一種褐潮藻種檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藻類檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種褐潮藻種檢測(cè)方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐潮藻種Aureococcus anophagefferens在分類學(xué)上屬于原生藻菌門 (Stramenopiles)、浮生藻綱（Pelagophyceae)。自2009年開始，我國(guó)秦皇島近岸海域出現(xiàn) 了由 Aureococcus anophagefferens (簡(jiǎn)寫為 A. anophagefferens)引發(fā)的有害赤潮--褐 潮，給北戴河濱海旅游業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖造成極為嚴(yán)重的影響。對(duì)于我國(guó)而言，褐潮是一種新型 生態(tài)災(zāi)害，其原因種A. anophagefferens的藻細(xì)胞不僅太?。s3 μπι)，而且沒有明顯的形 態(tài)特征，采用在顯微鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)的傳統(tǒng)方法進(jìn)行物種鑒定非常困難，急需找到一 種快速有效的定性定量檢測(cè)技術(shù)，為監(jiān)測(cè)褐潮的發(fā)生和發(fā)展過程、及時(shí)預(yù)防褐潮暴發(fā)所帶 來的危害提供技術(shù)支持。目前分子探針技術(shù)是對(duì)藻類種群動(dòng)態(tài)進(jìn)行直接監(jiān)測(cè)的主要發(fā)展 方向，而大量、連續(xù)甚至實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)目標(biāo)藻類種群動(dòng)態(tài)變化過程，是開展有害褐潮暴發(fā)機(jī) 理、預(yù)防褐潮暴發(fā)研宄的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，鑒于傳統(tǒng)方法鑒定褐潮藻種比較困難，提供一種 定性、定量的褐潮藻種檢測(cè)方法，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、連續(xù)可測(cè)、操作簡(jiǎn)便、易于控制、 分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0005] 一種褐潮藻種檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0006] 1)設(shè)計(jì)并合成特異引物和探針：
[0007] 采用序列比對(duì)軟件（如ClustalW)比對(duì)A. anophagefferens和GenBank中與其親 緣關(guān)系較近的藻種（如Aureoumbra Iagunensis和Pelagococcus subviridis)的 18S rDNA 序列，設(shè)計(jì)A. anophagefferens的特異性引物AanF、AanR和探針Aan probe，進(jìn)行合成；
[0008] 所述引物 AanF 具有如 SEQ ID NO. 1 所示的序列：AAAGCTCGTAGTTGGATTCCTGG ;
[0009] 所述引物 AanR 具有如 SEQ ID NO. 2 所示的序列：GTGTTCAACGCAGGCTTACG ;
[0010] 所述探針 Aan probe 具有如 SEQ ID NO. 3 所示的序列：CTTGCGATGGTCTATCCT ;
[0011] 2)構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：
[0012] a)選擇標(biāo)準(zhǔn)品藻株：由于目前我國(guó)褐潮暴發(fā)藻種還未實(shí)現(xiàn)室內(nèi)純化培養(yǎng)，因 此選擇A. anophagefferens (CCMP1784)藻株作為標(biāo)準(zhǔn)品藻株，所述標(biāo)準(zhǔn)品藻株購(gòu)自 NCMA (National Center for Marine Algae and Microbiota)，經(jīng)檢測(cè)與我國(guó)褐潮原因種具 高度同源性（同源性可以達(dá)到99.7%)，接種，采用（f/2+Si)培養(yǎng)液培養(yǎng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)品藻株 培養(yǎng)液；
[0013] b)利用顯微鏡檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品藻株培養(yǎng)液的藻細(xì)胞數(shù)，利用0. 45 μ m濾膜過濾，收集 藻細(xì)胞，將帶有藻細(xì)胞的濾膜_20°C保存；
[0014] c)將步驟b)所述濾膜上的藻細(xì)胞提取DNA，并利用引物SSU-F (如SEQ ID NO. 4 所示）和SSU-R (如SEQ ID NO. 5所示）PCR擴(kuò)增后測(cè)序驗(yàn)證，當(dāng)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列一致 后，即為藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液；
[0015] d)以步驟c)得到的藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液為模板，利用引物AanF和引物AanR 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，并純化，得到純化產(chǎn)物；將純化后的PCR產(chǎn)物采用TaKaRa pMD?18-T Vector Cloning Kit進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化克隆，提取質(zhì)粒并測(cè)序，比對(duì)序列，與預(yù)期序 列一致說明結(jié)果正確，得到的質(zhì)粒即為重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0016] 3)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0017] a)選取步驟2)獲得的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，利用Nanodrop 2000測(cè)定其質(zhì)量濃度，根 據(jù)質(zhì)粒濃度與拷貝數(shù)換算公式：拷貝數(shù)濃度=(質(zhì)量濃度X 1〇_9Χ6. 02X 1023V(堿基對(duì) 數(shù)X 660)，計(jì)算獲得質(zhì)?？截悢?shù)濃度（copies/μ L)，將其按照10倍梯度系列稀釋；
[0018] 取至少5個(gè)梯度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度樣品一式三份，作為熒光定量PCR擴(kuò) 增的模板，利用引物AanF、AanR和探針Aan probe進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到Ct值；將質(zhì) 粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值（以10為底）與相應(yīng)Ct值進(jìn)行線性回歸分析，最終獲得重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 品的Ct-質(zhì)粒拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0019] b)選取步驟2)得到的已知A. anophagefferens藻細(xì)胞數(shù)量的藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA 提取液，進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，取至少5個(gè)梯度的藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液模板作為模 板，每個(gè)濃度樣品一式三份，用AanF、AanR和探針Aan probe進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到 Ct值；將藻細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)值（以10為底）與相應(yīng)Ct值進(jìn)行線性回歸分析，得到藻細(xì)胞標(biāo) 準(zhǔn)品DNA提取液的Ct-藻細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0020] c)通過步驟a)中得到的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線和步驟b)中得到的藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)、藻細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)（以10為底）為縱坐標(biāo)，得到質(zhì)?？截悢?shù)-藻細(xì)胞 數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0021] 4)引物和探針特異性驗(yàn)證：分別提取中肋骨條藻、三角褐指藻、海洋小球藻和海 洋原甲藻中的DNA，分別以雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小 球藻DNA提取液和海洋原甲藻DNA提取液為陰性對(duì)照，以引物AanF、引物AanR和探針Aan Probe進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，當(dāng)檢測(cè)不到擴(kuò)增曲線時(shí)，說明所用引物和探針不能用于這些 樣品的檢測(cè)，進(jìn)一步說明所述引物和探針為褐潮藻種的特異性引物和探針
[0022] 5)檢測(cè)樣品和結(jié)果分析：
[0023] a)提取待測(cè)樣品DNA :采集表層水樣，記錄待測(cè)樣品的體積，每個(gè)站位取至少3個(gè) 平行樣，立即用〇. 45 μ m濾膜過濾，藻細(xì)胞被濾膜收集，帶有藻細(xì)胞的濾膜-20°c保存；提取 濾膜上的藻細(xì)胞中的DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分裝，保存，作為未知待測(cè)樣品DNA提 取液；
[0024] b)步驟a)得到的未知待測(cè)DNA提取液為模板，利用引物AanF、AanR和探針Aan probe進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到Ct值，根據(jù)步驟3)得到的Ct-質(zhì)粒拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、 Ct-藻細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)?？截悢?shù)-藻細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中的藻細(xì)胞數(shù)，除 以待測(cè)樣品的體積，得到藻細(xì)胞密度。
[0025] 本發(fā)明所述的DNA提取方法可以采用常規(guī)的DNA提取方法，也可以采用市售的試 劑盒進(jìn)行提取，如本發(fā)明所述的實(shí)施例中利用土壤DNA提取試劑盒UltraClean? Soil DNA Isolation Kit (Mo Bio Laboratories, Inc.，Solana Beach, California, USA)提取 DNA〇
[0026] 本發(fā)明所述的藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液和重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可以在_80°C下長(zhǎng)期保 存（一年以內(nèi)），保存時(shí)間超過1年后，為了保證檢測(cè)結(jié)果的精確性，藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取 液和重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建議重新提取A. anophagefferens的DNA和構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。
[0027] 一種利用上述褐潮藻種檢測(cè)方法制備的褐潮藻種檢測(cè)試劑盒，包括：重組質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)品、藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液、引物AanF、引物AanR、探針Aan prob e、陰性對(duì)照、焚光定量 PCR擴(kuò)增試劑。
[0028] 所述熒光定量 PCR 擴(kuò)增試劑包括：2XPROBE FAST qPCR Master Mix Universal、 ROX校正染料、PCR級(jí)無菌水，所述熒光定量PCR擴(kuò)增試劑均為市售。
[0029] 所述陰性對(duì)照為雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小 球藻DNA提取液和海洋原甲藻DNA提取液。
[0030] 本發(fā)明的有益效果是：
[0031] 本發(fā)明所述的褐潮藻種檢測(cè)方法是一種針對(duì)褐潮藻種的快速、有效的檢測(cè)技術(shù)， 既可以用于定性檢測(cè)，也可以用于定量檢測(cè)；為監(jiān)測(cè)褐潮的發(fā)生和發(fā)展過程、及時(shí)預(yù)防褐潮 暴發(fā)所帶來的危害提供技術(shù)支持；通過分子探針技術(shù)對(duì)藻類種群動(dòng)態(tài)進(jìn)行直接監(jiān)測(cè)，可以 大量、連續(xù)甚至實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)目標(biāo)藻類種群動(dòng)態(tài)變化過程，是開展有害褐潮暴發(fā)機(jī)理、預(yù)防 褐潮暴發(fā)研宄的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的褐潮藻種檢測(cè)方法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、連續(xù)可 測(cè)、操作簡(jiǎn)便、易于控制、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明所述的特異性引物和探針具有良好的 特異性。
[0032] 另外，本發(fā)明所述的褐潮藻種檢測(cè)方法還具備如下優(yōu)勢(shì)：A. anophagefferens的 藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液和制作好的A. anophagefferens重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品保存在-80°C下， 可以長(zhǎng)期保存。因此不需要每次測(cè)定樣品都需要提取藻細(xì)胞DNA和構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品， 只需要利用已構(gòu)建好的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成質(zhì) ?？截悢?shù)-藻細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，使檢測(cè)步驟更為簡(jiǎn)潔，檢測(cè)時(shí)間短。
[0033] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步根據(jù)本發(fā)明所述的 褐潮藻種檢測(cè)方法，將本發(fā)明所述的特異性引物AanF、AanR和探針Aan probe試劑、藻細(xì) 胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液、重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等試劑組裝成試劑盒，以檢測(cè)試劑盒的形式提供，方 便、快捷的用于褐潮藻種的定性、定量檢測(cè)。
【附圖說明】
[0034] 圖1為倒置顯微鏡下的A. anophagefferens藻細(xì)胞；
[0035] 圖2為A. anophagefferens重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增圖；
[0036] 圖3為A. anophagefferens重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品Ct-質(zhì)粒拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0037] 圖4為A. anophagefferens藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液擴(kuò)增圖；
[0038] 圖5為A. anophagefferens藻細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品DNA提取液的Ct-藻細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0039] 圖6為雙蒸水、中肋骨條藻DNA提取液、三角褐指藻DNA提取液、海洋小球藻DNA 提取液、海洋原甲藻DNA提取液的熒光定量PCR結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0041] 一種褐潮藻種檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0042] 1)設(shè)計(jì)并合成特異引物和探針：
[0043] 采用ClustalW軟件比對(duì)A. anophagefferens和GenBank中與其親緣關(guān)系較近的 藻種（如 Aureoumbra Iagunensis 和 Pelagococcus subviridis)的 18S rDNA 序列，設(shè)計(jì) A. anophageff