基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn) 乙醇真菌的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物質(zhì)能源是未來可持續(xù)能源系統(tǒng)的重要組成部分，從本世紀(jì)開始，生物能進(jìn) 入可再生資源的研究領(lǐng)域，其以無污染，效率高等優(yōu)點(diǎn)成為世界上利用能源的主要方向，因 此目前開發(fā)利用生物能已成為各國(guó)的共同目標(biāo)。而在生物能源當(dāng)中，目前研究最廣泛，最有 效果的就是生物乙醇的利用和開發(fā)。由目前的社會(huì)的科技水平和發(fā)展的程度而言，在能夠 預(yù)見的未來幾十年中燃料乙醇是完全有可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的。
[0003] 優(yōu)良的微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和 質(zhì)量有較大的改善，首先必須選育性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，性能優(yōu)良的菌株可以為生產(chǎn)帶來 很高的經(jīng)濟(jì)效益。目前在高產(chǎn)乙醇釀酒酵母篩選的方法主要有，高濃度酒精平板篩選法、 TTC復(fù)合平板篩選法等。這些方法工作量都很大，在進(jìn)行菌落篩選時(shí)，往往依靠實(shí)驗(yàn)人員經(jīng) 驗(yàn)，憑借肉眼觀察，選擇目的菌株，存在盲目性，大大降低了篩選效率。
[0004] 活性氧（reactive oxygen species, R0S)是指氧的某些衍生物如超氧負(fù)離子 (〇2-)、羥自由基（0H ·)和過氧化氫（H2O2)等，過量的ROS能夠使生物大分子如DNA、蛋白 質(zhì)、脂類發(fā)生過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，影響生理活性。Howlett檢測(cè)了銅離 子所引起的釀酒酵母胞內(nèi)ROS的變化，發(fā)現(xiàn)ROS水平對(duì)細(xì)胞周期有一定影響。有研究表明， 酵母細(xì)胞整體活性以及產(chǎn)醇能力與其體內(nèi)ROS的水平呈一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這為我們 以對(duì)數(shù)期酵母體內(nèi)ROS的含量作為篩選條件提供了有力的支撐。
[0005] 流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry, FCM)能夠快速地對(duì)個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行光化學(xué)分析， 使研究人員建立個(gè)體細(xì)胞在群體中的多維表象，與常規(guī)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法相比具有很多優(yōu) 勢(shì)，如精確度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。它用于對(duì)懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選。 通過使用特定的染料對(duì)樣品進(jìn)行染色，從而激發(fā)檢測(cè)標(biāo)記的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì) 胞定量分析和分選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒及 其應(yīng)用，該試劑盒基于流式細(xì)胞技術(shù)，利用真菌細(xì)胞整體活性以及產(chǎn)醇能力與其體內(nèi)ROS 的水平呈一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，來判斷被測(cè)真菌的產(chǎn)醇能力，應(yīng)用該試劑盒可以快速高 效的篩選高產(chǎn)乙醇的真菌，提高工業(yè)篩選效率。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒，包括盒體與試劑，還包括細(xì)胞培 養(yǎng)板、離心管和銅篩，所述的試劑包括試劑A、B、C、D、E、F各一瓶： 試劑A :檸檬酸：6. 15g ;檸檬酸鈉：17. 544g ;加雙蒸水定容至lOOOmL，高壓滅菌后封 裝； 試劑B :碘化丙啶（PI) :0· 3mg ;2, 7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉：0· 3mg ; 試劑C :葡萄糖：2g，加雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝； 試劑D :葡萄糖：12g，加雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝； 試劑E :酵母粉：0. 5g ;胰蛋白胨：0. 5g ;磷酸氫二銨：0. 05g ;硫酸鎂：0. 025g，加雙蒸水 40mL溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5. 5,再用雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝； 試劑F :酵母粉：0. 05g ;胰蛋白胨：0. 05g ;磷酸氫二銨：0. 05g ;硫酸鎂：0. 025g，加雙蒸 水40mL溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5. 5,再用雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝。
[0008] 所述細(xì)胞培養(yǎng)板為48孔~96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0009] 所述離心管為0. 5~1. 5mL離心管。
[0010] 所述銅篩為200~400目。
[0011] 所述細(xì)胞培養(yǎng)板為1~2塊,離心管為48~96支,銅篩1只。
[0012] 所述試劑B分裝在棕色離心管中。
[0013] 所述NaOH溶液濃度為l~5mol/L。
[0014] 所述細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管和銅篩均進(jìn)行過滅菌處理，可以是紫外照射滅菌，也可以 是高溫加熱滅菌。所述試劑盒保存在4°C條件下。
[0015] 所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒在篩選產(chǎn)乙醇真菌中的 應(yīng)用。
[0016] 所述的應(yīng)用，包括如下步驟： 試劑B :碘化丙啶（PI) :0· 3mg ;2, 7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA) :0· 3mg ;臨用 時(shí)加無菌雙蒸水定容至3mL，暗處濾過消毒，現(xiàn)配現(xiàn)用； 試劑E與試劑C充分混合，4°C保存?zhèn)溆茫?試劑F與試劑D充分混合，4°C保存?zhèn)溆茫?本發(fā)明試劑盒使用方法如下： 1) 、試劑B的配置：碘化丙啶（PI) :0. 3mg ;2, 7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA): 0. 3mg ;臨用時(shí)加無菌雙蒸水定容至3mL，暗處濾過消毒，現(xiàn)配現(xiàn)用； 2) 、菌懸液的制備 取被測(cè)菌液ImL于4°C、5500r/min離心IOmin,棄去上層清液，菌體沉淀用試劑A清洗 兩邊，再用ImL試劑A懸浮，獲得菌懸液，備用； 3) 、根據(jù)需要對(duì)菌懸液進(jìn)行各種誘變處理，例如化學(xué)誘變、紫外照射誘變、離子束注入 誘變等處理后獲得誘變后的菌懸液，備用； 4) 、將試劑C與試劑E充分混合，在孔板中加入試劑C+E，添加量為500-1000 μ 1/孔；向 步驟2)獲得的菌懸液中加入30 μ 1試劑Β，于37°C避光放置lOmin，用300目銅篩過濾后， 于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，用孔板進(jìn)行收集，每個(gè)孔收集IX IO4個(gè)菌體；放入恒溫?fù)u床，37°C， 250r/min 培養(yǎng) 24h ; 5) 、將試劑D與試劑F充分混合，分裝至無菌的IOmL離心管中，5mL/管； 6) 、將步驟4)中所得到的菌液，一一對(duì)應(yīng)的加至步驟五所準(zhǔn)備好的離心管中， 500-1000 μ 1/ 管；放入恒溫?fù)u床，37°C，150r/min 培養(yǎng) 60h ; 7)、檢測(cè)步驟6)所得到的發(fā)酵液中酒精的含量。
[0017] 有益效果：本發(fā)明提供的基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒及其 應(yīng)用，該試劑盒基于流式細(xì)胞技術(shù)，利用真菌細(xì)胞整體活性以及產(chǎn)醇能力與其體內(nèi)ROS的 水平呈一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系，來判斷被測(cè)真菌的產(chǎn)醇能力，應(yīng)用該試劑盒可以快速高效 的篩選高產(chǎn)乙醇的真菌，提高工業(yè)篩選效率，節(jié)約勞動(dòng)成本，同時(shí)試劑盒所用試劑量少，可 同時(shí)篩選48~96個(gè)樣品，大大提高效率。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)例，對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述。 實(shí)施例1 用本發(fā)明試劑盒測(cè)定離子束注入對(duì)釀酒酵母體內(nèi)ROS含量的影響 一、 配置溶液 試劑B :碘化丙啶（PI) :0· 3mg ;2, 7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH-DA) :0· 3mg，分裝 在棕色離心管中，避光保存，加無菌雙蒸水定容至3mL，暗處濾過消毒，現(xiàn)配現(xiàn)用； 二、 測(cè)定離子束注入對(duì)釀酒酵母體內(nèi)ROS含量的影響 1.對(duì)釀酒酵母進(jìn)行離子束注入 (a)培養(yǎng)好的菌液于4°C、5500r/min離心IOmin,棄去上層清液，試劑A清洗兩遍，再用 試劑A懸浮酵母細(xì)胞沉淀物，留待N+注入處理。
[0019] (b)用滅菌的保護(hù)液（0. 5%(wt)淀粉和0. 5%(wt)葡萄糖)稀釋上述菌懸液，取稀釋 液100 μ L，用無菌玻璃刮鏟均勻涂布于直徑為90_的無菌培養(yǎng)皿中央，無菌風(fēng)吹干制成菌 膜。將制備的菌膜分別置于離子注入機(jī)真空靶室的無菌靶臺(tái)上，在I X KT3Pa真空狀態(tài)下采 用能量為 15KeV，劑量分別為 0、4X 1015、5X 1015、6X 1015、8X IO15UOX IO15UlX 1015ions/ cm2，的N+注入酵母菌膜，分別以I. 5mL試劑A浸泡、洗脫，獲得洗脫下來的菌液，將獲得的 菌液依次命名ck、a、b、c、d、e、f。
[0020] 2.試劑盒測(cè)定 (a) 取被測(cè)菌液ck、a、b、c、d、e、f各ImL于4°C、5500r/min離心lOmin，棄去上層清 液，菌體沉淀用試劑A清洗一遍，再用ImL試劑A懸浮，獲得菌懸液，備用； (b) 將試劑C與試劑E充分混合，在48孔板中加入試劑C+E，添加量為500-1000 μ 1/ 孔； (c) 向步驟（a)獲得的菌懸液中加入30 μ 1試劑Β，于37°C避光放置lOmin，用300目 銅篩過濾后，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)，用步驟（b)中所準(zhǔn)備好的48孔板進(jìn)行收集，每個(gè)孔收集 I X IO4個(gè)菌體，，放入恒溫?fù)u床，37°C，250r/min培養(yǎng)24h，得到菌液； (d) 將試劑D與試劑F充分混合，分裝至48支無菌的IOmL離心管中，5mL/管； (e) 將步驟（c)中所得到的菌液，一一對(duì)應(yīng)的加至步驟（d)所準(zhǔn)備好的離心管中， 1000 μ 1/管；放入恒溫?fù)u床，37°C，150r/min培養(yǎng)60h ; 三、 檢測(cè)結(jié)果如表1。
[0021] 表1:
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒，包括盒體與試劑，其特征在于： 還包括細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管和銅篩，所述的試劑包括試劑A、B、C、D、E、F各一瓶 ： 試劑A :檸檬酸：6. 15g ;檸檬酸鈉：17. 544g ;加雙蒸水定容至IOOOmL,高壓滅菌后封 裝； 試劑B :碘化丙啶：0· 3mg ;2, 7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉：0· 3mg ; 試劑C :葡萄糖：2g，加雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝； 試劑D :葡萄糖：12g，加雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝； 試劑E :酵母粉：0. 5g ;胰蛋白胨：0. 5g ;磷酸氫二銨：0. 05g ;硫酸鎂：0. 025g，加雙蒸水 40mL溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5. 5,再用雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝； 試劑F :酵母粉：0. 05g ;胰蛋白胨：0. 05g ;磷酸氫二銨：0. 05g ;硫酸鎂：0. 025g，加雙蒸 水40mL溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5. 5,再用雙蒸水定容至50mL，高壓滅菌后封裝。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒,其特征在 于：所述細(xì)胞培養(yǎng)板為48孔~96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒,其特征在 于：所述離心管為〇. 5~1. 5mL離心管。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒,其特征在 于：所述銅篩為200~400目。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒,其特征在 于：所述細(xì)胞培養(yǎng)板為1~2塊，離心管為48~96支，銅篩1只。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒，其特征在 于：所述試劑B分裝在棕色離心管中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒，其特征在 于：所述NaOH溶液濃度為l~5mol/L。
8. 權(quán)利要求1~7中任意一項(xiàng)所述基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒 在篩選產(chǎn)乙醇真菌中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于流式細(xì)胞技術(shù)高通量篩選產(chǎn)乙醇真菌的試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括盒體與試劑，還包括細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管和銅篩，所述的試劑為：試劑A：檸檬酸：6.15g；檸檬酸鈉：17.544g；1000mL；試劑B：碘化丙啶（PI）：0.3mg；2,7-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉：0.3mg；試劑C：葡萄糖：2g，50mL；試劑D：葡萄糖：12g，50mL；試劑E：酵母粉：0.5g；胰蛋白胨：0.5g；磷酸氫二銨：0.05g；硫酸鎂：0.025g，pH？5.5，50mL；試劑F：酵母粉：0.05g；胰蛋白胨：0.05g；磷酸氫二銨：0.05g；硫酸鎂：0.025g，pH？5.5，50mL。
【IPC分類】C12N1-14
【公開號(hào)】CN104560725
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410753166
【發(fā)明人】虞龍, 劉媛, 李玉燕
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月11日