一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁較厚，約20~80皿。膚聚糖含量豐富，有15~50層，每層厚 度Inm,約占細(xì)胞干重的50~80%。此外，尚有大量特殊組份憐壁酸。憐壁酸是由核糖醇或 甘油殘基經(jīng)由憐酸二鍵互相連接而成的多聚物。憐壁酸分壁憐壁酸和膜憐壁酸兩種，前者 和細(xì)胞壁中膚聚糖的n-乙酷胞壁酸連結(jié)，膜憐壁酸又稱脂憐壁酸和細(xì)胞膜連結(jié)，另一端均 游離于細(xì)胞壁外。憐壁酸抗原性很強，是革蘭氏陽性菌的重要表面抗原；在調(diào)節(jié)離子通過粘 膚層中起作用；也可能與某些酶的活性有關(guān)；某些細(xì)菌的憐壁酸，能粘附在人類細(xì)胞表面， 其作用類似菌毛，可能與致病性有關(guān)。
[0003] 現(xiàn)在，人們開始對革蘭氏陽性菌進(jìn)行快速檢測技術(shù)的研究W及各種生物學(xué)特征的 研究，目前研究主要集中在毒力調(diào)控機制、超抗原作用機制、耐藥性、菌膜形成與感染等方 面，然而運些研究的基礎(chǔ)是進(jìn)行基因組DNA的提取。因為革蘭氏陽性菌其細(xì)胞壁較厚，基因 組DNA提取難度較大。費時較長。
[0004] 因此需要研制一種適用于革蘭氏陽性菌基因組DNA提取的方便、快捷、實用的方 法，解決使用常規(guī)方法所獲得的DNA樣品提取時間長的問題。此外，有效的提取革蘭氏陽性 菌基因組DNA，能夠為進(jìn)行基因分析與基因克隆提供重要保證，從而豐富基因組學(xué)的研究內(nèi) 容。

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明提供一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，與傳統(tǒng)方法相比，利用該方法能 夠快速提取革蘭氏陽性菌基因組DNA。
[0006] 一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，包括革蘭氏陽性菌細(xì)胞的破碎，DNA的游 離與雜蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNAW及雜質(zhì)的去除，DNA洗脫，具體步驟如下： 革蘭氏陽性菌細(xì)胞的破碎：取3ml革蘭氏陽性菌過夜培養(yǎng)液分3次加到1. 5ml離屯、管 中，每次10000-13000巧m/min離屯、I-Smin后棄上清。往菌體沉淀中加入0. 2-0. 5mld地2〇 懸浮沉淀，并加入 50-80BufferA溶液，40°C保溫 10-50min。加入 30-60 BufferB， 5-10yIBufferC混勻，37°C保溫 30-60min。加入 0. 4-0. 6mlBufferD混勻。
[0007]DNA的游離與雜蛋白的抽除：加入200-600yIBufferE抽提，10000-13000巧m/ min離屯、10-30min，將上清轉(zhuǎn)移至1.5ml離屯、管中。加入200-600JilBufferF抽提， 10000-13000;rpm/min離屯、l〇-30min，將上清轉(zhuǎn)移至1. 5ml離屯、管中。
[000引DNA吸附柱吸附DNAW及雜質(zhì)的去除：往離屯、管中加入與上清等體積的沉淀劑，混 勻后加入DNA吸附柱，10000-13000巧m/min離屯、l-5min，棄廢液，加入200-600y1去蛋白 液，10000-13000巧m/min離屯、l-5min，棄廢液，加入 200-600y1 漂洗液，10000-13000巧m/ min離屯、l-5min，棄廢液，加入 200-600Ji1 漂洗液，10000-13000;rpm/min離屯、l-5min，棄廢 液，10000-13000;rpm/min離屯、l-5min，靜置吹干。
[0009]DNA洗脫：往吸附柱中加入10-50y1洗脫液，10000-13000巧m/min離屯、l-5min， 所得液體為革蘭氏陽性菌基因組DM。取2-7ylDNA水溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢 測。
[0010] 試劑的配方如下： 所述的DNA吸附柱為硅膠模吸附柱，購自北京天恩澤公司。
[0011] 所述的BufferA:溶菌酶（l〇-50mg/ml)。
[0012] 所述的Buffer6:10-20%質(zhì)量體積比的十二烷基硫酸鋼（SDS)。
[0013]所述的BufferC:蛋白酶K(2〇-50mg/ml)。
[0014]所述的BufferD:4-6mol/L氯化鋼（化化）。
[0015] 所述的BufferE:酪：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。
[0016] 所述的BufferF:氯仿：異戊醇的體積比為24:1。
[0017] 所述的沉淀劑：70-80%乙醇。
[001引所述的去蛋白液：3-6M鹽酸脈，10-30mMS徑甲基氨基甲燒燈ris)，抑= 6. 0-7. 0,用前加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的終濃度為30-40%。
[0019]所述的洗脫液：10-20mMS徑甲基氨基甲燒燈ris)，pH= 8. 0-9. 0 本發(fā)明的顯著優(yōu)點： 常規(guī)的革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒提取步驟較為繁瑣，耗時較長，提取時間一般需 要1化左右，一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒與常規(guī)的革蘭氏陽性菌基因組DNA提 取方法相比僅需要化左右即可提取到革蘭氏陽性菌基因組DNA，不僅節(jié)省了大量提取時 間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到革蘭氏陽性菌基因組DNA。
【附圖說明】
[0020] 圖1為利用本方法提取的革蘭氏陽性菌基因組DNA的電泳檢測圖。 具體實施例
[0021] 圖1中，泳道1為利用本方法提取葡萄球菌基因組DNA的試驗結(jié)果圖，泳道2為利 用本方法提取鏈球菌基因組DNA的試驗結(jié)果圖，泳道3為利用本方法提取放線菌基因組DNA 的試驗結(jié)果圖。泳道4是TAKARA公司的化4500marker。從圖中可看出本發(fā)明可隊陜速提 取革蘭氏陽性菌基因組DNA。
[0022] 一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，具體步驟如下： (1)革蘭氏陽性菌細(xì)胞的破碎：分別取3ml葡萄球菌、鏈球菌、放線菌過夜培養(yǎng)液分3 次加到1.5ml離屯、管中，設(shè)置3管重復(fù)，每次120(K)巧m/min離屯、Imin后棄上清。往菌體 沉淀中加入0. 25ml(1地2〇懸浮沉淀，并加入75y1BufferA溶液，40 °C保溫30min。加入 SOulBufferB，5JilBufferC混勻，37°C保溫 30min。加入 0.45mlBufferD混勻。 [002引 似DNA的游離與雜蛋白的抽除：加入500y1BufferE抽提，12000巧m/min離屯、 lOmin，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5ml離屯、管中。加入500Ji1BufferF抽提，12000;rpm/min 離屯、lOmin，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的1. 5ml離屯、管中。
[0024](3)DNA吸附柱吸附DNAW及雜質(zhì)的去除：往離屯、管中加入與上清等體積的沉 淀劑，混勻后加入DNA吸附柱，12000巧m/min離屯、Imin，棄廢液，加入500 y I去蛋白液，12000;rpm/min離屯、Imin,棄廢液，加入500Ji1漂洗液，12000;rpm/min離屯、Imin,棄廢液，加 入500Ji1 漂洗液，12000;rpm/min離屯、Imin,棄廢液，12000;rpm/min離屯、2min，靜置吹干。 [00巧](4)DNA洗脫：往吸附柱中加入30 y1洗脫液，12000巧m/min離屯、2min，所得液體 為革蘭氏陽性菌基因組DNA。取SiilDNA水溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。
[0026] 試劑的配方如下： 下表為本實施例提取到的革蘭氏陽性菌基因組DNA純度檢測結(jié)果。
[0027]BufferA:溶菌酶（20mg/ml)。
[0028]BufferB: 10%質(zhì)量體積比的十二烷基硫酸鋼（SDS)。
[0029] BufferC:蛋白酶K (20mg/ml)。
[0030] Buffer D: 5mol/L氯化鋼（化cl)。
[0031] BufferE:酪：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。
[0032]BufferF:氯仿：異戊醇的體積比為24:1。
[003引沉淀劑：70%乙醇。
[0034]去蛋白液：51鹽酸脈，2〇1111;徑甲基氨基甲燒燈'13)，化=6.6，使用前加入乙 醇，使得乙醇在去蛋白液中的終濃度為38%。
[003引漂洗液：20mM氯化鋼（化cl)，2mMミ?甲基氨基甲燒燈ris)，pH=7.5,85%比重 無水乙醇。
[003引洗脫液：10mMT;徑甲基氨基甲燒燈ris)，pH= 8. 5。
[0037] DNA吸附柱為硅膠模吸附柱，購自北京天恩澤公司。
【主權(quán)項】
1. 一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，包括革蘭氏陽性菌細(xì)胞的破碎，DNA的游 離與雜蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及雜質(zhì)的去除，DNA洗脫，其特征是： 革蘭氏陽性菌細(xì)胞的破碎：取3ml革蘭氏陽性菌過夜培養(yǎng)液分3次加到I. 5ml離心管 中，每次10000-13000rpm/min離心l_5min后棄上清；往菌體沉淀中加入0. 2-0. 5ml ddH20 懸浮沉淀，并加入 50-80 yl Buffer A 溶液，40°C保溫 10-50min;加入 30-60 yl Buffer B， 5-10 y I Buffer C 混勻，37°C保溫 30-60min ;加入 0? 4-0. 6ml Buffer D 混勻； DNA的游離與雜蛋白的抽除：加入200-600 y I Buffer E抽提，10000-13000rpm/min 離心10_30min，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的I. 5ml離心管中；加入200-600 y I Buffer F抽提， 10000-13000rpm/min離心10_30min，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的I. 5ml離心管中； DNA吸附柱吸附DNA以及雜質(zhì)的去除：往離心管中加入與上清等體積的沉淀劑，混勻后 加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min離心l-5min，棄廢液，加入200-600 y 1去蛋白液， 10000-13000rpm/min 離心 l-5min，棄廢液，加入 200-600 y 1 漂洗液，10000-13000rpm/min 離心l_5min，棄廢液，加入200-600 y 1漂洗液，10000-13000rpm/min離心l_5min，棄廢液， 10000-13000rpm/min 離心 l_5min，靜置吹干； DNA洗脫：往吸附柱中加入10-50 y 1洗脫液，10000-13000rpm/min離心l_5min，所得 液體為革蘭氏陽性菌基因組DNA ;取2-7 y I DNA水溶液，于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 DNA吸附柱為硅膠模吸附柱。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 Buffer A:l〇-50mg/ml 的溶菌酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 Buffer B: 10-20%質(zhì)量體積比的十二烷基硫酸鈉。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 Buffer C:20_50mg/ml 的蛋白酶 K06. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 Buffer D:4_6mol/L 的氯化鈉。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 Buffer E為酸：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 Buffer F:氯仿：異戊醇的體積比為24:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的沉 淀劑：70-80%乙醇。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，其特征是所述的 去蛋白液：3-6M鹽酸胍，10-30 mM三羥甲基氨基甲烷，pH=6. 0-7.0,用前加乙醇，使得乙醇 在去蛋白液中的終濃度為30-40%;所述的洗脫液：pH=8. 0-9. 0的10-20mM三羥甲基氨基甲 烷。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的試劑盒，包括革蘭氏陽性菌細(xì)胞的破碎，DNA的游離與雜蛋白的抽除，DNA吸附柱吸附DNA以及雜質(zhì)的去除，DNA洗脫的具體步驟。常規(guī)的革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒提取步驟較為繁瑣，耗時較長，提取時間一般需要12h左右，一種提取革蘭氏陽性菌基因組的試劑盒與常規(guī)的革蘭氏陽性菌基因組DNA提取方法相比僅需要2h左右即可提取到革蘭氏陽性菌基因組DNA，不僅節(jié)省了大量提取時間，同時簡化了實驗步驟，能夠更有效、快速、經(jīng)濟地提取到革蘭氏陽性菌基因組DNA。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105154430
【申請?zhí)枴緾N201510450059
【發(fā)明人】王清水, 余彥
【申請人】福建師范大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年7月28日