I的細(xì)胞培養(yǎng)層，為細(xì)胞提供三維生長(zhǎng)環(huán)境，最多可同時(shí)培養(yǎng)60組細(xì)胞樣本；將每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室I的直徑設(shè)置為1.5_，可在同等厚度的情況下，大大增加細(xì)胞培養(yǎng)室I的體積，有利于細(xì)胞貼壁，有利于細(xì)胞觸角、鞭毛立體生長(zhǎng)。中間層為微通道層，其上設(shè)置有模擬人體肺部組織結(jié)構(gòu)的流體微通道，可通過(guò)流體微通道進(jìn)樣口注入細(xì)胞懸浮液或培養(yǎng)液，細(xì)胞懸浮液或培養(yǎng)液通過(guò)流體微通道的分流作用均勻的充滿每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室，該流體微通道完全模擬人體肺部組織結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供更接近于人體的生長(zhǎng)環(huán)境，其代謝產(chǎn)物非常接近于人體細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，使檢測(cè)數(shù)據(jù)更加貼近于人體真實(shí)情況，為后續(xù)的分析工作提供更準(zhǔn)確的科學(xué)依據(jù)，以利于對(duì)肺癌的早期診斷。代謝液收集池可收集多余的細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞代謝液，由于本微流控芯片可同時(shí)培養(yǎng)60組肺癌細(xì)胞，每組肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境完全相同，加之代謝液體收集池積較大，由代謝液收集池收集的細(xì)胞代謝液體積完全滿足檢測(cè)需要，可直接采用卟啉傳感器可視陣列芯片或其他檢測(cè)儀器對(duì)代謝液收集池中的細(xì)胞代謝液進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。
[0029]以下以具體配方為例，對(duì)水凝膠材料的配方加以說(shuō)明:
配方 1:預(yù)聚物包括 PEGDA、HEMA 和 NVP，其中，PEGDA 為 1.8ml, HEMA 為 1.2ml, NVP 為
0.3ml，預(yù)聚物的總質(zhì)量為3.5g，加入Irgacure2959，其質(zhì)量為0.0140g，攪拌均勻。采用該配方水凝膠材料制成的微流控芯片生物相容性好、細(xì)胞粘附力強(qiáng)、消耗材料較少，容脹率小，具有較好的韌性，可重復(fù)使用5次以上。
[0030]配方2:預(yù)聚物包括 PEGDA、HEMA 和 NVP，其中，PEGDA 為 2.lml, HEMA 為 0.9ml, NVP為0.3ml，預(yù)聚物的總質(zhì)量為3.4g，加入Irgacure2959同，其質(zhì)量為0.0135g，攪拌均勻。采用該配方水凝膠材料制成的微流控芯片生物相容性好、細(xì)胞粘附力強(qiáng)、消耗材料較少，容脹率小，具有較好的韌性，可重復(fù)使用5次以上。
[0031]配方3:預(yù)聚物包括PEGDA和HEMA，其中，PEGDA為2ml，HEMA為2ml，預(yù)聚物的總質(zhì)量為3.3g，加入Irgacure2959，其質(zhì)量為0.012g，攪拌均勻。采用該配方水凝膠材料制成的微流控芯片生物較為柔軟，容脹率大，吸水速率快，放進(jìn)水里30min發(fā)生降解，僅能使用一次。
[0032]配方4:預(yù)聚物包括 PEGDA、HEMA 和 NVP，其中，PEGDA 為 2.lml, HEMA 為 0.7ml, NVP為0.6ml，預(yù)聚物的總質(zhì)量為3.84g，加入Irgacure2959，其質(zhì)量為0.016g，攪拌均勻。采用該配方水凝膠材料制成的微流控芯片硬度較高，生物相容性差，無(wú)法使用。
[0033]由上述配方可看出，由配方I和配方2的水凝膠材料制成的微流控芯片性能最優(yōu)，更能模擬人體組織環(huán)境，更利于細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0034]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 制備掩膜:采用繪圖軟件分別繪制細(xì)胞培養(yǎng)層和微通道層掩膜圖，并采用菲林膠片打印該掩膜圖，制得細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜和微通道層掩膜； 其中，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上設(shè)有按矩陣排列的60個(gè)圓，每排12個(gè)，共5排，每個(gè)圓的直徑為1.5mm ;靠近矩陣圓的一端設(shè)有一矩形,矩形的長(zhǎng)為16mm,寬為11_ ;細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓和矩形均不透光，其余部分為透光； 微通道層掩膜包括網(wǎng)狀線路和矩形，網(wǎng)狀線路的一端為橫向尺寸為2.5mm的長(zhǎng)方形，長(zhǎng)方形的一端分化為兩條最大橫向尺寸為5_的第一支路，每條第一支路再分化形成第二支路，第二支路再分化形成縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的微支路，微支路的橫向尺寸為1mm，在微支路交錯(cuò)處、且與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的圓對(duì)應(yīng)的位置設(shè)有直徑為1.5mm的圓；矩形與網(wǎng)狀線路的另一端連接，矩形的長(zhǎng)為16mm，寬為11mm，該矩形與位于細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜上的矩形相對(duì)應(yīng)；微通道層掩膜上的網(wǎng)狀線路和矩形部分為不透光，其余部分為透光； 配制水凝膠材料:按體積比為PEGDA =HEMA= (1.5-2.33):1的比例加入PEGDA和HEMA，形成PEGDA和HEMA混合物；加入NVP，NVP的體積為PEGDA和HEMA混合物體積的10%~15%，得到預(yù)聚物；在避光條件下加入光引發(fā)劑，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.39^0.45%，采用超聲振蕩，將混合物振蕩均勻無(wú)氣泡，靜置，得到水凝膠材料； 制備細(xì)胞培養(yǎng)層:將細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜置于玻璃基片之上，細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜距離玻璃基片Imm ;將玻璃基片與細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜四周封閉，其內(nèi)形成一水凝膠灌注腔體，得到細(xì)胞培養(yǎng)層模具；在避光條件下采用注射器往細(xì)胞培養(yǎng)層模具腔體內(nèi)注入水凝膠材料，使水凝膠材料完全填充滿腔體；然后將細(xì)胞培養(yǎng)層模具整體置于一密閉空間內(nèi)，采用紫外燈垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜表面30分鐘，使水凝膠材料固化，在固化過(guò)程中始終充氮?dú)獗Ｗo(hù)；待水凝膠固化成型后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)層掩摸，得到細(xì)胞培養(yǎng)層； 制備微通道層:將微通道層掩膜置于制得的細(xì)胞培養(yǎng)層之上，微通道層掩膜距離細(xì)胞培養(yǎng)層Imm ;將細(xì)胞培養(yǎng)層與微通道層掩膜四周封閉，其內(nèi)形成一水凝膠灌注腔體，得到微通道層模具；在避光條件下采用注射器往微通道層模具腔體內(nèi)注入水凝膠材料，使水凝膠材料完全填充滿腔體；然后將微通道層模具整體置于一密閉空間內(nèi)，采用紫外燈垂直照射細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜表面10~20分鐘，使水凝膠材料固化，在固化過(guò)程中始終充氮?dú)獗Ｗo(hù)；待水凝膠固化成型后，去掉微通道層掩摸，得到微通道層； 洗脫及制備封蓋層:將制得的微通道層置于PBS緩沖液中進(jìn)行洗脫，去除未反應(yīng)完全的水凝膠材料，再用PDMS封蓋，形成封蓋層；完成微流控芯片的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片，其特征在于，所述水凝膠材料中，PEGDA與HEMA的體積比為1.5:1，NVP的體積為PEGDA與HEMA總體積的10%，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.4%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法，其特征在于，所述水凝膠材料中，PEGDA與HEMA的體積比為2.3: 1，NVP的體積為PEGDA與HEMA總體積的15%，光引發(fā)劑的質(zhì)量為預(yù)聚物質(zhì)量的0.3%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于培養(yǎng)及檢測(cè)肺癌細(xì)胞的微流控芯片制備方法，包括如下步驟：制備掩膜；配制水凝膠材料；制備細(xì)胞培養(yǎng)層：將細(xì)胞培養(yǎng)層掩膜置于玻璃基片之上，在避光條件下注入水凝膠材料，使水凝膠材料固化；制備微通道層：將微通道層掩膜置于制得的細(xì)胞培養(yǎng)層之上，在避光條件下注入水凝膠材料，使水凝膠材料固化；洗脫及制備封蓋層：將制得的微通道層進(jìn)行洗脫，再用PDMS封蓋；由發(fā)明方法制備的微流控芯片可同時(shí)培養(yǎng)多組細(xì)胞樣，為細(xì)胞提供三維生長(zhǎng)環(huán)境，其完全模擬人體肺部組織結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供更接近于人體的生長(zhǎng)環(huán)境，其代謝產(chǎn)物非常接近于人體細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，使檢測(cè)數(shù)據(jù)更加貼近于人體真實(shí)情況，更利于對(duì)肺癌的早期診斷。
【IPC分類】C12M1-00, C12M3-04
【公開號(hào)】CN104560713
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510049392
【發(fā)明人】侯長(zhǎng)軍, 鄧艷, 郭明遺, 霍丹群, 楊眉, 法煥寶, 羅小剛
【申請(qǐng)人】重慶大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月31日