一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及雜交瘤細(xì)胞株M及其產(chǎn)生的抗納他霉素單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]納他霉素是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑，屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類。它不僅能夠抑制真菌，還能防止真菌毒素的產(chǎn)生?？蓮V泛用于食品防腐保鮮以及抗真菌治療。納他霉素對(duì)細(xì)菌沒(méi)有抑制作用，因此它不影響酸奶、奶酪、生火腿、干香腸的自然成熟過(guò)程。1982年6月，美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)納他霉素可以用作食品防腐劑。1996年，中國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)委員會(huì)正式批準(zhǔn)納他霉素可作為食品防腐劑。
[0003]目前，納他霉素的測(cè)定方法主要有生物效價(jià)法、微孔板生物檢測(cè)法、紫外分光光度計(jì)法、元素分析法、比色分析法、薄層色譜法和液相色譜法等。生物效價(jià)測(cè)定法對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素(溫度等)、材料因素(培養(yǎng)基等)、操作技術(shù)等條件要求高，操作過(guò)程也比較繁瑣；微孔板生物檢測(cè)法適用于大批量的發(fā)酵液或樣品的檢測(cè)；紫外分光光度法一般用來(lái)做納他霉素檢測(cè)的常規(guī)對(duì)照，若將其用于定量分析，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求比較高；元素分析法、比色分析法和薄層色譜法主要用于納他霉素的定性分析；高效液相色譜法(HPLC)多集中于高純度納他霉素產(chǎn)品及食品中納他霉素殘留量的檢測(cè)分析，但是這種方法的樣品前處理繁瑣、耗時(shí)、儀器貴重、需要專業(yè)人員來(lái)操作，不能實(shí)現(xiàn)大量樣品的同時(shí)檢測(cè)。因此建立一種快速、簡(jiǎn)單、高通量的納他霉素檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)是一種極為高效、靈敏的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡(jiǎn)便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。然而得到高靈敏性和高特異性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)納他霉素具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立納他霉素的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明提供一種對(duì)納他霉素具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度的單克隆抗體的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株M,已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9802。
[0007]所述雜交瘤細(xì)胞株M分泌產(chǎn)生的納他霉素單克隆抗體，它由所述的雜交瘤細(xì)胞株M所分泌產(chǎn)生。
[0008]所述的納他霉素單克隆抗體的應(yīng)用，在納他霉素分析檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0009]納他霉素單克隆抗體，是由保藏號(hào)為CGMCCN0.9802的小鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株M所分泌。
[0010]本發(fā)明提供的M細(xì)胞株的制備，基本步驟為:
(!)免疫原的合成:稱取納他霉素20mg，溶解于3mL DMF中；稱取10mg BSA，溶解于5mL PBS中；將5(^1^質(zhì)量濃度25%戊二醛溶液逐滴加入納他霉素溶液中，避光在室溫下攪拌活化30min ;將活化好的納他霉素逐滴加入BSA中，避光在室溫下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，用0.0lM PBS透析三天去除未反應(yīng)的納他霉素，得到納他霉素和BSA的偶聯(lián)物，并用紫外進(jìn)行表征。
[0011]( 2 )小鼠的免疫:納他霉素抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免疫之間間隔21天。最后一次用納他霉素(不含佐劑)沖擊免疫，通過(guò)間接ELISA檢測(cè)血清效價(jià)和抑制；
(3)細(xì)胞融合和細(xì)胞株的建立:通過(guò)聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，通過(guò)HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)有最好抑制的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株M ;
(4)雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定:通過(guò)ELISA法測(cè)定靈敏度和特異性。
[0012]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的抗納他霉素單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)納他霉素有較好的檢測(cè)靈敏度和特異性，ICJt為2.2μ g/L。
[0013]生物材料樣品保藏:一株納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株M，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱06110:，地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2014年10月15日，保藏編號(hào)為CGMCCN0.9802，分類命名為:單克隆細(xì)胞株。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1.細(xì)胞株M單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016]本發(fā)明通過(guò)將納他霉素抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對(duì)納他霉素有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0017]實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株M的制備 1、抗原的合成
稱取納他霉素20mg，溶解于3mL DMF中；稱取10mg BSA，溶解于5mL PBS中Jf50yL質(zhì)量濃度25%戊二醛溶液逐滴加入納他霉素溶液中，避光在室溫下攪拌活化30min ;將活化好的納他霉素逐滴加入BSA中，避光在室溫下攪拌反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后，用0.0lM PBS透析三天去除未反應(yīng)的納他霉素，得到納他霉素和BSA的偶聯(lián)物，并用紫外進(jìn)行表征。
[0018]2.小鼠免疫
選擇健康的6?8周齡的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。取納他霉素抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首次免疫與加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，加強(qiáng)免疫之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定小鼠血清效價(jià)和抑制，選擇效價(jià)高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0019]3.細(xì)胞融合
在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)PEG (聚乙二醇，分子量為4000)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下:(I)無(wú)菌取小鼠脾臟，研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(2)收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；(3)將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照1: 10的比例混合，離心后用50% PEG融合，時(shí)間I min，之后按照從慢到快，加入RPM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清，2%的50 XHAT的RPM1-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0020]4、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立
在細(xì)胞融合的第3天對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行RPM1-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進(jìn)行用含20%胎牛血清，1%的100 X HT的RPM1-1640過(guò)渡培養(yǎng)液進(jìn)行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步:第一步先用間接ELISA篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用納他霉素為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)三次，獲得細(xì)胞株M。
[0021]5、單克隆抗體的制備與鑒定
取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油ImL ；7天后每只小鼠腹腔注射IX16雜交瘤細(xì)胞，從第七天開(kāi)始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20°c保存；
使用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定單克隆抗體納他霉素的IC5tl分別為:2.2 μ g/L，說(shuō)明對(duì)納他霉素有很好的靈敏度，可用于納他霉素免疫分析檢測(cè)。
[0022]6.抗體應(yīng)用
將雜交瘤細(xì)胞株M通過(guò)體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于納他霉素的ELISA添加回收試驗(yàn)，具體步驟如下:
(1)包被:將包被原NATA-GA-0VA用0.05M pH 9.6碳酸鹽緩沖液從2Pg/mL開(kāi)始倍比稀釋，ΙΟΟμ?ν孔，37°C反應(yīng)2h ；
(2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
(3)封閉:拍干后，加入200μ?7孔封閉液，37°C反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
(4)加樣:將抗血清從1:1000開(kāi)始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，10PL/孔，37°C反應(yīng)Ih ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100μ?7孔，37°C反應(yīng)Ih ；
(5)顯色:將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入10PL的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng)15min ；
(6)終止和測(cè)定:每孔加入50μ?終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD45tl
值；
(7)結(jié)果判讀:以O(shè)D45tl值大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍(即Ρ/Ν彡2.1)所對(duì)應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的ELISA效價(jià)。
[0023](8)添加回收及樣品前處理:吸取ImL牛奶于15mL離心管中，向牛奶中分別添加20ng，50ng, 10ng納他霉素，用0.0lM PBS稀釋牛奶20倍，采用間接ELISA進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，其回收率分別為109%，109%，110%。
[0024]溶液的配置:
碳酸鹽緩沖液(CBS):稱取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800mL混勻，調(diào)pH值至9.6，加雙蒸水定容至lOOOmL，4°C貯存?zhèn)溆茫?br>磷酸鹽緩沖液(PBS):8.0Og NaCl, 0.2g KCl, 0.2g KH2PO4, 2.9 g Na2HPO412 H2O,溶于800mL純水中，用NaOH或HCl調(diào)pH到7.2?7.4，定容至1000 mL ；
PBST:含 0.05% 吐溫 20 的 PBS ；
TMB 顯色液:A液:Na2HP0412H20 18.43g，檸檬酸 9.33g，純水定容至 1000 mL ;B 液:60mgTMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按體積比1: 5混合即為T(mén)MB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0025]綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用來(lái)限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。即凡依本發(fā)明專利申請(qǐng)范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株M，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.9802。
2.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株M分泌產(chǎn)生的納他霉素單克隆抗體，其特征在于:它由所述的雜交瘤細(xì)胞株M所分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的納他霉素單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于在納他霉素分析檢測(cè)中的應(yīng)用。
【專利摘要】一株抗納他霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將納他霉素完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過(guò)背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后免疫都用不完全弗氏佐劑。將高效價(jià)低IC50的小鼠的脾細(xì)胞通過(guò)PEG方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA篩選和三次亞克隆，得到一株雜交瘤（單克隆）細(xì)胞株。此（單克隆）細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，對(duì)納他霉素具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度（IC50值為2.2μg/L），可以用于食品安全中納他霉素的殘留檢測(cè)。CGMCC No.980220141015
【IPC分類】C12N5-20, C07K16-44, G01N33-577
【公開(kāi)號(hào)】CN104560886
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410814893
【發(fā)明人】劉麗強(qiáng), 陳燕妮, 胥傳來(lái), 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 宋珊珊, 吳曉玲
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月25日