用于產(chǎn)生具有物種間、靶標內(nèi)交叉反應性之抗體分子的方法
【專利說明】用于產(chǎn)生具有物種間、靶標內(nèi)交叉反應性之抗體分子的方 法
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般性涉及采用抗體鏈改組來產(chǎn)生具有物種間、靶標內(nèi)交叉反應性之抗體 的方法。
[0004] 2.相關(guān)領(lǐng)域描述
[0005]用于設(shè)計和產(chǎn)生抗體，特別是單克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域中已有描述?？梢詫?克隆抗體設(shè)計成選擇性地與特定抗原結(jié)合。這樣的抗體可用于利用抗體的結(jié)合親和力和選 擇性的診斷和/或治療方法中。
[0006] Dreier等的美國專利申請公開2011/0300140公開了用于產(chǎn)生駱駝科動物 (camelid)來源的常規(guī)抗體的方法，所述方法包括用抗原來免疫駱駝科動物物種，例如大羊 馬它（llama)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別是完全遠交（outbred)的駱蛇科動物物種產(chǎn)生穩(wěn)?。╮obust) 的免疫應答，產(chǎn)生靶標特異性抗體的多樣性文庫，所述靶標特異性抗體的特征在于對靶抗 原的高親和力。
[0007] 此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)常規(guī)駱駝科動物抗體擁有這樣的可變結(jié)構(gòu)域，所述可變結(jié)構(gòu)域與 人種系抗體的相應可變結(jié)構(gòu)域具有出乎意料的高序列同源性。而且，駱駝科動物抗體與人 抗體具有出乎意料的高結(jié)構(gòu)相似性。因此，駱駝科動物抗體需要很少的突變即可將可變結(jié) 構(gòu)域的人特征升高至這樣的水平，其中免疫原性的水平為可接受的低。這些很少的突變對 抗體針對靶標的親和力具有很小的作用或沒有作用。
[0008] Dreier等的美國專利申請公開2011/0165621公開了用于人源化駱駝科動物來源 的抗體的方案。
[0009] 已經(jīng)開發(fā)出若干技術(shù)來模擬存在于活動物之免疫應答中的親和力成熟。一旦將 這樣的技術(shù)稱為"鏈改組"，早就認識到鏈改組作為用于從抗體之重鏈或輕鏈的文庫中產(chǎn)生 新抗體的手段，所述抗體在例如初次免疫應答中獲得?？墒褂煤Y選方法來針對親和力和選 擇性對鏈改組方案中獲得的抗體進行選擇。以這樣的方式，可產(chǎn)生具有與親本抗體相比更 高親和力和/或祀標選擇性的抗體。參見，例如，Kang等，"Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries"Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88(1991)，11120-11123。還可以將鏈改組用于通過表位印跡（imprinting)的抗 體人源化。
[0010] 為了在人類中的診斷和/或治療用途，正開發(fā)大量抗體。因此，可針對這些抗體與 人抗原結(jié)合的能力來產(chǎn)生和篩選這樣的抗體。對于這樣的抗體在實驗室環(huán)境中的測試，高 度期望這樣的抗體還與在非人動物物種（特別是在實驗室實踐中常用的動物物種，例如嚙 齒類動物，特別是小鼠）中存在的相應抗原結(jié)合。
[0011] 因此，需要用于產(chǎn)生具有物種間、靶標內(nèi)交叉反應性之抗體分子的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明通過提供用于產(chǎn)生具有物種間、靶標內(nèi)交叉反應性之抗體分子的方法而解 決了該需求，所述方法包括以下步驟：
[0013] a.產(chǎn)生對來自第一物種的靶抗原具有特異性的第一免疫文庫；
[0014] b.在鏈改組方案中組合來自所述第一免疫文庫的可變區(qū)以產(chǎn)生第二免疫文庫；
[0015] c.在所述第二免疫文庫中鑒定與所述靶標抗原和來自第二物種的相應抗原反應 的抗體分子；
[0016] 其中所述第二物種不同于所述第一物種。
[0017] 在一個優(yōu)選的實施方案中，第一物種是人，并且第一免疫文庫是針對人抗原建立 的。在該優(yōu)選的實施方案中，第二物種是非人動物，優(yōu)選為常用的實驗室動物，例如小鼠。
[0018] 本發(fā)明的另一個方面是具有物種間、靶標內(nèi)交叉反應性的抗體分子。
[0019] 發(fā)明詳述
[0020] 以下是本發(fā)明的詳細描述。
[0021] 定義
[0022] 術(shù)語"抗體"、"抗原"、"靶抗原"、"特異性"、"親和力"、"駱駝科動物物種"、"VL結(jié)構(gòu) 域"、" VH結(jié)構(gòu)域"、"可變結(jié)構(gòu)域"、" L1"、" L2 "、" L3 "、"ΗΓ'、"H2 "、"H3 "、"框架區(qū)"、"恒定結(jié) 構(gòu)域"和"高變環(huán)"以及本文中使用的其他特定術(shù)語如在Dreier等的美國專利申請公開號 2011/0300140中所定義，所述專利的公開內(nèi)容通過引用并入本文。術(shù)語"抗體分子"是指與 靶抗原免疫反應和/或表現(xiàn)出與靶抗原特異性結(jié)合的包含VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域的任何多 肽。實例包括抗體、免疫球蛋白和抗體片段。
[0023] 本文使用的術(shù)語"免疫文庫"是指抗體分子的集合?？赏ㄟ^合適的載體（例如噬菌 體、質(zhì)?；蚓］d體）來展示抗體分子。在J. Brichta等，Vet. Med.-Czech，50, 2005 (6): 231-252中綜述了用于建立免疫文庫的技術(shù)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。
[0024] 本文使用的術(shù)語"鏈改組"是指這樣的技術(shù)，其用于通過提供來自文庫的抗體片 段來增加抗體文庫的多樣性；在展示工具（例如噬菌體展示）中表達所述片段；以及將所 表達的片段重組到抗體分子中?？舍槍εc靶抗原X的結(jié)合，針對相對缺乏的與競爭抗原 (rival antigen)Y的不期望結(jié)合，或者兩者來篩選所得的抗體分子。鏈改組是用于產(chǎn)生對 靶標具有更高親和力或者更高結(jié)合特異性或者兩者之抗體的通常使用的技術(shù)。還可將鏈改 組用作獲得自非人物種（例如小鼠）之抗體的人源化方案。在Kang等，"Antibody redesign by chain shuffling from random combinatorial immunoglobulin libraries"Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991) ,11120-11123中討論了鏈改組技術(shù)，其公開內(nèi)容通過引用并 入本文。
[0025] 可用任何類型的抗體片段來進行鏈改組，所述抗體片段例如高變環(huán)、互補決定區(qū) (CDR)、輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈可變結(jié)構(gòu)域等。例如，可用一條重鏈來改組輕鏈文庫，或者可 用一條輕鏈來改組重鏈文庫。
[0026] 術(shù)語"交叉反應性（cross-reactivity) "通常用來描述抗體分子與抗原之間的非 特異性結(jié)合。例如，設(shè)計為與抗原X結(jié)合的抗體X還可表現(xiàn)出與抗原Y結(jié)合。則認為抗體X 與抗原Y交叉反應。如果抗原X和抗原Y是來自相同物種的抗原，那么這種類型的交叉反 應性可稱為"靶標間、物種內(nèi)"交叉反應性。術(shù)語"靶標間"是指與不同靶標的交叉反應性。 術(shù)語"物種內(nèi)"是指靶標或抗原來自相同物種。這種類型的交叉反應性通常是不期望的，因 為非預期的與抗原Y結(jié)合有損于并且可干擾與抗原X的期望結(jié)合。此外，非預期的與抗原 Y結(jié)合可干擾抗原Y的正常功能，因此引起不期望的副作用。
[0027] 當設(shè)計為與第一物種的抗原X(例如人X或hX)結(jié)合的抗體還與第二物種的抗原 Y(例如鼠Y或mY)結(jié)合時存在交叉反應性的另一種形式。可將其適當?shù)胤Q為"靶標間、物 種間交叉反應性"。這種類型的交叉反應性可具有令人感興趣的科學意義，并且可用于例如 表位作圖但是在其他方面沒有很大價值。
[0028] 當設(shè)計為與第一物種的抗原X (例如人X，或hX)結(jié)合的抗體還與第二物種的相應 抗原X (例如鼠X，或mX)結(jié)合時存在交叉反應性的又一種形式?？蓪⑵溥m當?shù)貥俗?物 種間、靶標內(nèi)交叉反應性"。這種類型的交叉反應性有很大的實踐價值，因為其允許使用第 二物種（在該實例中為小鼠）在為人治療和/或診斷用途所開發(fā)之抗體的研宄中作為動物 模型。
[0029] 實際上，基于在靶標親和力和特異性方面所期望的特性來篩選和選擇抗體。所選 擇的候選者是否具有期望的物種間、靶標內(nèi)交叉反應性本質(zhì)上要看運氣（the luck of the draw)。迄今為止，認為不存在將這種類型的交叉反應性改造到抗體分子中的方法。
[0030] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可使用鏈改組來產(chǎn)生具有特異性期望之物種間、靶標內(nèi)交叉反應性 的抗體分子。因此，在其最一般的范圍內(nèi)，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生具有物種間、靶標內(nèi)交叉反 應性之抗體分子的方法，所述方法包括以下步驟：
[0031] a.建立對來自第一物種的靶抗原具有特異性的第一免疫文庫；
[0032] b.在鏈改組方案中組合來自所述第一免疫文庫的可變區(qū)以產(chǎn)生第二免疫文庫；
[0033] c.在所述第二免疫文庫中鑒定與所述靶抗原和來自第二物種的相應抗原反應的 抗體分子；
[0034] 其中所述第二物種不同于所述第一物種。
[0035] 可通過任何合適的方法來確認來自第二文庫的抗體是否與靶抗原和來自第二物 種的相應抗原反應，所述任何合適的方法包括直接方法（例如結(jié)合測定），或者用于測試結(jié) 合相關(guān)功能性的間接方法。
[0036] 應理解的是，第一物種通常是產(chǎn)生抗體分子的物種。在許多情況下，該物種將是 人，但是原則上所述第一物種可以是將會受益于抗體分子有效性的任何物種，例如飼養(yǎng)和 伴侶動物等。為了本文件的目的，第一物種將假定為人，但是讀者應記住這無意于進行限 制。
[0037] 可以以任何合適的方式從第一物種中獲得第一免疫文庫。例如，免疫文庫可以是 獲得自一名或更多名健康志愿者的原初文庫（nalfve library);或者其可以獲得自以天然 方式用靶抗原感染的供體。如果第一物種是人，則通常倫理上不可能從用靶抗原有意感染 的供體建立第一免疫文庫。
[0038] 在一個替代實施方案中，第一免疫文庫獲得自用靶抗原所免疫之第三物種的動 物。第三物種可與第一物種相同或不同。如果第一物種是人，那么第三物種通常不同于第 一物種。例如，第三物種可以是駱駝科（Camelidae)的成員或駱駝科動物。在一個優(yōu)選的 實施方案中，第三物種是大羊駝。
[0039] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，駱駝科動物特別適于產(chǎn)生第一免疫文庫，原因很多。人靶抗原通常在駱 駝科動物中引起強大的免疫應答。此外，完全遠交的駱駝科動物可容易地用于免疫；使用 完全遠交的動物有助于建立高度多樣性的免疫文庫。如之前所報道，獲得自駱駝科動物物 種的抗體的可變結(jié)構(gòu)域與相應人可變結(jié)構(gòu)域具有高度的序列同源性，以及高度的結(jié)構(gòu)同源 性。因此，這樣的抗體需要很少的突變或者不需要突變來降低其免疫原性，使得很少存在損 失對人靶標的高度親和力的風險。
[0040] 特別地，獲得自駱駝科動物的免疫文庫的高多樣性顯著地提高了通過本發(fā)明的方 法成功建立交叉反應性的概率。
[0041] 以本領(lǐng)域已知的任何方法來產(chǎn)生和選擇第一免疫文庫的抗體。例如，從供體動物 收獲成熟B細胞；收集并表達RNA ;針對與靶抗原的親和力來篩選抗體片段；對所選擇的抗 體進行測序和擴增。另一些方法包括使用雜交瘤技術(shù)和克?。籅細胞分選和轉(zhuǎn)染等。
[0042] 第一免疫文庫可具有任何合適的形式。例如，第一免疫文庫可以為來自第一免疫 文庫的抗體之可變區(qū)的一個或更多個噬菌體展示文庫的形式。例如，這些可變區(qū)可以是輕 鏈和重鏈。
[0043] 可使用任何鏈改組方案來產(chǎn)生第二免疫文庫。應理解的是，盡管所述方法的