一種梅山豬或其肉制品的基因組分子鑒定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實(shí)用新型涉及生物領(lǐng)域，特別涉及一種梅山豬或其肉制品的基因組分子鑒定試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 梅山豬原產(chǎn)于太湖流域的上海市嘉定、寶山、松江等區(qū)縣和江蘇的昆山、太倉(cāng)等市 縣，是太湖豬中的典型代表，有肉質(zhì)好、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良特性。嘉定區(qū)的梅山豬品種 其肌肉鮮嫩、肌纖維細(xì)而密，含水量較少，肌肉脂肪豐富，呈大理石狀，俗稱"五花肉"，風(fēng)味 醇厚，細(xì)膩酥軟。隨著人們生活水平的提高，對(duì)畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量要求越來(lái)越高，許多以追求 高產(chǎn)為目的培育的外三元等品種在國(guó)內(nèi)越來(lái)越不受歡迎，取而代之的是豬肉市場(chǎng)消費(fèi)追求 多樣化、精細(xì)化、肉質(zhì)高品質(zhì)化。梅山豬因肉質(zhì)鮮美、香甜濃香而受到上海市民青睞，盡管價(jià) 格比較高卻供不應(yīng)求，導(dǎo)致市場(chǎng)上極易出現(xiàn)假冒梅山豬肉或其品牌或以次充好、以假亂真 的銷售行為。但目前尚沒有鑒定梅山豬肉或其肉制品的方法可以有效地保護(hù)正宗梅山豬肉 或其肉制品的質(zhì)量品質(zhì)和品牌形象。
[0003] 目前，制定了以活體豬為檢測(cè)對(duì)象的鑒別梅山豬的地方性標(biāo)準(zhǔn)方法，但是對(duì)梅山 豬宰殺后分割肉或其他肉制品就不能使用地方標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行鑒定了。而傳統(tǒng)的鑒別方法則 通過測(cè)定豬胴體和肉質(zhì)特征來(lái)評(píng)價(jià)生鮮肉或其肉制品品質(zhì)，包括瘦肉率、嫩度、pH值、肉色 等區(qū)別肉品質(zhì)好壞。但由于飼養(yǎng)條件和豬個(gè)體存在差異，且對(duì)測(cè)試豬生長(zhǎng)日齡和取樣部位 有具體要求，使得檢測(cè)人員的工作十分不便并且使檢測(cè)結(jié)果容易發(fā)生較大的誤差，導(dǎo)致檢 測(cè)結(jié)果缺乏重復(fù)性和準(zhǔn)確性。此外，由于肉質(zhì)指標(biāo)大多沒有統(tǒng)一的數(shù)值范圍，個(gè)體差異也比 較明顯，因此肉質(zhì)指標(biāo)也不能作為鑒定梅山豬的依據(jù)。目前，豬全基因組測(cè)序技術(shù)雖然可以 鑒別不同品種、甚至不同個(gè)體的豬，但需要檢測(cè)的基因數(shù)目很多，成本大，不可能在實(shí)際日 常商業(yè)活動(dòng)中推廣。而若只檢測(cè)不同品種豬個(gè)別基因，則不能區(qū)分轉(zhuǎn)基因豬肉制品和純種 豬肉制品。
[0004] DNA分子標(biāo)記是基于基因組DNA序列豐富的多態(tài)性發(fā)展而來(lái)的一種遺傳標(biāo)記，可 直接反映DNA水平上的差異，具有其它遺傳標(biāo)記所不具有的優(yōu)點(diǎn)，如變異穩(wěn)定豐富、信息量 大、受環(huán)境因素影響小、不受取材部位、發(fā)育時(shí)期限制、可隨時(shí)檢測(cè)、操作方便等，故可以用 于動(dòng)植物等品種鑒定、遺傳育種等領(lǐng)域，近年來(lái)得到了迅速的發(fā)展。ISSR是Zietkiewicz 等于1994創(chuàng)建的一類在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，它是根據(jù)基因組內(nèi)廣泛存在 的微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)的單一引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)，它對(duì)兩個(gè)序列相同但方向相 反的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR)之間的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR技術(shù)和PCR技術(shù)聯(lián)合使用具有很高 的特異性和靈敏度且準(zhǔn)確快速，近年來(lái)在品種鑒定、種質(zhì)資源和遺傳多樣性研宄中得到了 廣泛應(yīng)用：申請(qǐng)?zhí)枮?01310209120. 8的發(fā)明專利公開了利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒別四川 白鵝真?zhèn)蔚姆椒?。其中共用?個(gè)ISSR標(biāo)記，形成了 11個(gè)鵝品種（系）DNA用三個(gè)遺傳 標(biāo)記分別PCR擴(kuò)增后的標(biāo)準(zhǔn)電泳圖譜，用于鑒別被鑒定的鵝群是否是真正的四川白鵝。中 國(guó)專利CN103484555A(公開日2014. 01. 01)公開了利用ISSR分子標(biāo)記法對(duì)甘薯品種真實(shí) 性進(jìn)行鑒別的方法，成功構(gòu)建的甘薯品種單一引物的ISSR指紋圖譜，使得甘薯品種真實(shí)性 的鑒定簡(jiǎn)便、快捷、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。中國(guó)專利CN102839219A(公開日2012. 12. 26)公 開了一種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法或其ISSR-PCR引物及試劑盒，通過提供對(duì)霍亂弧 菌流行株具有特異性分子鑒定作用的1條ISSR-PCR引物來(lái)檢測(cè)某一分離獲得的霍亂弧菌 菌株基因組DNA，進(jìn)而確定該霍亂弧菌菌株是否為流行株。中國(guó)專利CN101956016A(公開 日2011. 01. 26) -種適于水稻品種真實(shí)性鑒定的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法，提供一種快速、 準(zhǔn)確的水稻品種的ISSR指紋圖譜構(gòu)建方法或其應(yīng)用。中國(guó)專利CN103215365A(公開日 2013. 07. 24)公開了一種陸川豬或其肉制品的DNA分子鑒定方法，其中ISSR-PCR所用的引 物為麗14、麗12和麗29。最終繪制了 7張陸川豬或其肉制品的電泳圖譜，建立了陸川豬 或其肉制品的DNA指紋圖譜，可作為區(qū)分鑒定陸川豬或其肉制品的依據(jù)。
[0005] 但國(guó)內(nèi)外還未見利用分子鑒定方法鑒定梅山豬或其肉制品的方法，建立可以區(qū)分 梅山豬制品或其他品種豬肉制品的方法，以此來(lái)解決涉及梅山豬或其肉制品的假冒銷售糾 紛，從而有效保護(hù)梅山豬地方品種的市場(chǎng)地位和品牌形象。 【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0006] 本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中梅山豬或其肉制品難以鑒 定且鑒定檢測(cè)方法過于繁瑣、難以大量推廣的缺陷，提供一種梅山豬或其肉制品的基因組 分子鑒定試劑盒以快速、簡(jiǎn)便、大規(guī)模地鑒定梅山豬或其肉制品。
[0007] 本實(shí)用新型是通過下述技術(shù)方案來(lái)解決上述技術(shù)問題：
[0008] 一種梅山豬或其肉制品的基因組分子鑒定試劑盒，包括盒蓋、盒體、襯墊、裝有 ISSR-PCR反應(yīng)混合物的容器、裝有特異性擴(kuò)增梅山豬基因組的引物的容器、裝有陽(yáng)性對(duì)照 純種梅山豬基因組DNA的容器和裝有水的容器，所述襯墊設(shè)置于所述盒體內(nèi)，所述襯墊上 設(shè)有容器孔，所述的裝有ISSR-PCR反應(yīng)混合物的容器、所述裝有特異性擴(kuò)增梅山豬基因組 的引物的容器、所述裝有陽(yáng)性對(duì)照純種梅山豬基因組DNA的容器和所述裝有水的容器放置 于所述容器孔內(nèi)。
[0009] 較佳地，所述容器孔為4個(gè)，每個(gè)容器孔內(nèi)分別放置所述裝有ISSR-PCR反應(yīng)混合 物的容器、所述裝有特異性擴(kuò)增梅山豬基因組的引物的容器、所述裝有陽(yáng)性對(duì)照的容器和 所述裝有水的容器；更佳地，所述的容器孔在所述襯墊上分成兩排平行排列。
[0010] 所述的容器為本領(lǐng)域常規(guī)的容器，較佳地為離心管，更佳地為1. 5mL離心管。
[0011] 所述的ISSR-PCR反應(yīng)混合物為本領(lǐng)域常規(guī)的ISSR-PCR反應(yīng)混合物；較佳地 包括可以實(shí)行ISSR-PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液；更佳地，包括2XTaqPCR MasterMix，所述2XTaqPCRMasterMix包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、 PCR反應(yīng)的增強(qiáng)劑和優(yōu)化劑及穩(wěn)定劑。
[0012] 所述的引物為本領(lǐng)域常規(guī)的特異性擴(kuò)增梅山豬基因組所用的引物；較佳地為利用 ISSR-PCR法特異性擴(kuò)增梅山豬基因組所用的引物；更佳地，為梅山1，所述梅山1的序列為 ATGATGATGATGATGATGA〇
[0013] 所述的水為本領(lǐng)域常規(guī)的水；較佳的為去離子水；更佳地為無(wú)菌去離子水。
[0014] 較佳地，所述的基因組分子鑒定試劑盒還包括一份使用說(shuō)明書，所述的使用說(shuō)明 書記載利用ISSR-PCR反應(yīng)鑒定梅山豬或其肉制品的操作步驟。更佳地，所述的操作步驟包 括：
[0015]1)、提取生鮮肉和/或肉制品的基因組DNA;
[0016]2)、以步驟1)所述的基因組DNA為模板，利用核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示的 引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0017] 最佳地，還包括以下的步驟：
[0018]3)、構(gòu)建步驟2)所述的PCR反應(yīng)的擴(kuò)增片段的電泳圖譜；或
[0019] 4)、根據(jù)步驟3)所述的電泳圖譜，鑒定梅山豬的生鮮肉和/或肉制品。
[0020] 本實(shí)用新型的積極進(jìn)步效果在于：1、本實(shí)用新型所述的梅山豬或其肉制品的基因 組分子鑒定試劑盒利用ISSR-PCR方法操作簡(jiǎn)單快捷，能夠鑒定梅山豬或其肉制品并且將 梅山豬與其他品種豬肉的肉制品鑒定區(qū)分；2、所述試劑盒中含有純種梅山豬基因組DNA作 為陽(yáng)性對(duì)照可將待測(cè)樣品的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜與陽(yáng)性對(duì)照的電泳圖譜相比較， 結(jié)果更為可靠。故本實(shí)用新型所述的梅山豬或其肉制品的基因組分子鑒定試劑盒能夠快 速、簡(jiǎn)便、大規(guī)模地鑒定梅山豬或其肉制品。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為本實(shí)用新型實(shí)施例1~2所述的梅山豬或其肉制品的基因組分子鑒定試劑 盒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為盒蓋；2為盒體；3為裝有ISSR-PCR反應(yīng)混合物的容器、4為裝有 特異性擴(kuò)增梅山豬基因組的引物的容器、5為裝有陽(yáng)性對(duì)照純種梅山豬基因組DNA的容器、 6為裝有水的容器、7為襯墊。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面舉較佳實(shí)施例，并結(jié)合附圖來(lái)更清楚完整地說(shuō)明本實(shí)用新型。
[0023] 所述的常溫為本領(lǐng)域常規(guī)的室溫，較佳地為15~35°C。
[0024] 鑒定梅山豬或其肉制品的專用引物梅山1由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合 成，梅山 1 的序列為ATGATGATGATGATGATGA。
[0025] 梅山豬、梅杜二元雜豬樣品來(lái)源于上海市嘉定區(qū)梅山豬育