一種制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物芽孢誘導(dǎo)領(lǐng)域，具體涉及一種制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的 方法，特別涉及一種可用于大規(guī)模生產(chǎn)的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗜熱脂肪芽孢桿菌為革蘭陽性菌，需氧或兼性厭氧，利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。嗜熱 脂肪芽孢桿菌可產(chǎn)芽孢，最佳生長溫度為55-60°C，最高生長溫度為65-75°C，屬于嗜熱菌。 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC)收藏編號為CICC:10267,即ATCC:7953。
[0003] 嗜熱脂肪芽孢桿菌所產(chǎn)芽孢無致病性、無熱原、無毒。其芽孢對一定滅菌因子有 確定的抗力，尤其對壓力蒸汽的抗力強于大多數(shù)微生物，因此在我國，歐洲，美國，日本等地 作為熱力滅菌生物指示劑的標準菌株。嗜熱脂肪芽孢桿菌含有多種抗藥性隱蔽質(zhì)粒，因此 在國標GB/T4789. 27-2008中規(guī)定了運用嗜熱脂肪芽孢桿菌抑制法檢測鮮乳中的抗生素含 量。嗜熱脂肪芽孢桿菌及抗生素殘留檢測方法（專利號：2009100662870,公開了一種利用 嗜熱脂肪芽孢桿菌檢測抗生素的方法）。嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢因其特性，在消毒檢驗監(jiān) 測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。因此對芽孢生成機理及誘導(dǎo)條件等方面的工作需要繼續(xù)深入。
[0004]目前，現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)可以實現(xiàn)對嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢進行小劑量的制備， 但在大規(guī)模量產(chǎn)時，卻存在許多技術(shù)障礙：1)如何在固態(tài)的培養(yǎng)基上簡便高效地刮取大量 的高活性高產(chǎn)率的菌株；2)如何開發(fā)出一款成本低廉，適合大批量生產(chǎn)的誘導(dǎo)產(chǎn)孢培養(yǎng) 基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述不足之處，本發(fā)明的目的是提出一種成本低廉，操作簡便，可大規(guī)模制備 嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0007] 一種制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟1)菌種活化：以嗜熱脂肪地芽孢桿菌為菌種，將菌種接種于活化培養(yǎng)基表 面，在50?60°C下培養(yǎng)12?24h后，所述菌種長出菌苔；所述活化培養(yǎng)基由以下重量份的 材料組成：1〇重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的 氯化鈉、15重量份的瓊脂和1000重量份的蒸餾水；
[0009] 步驟2)菌體增殖：將含所述菌苔的活化培養(yǎng)基加入到增殖培養(yǎng)基中，在50? 60°C環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100?250rpm/min條件下培養(yǎng)12h ;所述增殖培養(yǎng)基由以下重量份的材 料組成：5?10重量份的胰蛋白胨、5?10重量份的大豆蛋白胨、5?10重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的氯化鈉和1000重量份的蒸餾水；
[0010] 步驟3)菌體篩選：在無菌平皿中加入篩選培養(yǎng)基，并在篩選培養(yǎng)基的表面覆蓋無 菌濾紙1?5張，將步驟2)所得菌液加到無菌濾紙上，在50?60°C下培養(yǎng)24h;所述篩選培 養(yǎng)基由以下重量份的材料組成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、1? 5重量份的牛肉浸膏、0. 01?0. 1重量份的KH2P04、0. 1?1重量份的MnS04 ?H20、0. 1?1 重量份的MgS04 ? 2H20、0. 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、10?20重量份的瓊脂和1000重量 份的蒸餾水；
[0011] 步驟4)芽孢誘導(dǎo)：將步驟3)中的無菌濾紙放入產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，在50?60°C環(huán)境 中，轉(zhuǎn)速100?200rpm/min條件下培養(yǎng)12h后，改變溫度至30?50°C，繼續(xù)培養(yǎng)12h，得到 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢；所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基由以下重量份的材料組成：1?5重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的酵母提取物、0. 01?0. 1重量份的NaCl、0. 1?1重量份的MnS04 ?H20、 〇? 1?1重量份的MgS04.21120、0. 01?1重量份的CaCl2 .2H20、5?10重量份的PEG6000、 0. 5?5重量份的瓊脂和1000重量份的蒸餾水。
[0012] 優(yōu)選的是，所述的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，在所述活化培養(yǎng)基、增殖 培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基中用HC1或NaOH調(diào)節(jié)pH在7. 0?7. 3之間。
[0013] 優(yōu)選的是，所述的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，所述增殖培養(yǎng)基由以下 重量份的材料組成5重量份的胰蛋白胨、7. 5重量份的大豆蛋白胨、7. 5重量份的酪蛋白 胨、3重量份的氯化鈉和1000重量份的蒸餾水。
[0014] 優(yōu)選的是，所述的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，所述篩選培養(yǎng)基由以下 重量份的材料組成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、 0. 05重量份的KH2P04、0. 5重量份的MnS04 ?H20、0. 5重量份的MgS04 ? 2H20、0. 5重量份的 CaCl2 ? 2H20、15重量份的瓊脂和1000重量份的蒸餾水。
[0015] 優(yōu)選的是，所述的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基由以下 重量份的材料組成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0. 05重量份的NaCl、0. 5 重量份的MnS04 ?H20、0. 5重量份的MgS04 ? 2H20、0. 5重量份的CaCl2 ? 2H20、7. 5重量份的 PEG6000、2. 5重量份的瓊脂和1000重量份的蒸餾水。
[0016] 優(yōu)選的是，所述的制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，在步驟3)中無菌濾紙的 數(shù)量為5張，且選取第三張或第四張濾紙放入步驟4)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基中。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過改進培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)條件，可在短時間內(nèi) 大批量制備芽孢，且培養(yǎng)基成分廉價易得，工藝條件簡單、生產(chǎn)周期短，整個制備工藝一個 批次耗時在90小時內(nèi)，本案提供了一種簡單的培養(yǎng)方法和工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)的路線，它誘導(dǎo) 生產(chǎn)的芽孢純度高，含量可達1X109個/mL，芽孢轉(zhuǎn)化率大于98%。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書 文字能夠據(jù)以實施。
[0019] 本案提出一種制備嗜熱脂肪芽孢桿菌的芽孢的方法，包括以下步驟：
[0020] 步驟1)菌種活化：以嗜熱脂肪地芽孢桿菌為菌種，將菌種接種于活化培養(yǎng)基表 面，在50?60°C下培養(yǎng)12?24h后，此時菌種長出菌苔；活化培養(yǎng)基由以下重量份的材料 組成：1〇重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化 鈉、15重量份的瓊脂和1000重量份的蒸餾水；
[0021] 步驟2)菌體增殖：將上步得到的含菌苔的活化培養(yǎng)基加入到增殖培養(yǎng)基中，在 50?60°C環(huán)境中，轉(zhuǎn)速100?250rpm/min條件下培養(yǎng)12h;增殖培養(yǎng)基由以下重量份的材 料組成：5?10重量份的胰蛋白胨、5?10重量份的大豆蛋白胨、5?10重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的氯化鈉和1000重量份的蒸餾水；
[0022] 步驟3)菌體篩選：在無菌平皿中加入篩選培養(yǎng)基，并在篩選培養(yǎng)基的表面覆蓋無 菌濾紙1?5張，將步驟2)所得菌液加到無菌濾紙上，在50?60°C下培養(yǎng)24h;篩選培養(yǎng) 基由以下重量份的材料組成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、1?5 重量份的牛肉浸膏、〇. 01?〇. 1重量份的KH2P04、0. 1?1重量份的MnS04，H20、0. 1?1重 量份的MgS04 ? 2H20、0. 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、10?20重量份的瓊脂和1000重量份 的蒸餾水；
[0023] 步驟4)芽孢誘導(dǎo)：將步驟3)中的無菌濾紙放入產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，在50?60°C環(huán)境 中，轉(zhuǎn)速100?200rpm/min條件下培養(yǎng)12h后，改變溫度至30?50°C，使其在低溫下能夠 形成休眠體，以提高芽孢轉(zhuǎn)化的速率，繼續(xù)培養(yǎng)12h，最終得到嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢；產(chǎn) 孢培養(yǎng)基由以下重量份的材料組成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、 0? 01?0? 1重量份的NaCl、0. 1?1重量份的MnS04 ?H20、0. 1?1重量份的MgS04 ? 2H20、 0? 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、5?10重量份的PEG6000、0. 5?5重量份的瓊脂和1000 重量份的蒸餾水。
[0024] 芽孢的培養(yǎng)對培養(yǎng)體系的pH值有較嚴格的要求，因此在活化培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng) 基、篩選培養(yǎng)基和產(chǎn)孢培養(yǎng)基中，它們的pH值應(yīng)被限制，可用HC1或NaOH調(diào)節(jié)使其pH穩(wěn)定 在7. 0?7. 3之間。
[0025] 本方法中所用的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物和牛肉浸膏均是市 售的成熟商品，它們具有多種購買渠道，且都具有清楚明確的成分組成。其中，胰蛋白胨的 CAS號為91079-40-2,可購自Sigma-Aldrich試劑公司，產(chǎn)品編號17293。大豆蛋白胨的 CAS號為91079-46-8,