專利名稱：嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物菌株，尤其涉及一種嗜熱脫氮芽孢桿菌G1788及其篩選和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在微生物應(yīng)用工程中微生物采油是一個新興的具有重大應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值的領(lǐng)域。一個油田經(jīng)過一次和二次采油后，仍有60-65％的原油采不出來。油田經(jīng)過多年的注水開發(fā)后將進入高含水期，面臨開采難度大，成本高，采收率低等難題(例如我國東部的主要油田)。常用來解決此問題的熱力驅(qū)，化學驅(qū)和混相驅(qū)等三次采油法雖然有一定作用，但各有其嚴重的缺點。熱力驅(qū)的熱能利用率低；化學驅(qū)和混相驅(qū)所注入的化學物質(zhì)殘留地層時間長，破壞地層，污染環(huán)境，同時地上設(shè)備要求復(fù)雜。微生物采油是生物工程技術(shù)在油田開發(fā)領(lǐng)域的開拓性應(yīng)用，具有成本低，適應(yīng)性強，作業(yè)簡單，對地層無傷害和沒有污染等優(yōu)勢，在世界上引起廣泛的重視，作為第四種獨具優(yōu)勢的三次采油技術(shù)，成為石油開采技術(shù)中研究和實踐的熱點和前沿。
微生物采油是與微生物有關(guān)的提高采收率技術(shù)方法的總稱，即利用微生物提高石油采收率的技術(shù)。其基本技術(shù)方法分為兩大類一類是地面發(fā)酵法；另一類是地下發(fā)酵法，即將油藏作為巨大的生物反應(yīng)器，讓微生物在地下發(fā)酵。地下發(fā)酵法又分兩類一類是針對油藏原有的微生物，選擇合適的營養(yǎng)物質(zhì)注入地層，激活原有的微生物；一類是針對油藏特點，篩選出合適的微生物菌種，經(jīng)培養(yǎng)和發(fā)酵連同營養(yǎng)物一起注入地層，本發(fā)明即是這一類技術(shù)中篩選到的優(yōu)良菌種。按照作業(yè)方式，注入微生物和營養(yǎng)物的微生物采油方法可分為四類(1)周期性注入微生物采油(又稱單井吞吐)，(2)微生物驅(qū)油，(3)選擇性封堵，(4)微生物清防蠟處理。其中微生物提高采油率技術(shù)主要指微生物驅(qū)油，即將細菌和營養(yǎng)物由注水井注入目的地層，經(jīng)微生物的代謝作用于油層，使原油流動性提高，易于采出。
微生物采油的機理十分復(fù)雜，目前的研究普遍認為有幾種機制可以解釋微生物采油。(1)微生物可將重質(zhì)油分解為輕質(zhì)油或其它產(chǎn)物，從而降低原油粘度，增加其流動性。(2)微生物在油藏內(nèi)代謝活動產(chǎn)生的CO2和CH4等氣體可以提高油層內(nèi)部的壓力，促進原來不連續(xù)的原油區(qū)粘連成片，便于開采。(3)微生物能夠產(chǎn)生多種表面活性劑(如脂肪酸，脂多糖和葡聚糖等)，降低石油與巖石之間的表面張力，改善石油的流動性能，提高水驅(qū)的效果。(4)微生物菌體及其分泌的高聚物可以有選擇的堵塞滲透率較高的巖層，使液體轉(zhuǎn)向滲透率較小的孔隙，提高水驅(qū)和氣驅(qū)效果。(5)微生物產(chǎn)生的酸性物質(zhì)能溶解巖石，增加地層滲透率，從而改善油層滲流。雖然采油機理還在不斷的研究探索當中，微生物采油技術(shù)已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，并取得了很好的經(jīng)濟效果。
微生物采油獲得成功的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)是尋找和利用具有優(yōu)良性能的菌株，該菌株必須能適應(yīng)所用油藏的溫度，壓力和鹽度等環(huán)境條件，其中最重要的是溫度條件。因此在高溫油藏進行采油，菌種的嗜熱性就特別重要。本發(fā)明中的菌種是經(jīng)過特殊方法篩選到的耐高溫菌株，生長溫度范圍較大，并適合在高溫的油藏環(huán)境中生長。降解原油中的烷烴從而提高原油的流動性是微生物采油的一個重要機制，本發(fā)明的菌株能利用石油為唯一碳源并有很好的降解烷烴的能力，對原油有很好的降解作用，具備微生物采油用菌的優(yōu)秀品質(zhì)。該菌種具有降解石油的性能，其在某些含有石油的物質(zhì)中生長和進行代謝活動，可以對這些物質(zhì)起到良好的去石油凈化作用。目前，在人們生活的環(huán)境中，由于石油工業(yè)的發(fā)展，在開采、運輸和生產(chǎn)中產(chǎn)生石油污染，有很多被石油污染的物質(zhì)，對環(huán)境的污染非常嚴重，例如含有石油的污水，原油在環(huán)境中的泄露等。應(yīng)用本發(fā)明篩選的菌株可以很好的將這些物質(zhì)中的石油降解，起到凈化污染物的效果，在環(huán)境保護中起到重要作用。
本發(fā)明的菌株屬于嗜熱細菌，而嗜熱細菌的酶幾乎全是熱穩(wěn)定性的。嗜熱細菌酶的耐熱性主要是由酶蛋白分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)所決定的。研究表明，酶本身的一級結(jié)構(gòu)對其耐熱性具有重要作用。酶的一級結(jié)構(gòu)中某些關(guān)鍵區(qū)域的個別氨基酸改變，就會引起高級結(jié)構(gòu)的變化，使酶蛋白結(jié)構(gòu)中的氫鍵、離子鍵或疏水鍵稍有增加，從而提高整個分子的熱穩(wěn)定性。嗜熱細菌可以隨溫度的改變而改變所合成酶的耐熱性，也可通過已有酶蛋白的構(gòu)型的改變而改變它的耐熱性。從嗜熱菌中分離的酶具有一些優(yōu)良的生物學性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性，以及對化學和物理變性劑，有機溶劑，極端Ph等不利因素的抗性等。這些性質(zhì)不僅可以作為設(shè)計和改造酶類的依據(jù)，而且在工業(yè)生產(chǎn)中極具應(yīng)用價值。
本發(fā)明細菌具有降解石油，分泌表面活性劑等功能，這些作用導(dǎo)致石油粘度的下降，石油流動性增強，而石油流動性對石油工業(yè)具有極大的影響。首先在石油開采時，石油流動性強，就易于采出，對設(shè)備和采油作業(yè)的工程處理和要求降低，減少了采油的成本，提高了效益。其次，石油運輸中無論是經(jīng)管道或利用其他運輸工具，高流動性都是一個極為有利的特性。例如用管道運輸，如果石油流動性差，就必須采用升溫、加壓等手段，這樣就耗費了大量的運輸間接成本。本發(fā)明的細菌在增強石油流動性上有顯著效果，因此本菌株的應(yīng)用將極大地提高石油運輸?shù)男б妗?br> 綜上所述，本發(fā)明篩選的菌株可以應(yīng)用到石油開采業(yè)、石油運輸業(yè)、環(huán)境保護業(yè)和其他相關(guān)工業(yè)生產(chǎn)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺點，而提供一種嗜熱脫氮芽孢桿菌G1788及其篩選和應(yīng)用，其篩選的菌種屬于土壤芽孢桿菌屬，耐高溫，具有很好的熱穩(wěn)定性能，可以在發(fā)酵等需要熱穩(wěn)定酶條件的工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用；其能利用原油作為唯一碳源，在油藏環(huán)境中生長良好，具有很好的降解烷烴的能力；該菌株在油藏中利用原油為營養(yǎng)來源的生長與代謝活動改善了原油的性質(zhì)，具有降低原油黏度的性質(zhì)，提高石油的流動性能，從而可以有效提高石油的采收率和石油運輸?shù)男?；利用其良好的降解石油的能力，可以處理凈化被石油污染的污水等物質(zhì)，在環(huán)境保護中起重要作用；該菌株還具有降低物質(zhì)表面張力的功能，因此可在制備表面活性劑工業(yè)中應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株，其特征在于，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC-1228。
本發(fā)明嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于，由油田地層水樣中的菌種作為篩選的初始菌種，經(jīng)初篩、復(fù)篩、接種、馴化擴增得到該菌株。
前述嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的篩選方法，其中所述初篩為在營養(yǎng)瓊脂平板73℃培養(yǎng)篩選，再用以原油為碳源的無機鹽培養(yǎng)基，73℃油浴震蕩培養(yǎng)，進行乳化分散實驗，取分散效果好的菌株；所述復(fù)篩為在乳化分散實驗和降粘降凝實驗中，取乳化分散和降粘降凝效果最好的菌株，得到最優(yōu)菌；將得到的最優(yōu)菌反復(fù)接種液蠟無機鹽培養(yǎng)基，73℃馴化擴增，得到該菌株。
本發(fā)明嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無機鹽；其特征在于，所述碳源為葡萄糖、蔗糖或淀粉；所述氮源為硝酸鈉、硫酸鐵、硫酸鎂、磷酸氫鈉和磷酸氫甲；所述培養(yǎng)基的PH為6.5至7.5。
前述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基，其中所述碳源選用蔗糖，用量為0.1％；所述氮源選用硝酸鈉，用量為0.1％至0.4％；酵母粉用量為0.05％；所述無機鹽用量為基礎(chǔ)培養(yǎng)基無機鹽用量的1.5至2倍。
本發(fā)明嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株在石油開采業(yè)、降解石油烴、凈化含石油物質(zhì)、石油運輸業(yè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株在需要熱穩(wěn)定酶的工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株在制備表面活性劑中的應(yīng)用。
前述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其中含石油物質(zhì)為含石油的污水等。
前述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其中需要熱穩(wěn)定酶的工業(yè)生產(chǎn)是發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。
四

圖1為16SrDNA進化樹示意圖。
圖2為持家基因araA進化樹示意圖。
圖3為持家基因Mdh進化樹示意圖。
圖4為持家基因recN進化樹示意圖。
圖5為本發(fā)明篩選菌種以石油為唯一碳源生長曲線示意圖。
圖6為本發(fā)明篩選菌種對石油原樣降解情況檢測曲線示意圖。
圖7為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵一天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖8為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵三天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖9為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵五天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖10為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵九天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖11為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵十四天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖12為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵二十一天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖13為本發(fā)明篩選菌種對發(fā)酵二十八天石油降解情況檢測曲線示意圖。
圖14為本發(fā)明篩選菌種對C12烷烴不同發(fā)酵時期降解情況曲線示意圖。
圖15為本發(fā)明篩選菌種對C17烷烴不同發(fā)酵時期降解情況曲線示意圖。
圖16為本發(fā)明篩選菌種對C19烷烴不同發(fā)酵時期降解情況曲線示意圖。
圖17為本發(fā)明篩選菌種對C25烷烴不同發(fā)酵時期降解情況曲線示意圖。
圖18為本發(fā)明篩選菌種對C35烷烴不同發(fā)酵時期降解情況曲線示意圖。
圖19為本發(fā)明篩選菌種對C46烷烴不同發(fā)酵時期降解情況曲線示意圖。
圖20為本發(fā)明篩選菌種對石油成分降解情況曲線示意圖。
圖21為本發(fā)明表面活性劑提取方法工藝流程圖。
圖22為本發(fā)明表面張力結(jié)果示意圖。
五具體實施例方式
(一)微生物名稱和保藏情況。
嗜熱脫氮芽孢桿菌G1788(Geobacillus thermodenitrificans G1788)，已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)進行保藏，其保藏號為CGMCC-1228。
(二)菌株的特征與鑒定。
1、G1788菌株的形態(tài)和生理生化特征。
根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英等編著，北京科學出版社2001.2，ISBN7-03-008460-8)及《Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology》(Ninth Edit ion)對G1788菌進行了鑒定，其結(jié)果如下G1788菌株的細胞呈長桿狀，大小為0.6～1.0×3.1～6.5μm，Gram氏染色陽性，周生鞭毛，能運動；有芽孢，芽孢端生或次端生，橢圓或稍膨大；菌落大而干燥，具皺折邊緣。接觸酶陽性，能水解明膠、淀粉；能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽；不能水解酪朊；不能利用檸檬酸鹽；其它特征如表1所示。
表1 G1788的形態(tài)及生理特征


2、G1788糖發(fā)酵實驗。
采用API 50 CHB/E糖培養(yǎng)基和試驗條(Bio+Mèrieux，Marcyl’ètoile，F(xiàn)rance)，接種G1788進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)期間，若糖發(fā)酵產(chǎn)酸，致使pH下降，以指示劑的顏色變化予以表示。試驗結(jié)果見表2所示。G1788能利用甘油、核糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、七葉靈、纖維二糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松叁糖、淀粉、D-松二糖發(fā)酵產(chǎn)酸；并能微弱利用肌醇、N-乙酰-葡糖胺產(chǎn)生少量的酸。G1788不能發(fā)酵D-阿拉伯糖、鼠李糖等其它糖類。David J等(FEMSMicrobiology Letters，1999，17285～90)、Manachini等(Int.J.Sys.Evol.Microbiol，2000，501331~1337)認為嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans)能水解淀粉、核糖、三丁酸甘油酯(tributyrin)和木聚糖；能還原硝酸鹽和亞硝酸鹽產(chǎn)氣；能發(fā)酵阿拉伯糖、纖維二糖、松叁糖、蜜二糖、海藻糖、產(chǎn)酸；但不能發(fā)酵半乳糖和鼠李糖產(chǎn)酸；菌落有羽毛狀邊緣。G1788具有與嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)相同的形態(tài)和生理生化特征，據(jù)此鑒定G1788屬于嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans)。
表2 G1788對API 50 CHB/E糖培養(yǎng)基實驗結(jié)果


3、通過對16S rDNA和持家基因的進化分析，確定細菌分類。
16S rDNA廣泛存在于真核和原核生物，功能穩(wěn)定，由高度保守區(qū)和可變區(qū)組成，一般認為是研究系統(tǒng)進化關(guān)系的最好材料之一。16S rDNA分子大小為1500bp左右，所代表的信息量既能反應(yīng)生物界的進化關(guān)系，又較容易進行操作。同樣，持家基因也是細菌進化分析的好材料。16S rDNA和持家基因的進化分析是隨著生物信息學發(fā)展起來的新方法，將這些保守的基因序列與現(xiàn)有的其他細菌的相應(yīng)基因序列進行類比分析，可以清晰準確的確定所要分析菌株的種屬關(guān)系。
對G1788的16S rDNA和持家基因araA、Mdh、recN做進化分析，將G1788的16S rDNA和持家基因araA、Mdh、recN測序，在GENEBANK等數(shù)據(jù)庫中進行BLAST(序列聯(lián)配分析)，得到與G1788種屬相近的多種細菌的相應(yīng)基因序列，然后利用生物信息學軟件對這些基因序列進行對比，根據(jù)他們的進化關(guān)系繪制出進化樹，取親緣關(guān)系較近的結(jié)果，參閱圖1至圖4所示。
G1788的16SrDNA與Geobacillus thermodenitrificansT1660的核酸序列相同性為99％；araA基因與Geo thermodenitrificans的核酸序列相同性為95％；mdh基因與bacillus thermodenitrificans-m的核酸序列相同性為99％；recN基因與Geo-thermodenitrificans的核酸序列相同性為99％。G1788與以上比較的細菌都是Geobacil lus thermodenitrificans，結(jié)果都是在所有細菌中相同性最高的。以上結(jié)果表明G1788與Geobacillusthermodenitrificans的細菌菌株相似關(guān)系最密切，可以認定G1788屬于Geobacillus thermodenitrificans(嗜熱脫氮芽孢桿菌)。
(三)菌種的篩選。
1、菌種的篩選步驟。由本室菌種和大港油田地層水樣中的菌種作為篩選的初始菌種。(1)初篩營養(yǎng)瓊脂平板73℃培養(yǎng)篩選，再用以原油為碳源的無機鹽培養(yǎng)基，73℃油浴震蕩培養(yǎng)，作乳化分散實驗，取分散效果好的菌株。(2)復(fù)篩做乳化分散實驗和降粘降凝實驗，取乳化分散和降粘降凝效果最好的菌株，得到最優(yōu)菌G1788。(3)將G1788反復(fù)接種液蠟無機鹽培養(yǎng)基，73℃馴化擴增，得到該高溫菌株。
乳化分散試驗250mL三角瓶，每瓶裝100mL無機鹽培養(yǎng)基和2g脫水原油，121℃滅菌30min，接種量10％。73℃下密封，油浴振蕩培養(yǎng)7天。室溫靜置冷卻，肉眼觀察乳化分散效果，分為“4-”到“4+”八個等級，以不掛壁，顆粒細小均勻，振蕩能形成均勻懸濁液且呈墨汁狀者為最佳(“4+”)，水相測PH值，表面張力，油相測原油降解率。(無機鹽培養(yǎng)基Na2HPO40.06；KH2PO40.02；NaNO30.2；CaCl 20.001；FeSO40.001；MgSO40.03；酵母粉0.05；蔗糖0.1；pH為7.2?；A(chǔ)培養(yǎng)基無機鹽培養(yǎng)基加入液蠟或原油，用于乳化分散實驗等)降粘降凝實驗250ml三角瓶，每瓶裝30ml無機鹽培養(yǎng)基和40g脫水原油，121℃滅菌30min，接種量每瓶30ml，73℃下密封油浴振蕩培養(yǎng)7天。室溫靜置冷卻后放4℃冰箱，油層徹底凝固后取出脫水，脫水三次，油相在50℃下測粘度，按《石油分析評價》(石油工業(yè)出版社2000第34-35頁)中的方法測定凝固點。
經(jīng)以上的實驗步驟篩選到對降解石油效果最佳的G1788。
篩選得到的嗜熱脫氮芽孢桿菌G1788已經(jīng)保藏在在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center)進行保藏，其保藏號為CGMCC-1228。
2、菌種培養(yǎng)基的優(yōu)化(培養(yǎng)基中的百分比含量的意義為每100毫升溶液中的溶質(zhì)克數(shù)。例如，葡萄糖1％表示100毫升溶液中含有1克的葡萄糖)。
試劑肉湯培養(yǎng)基(％)牛肉膏0.4；蛋白胨1；NaCl 0.5。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(％)肉湯培養(yǎng)基+1.8％瓊脂粉方法使用營養(yǎng)瓊脂平板菌落記數(shù)法。
(1)單因子試驗。
表3為碳源、氮源、生長因子的選擇


(培養(yǎng)基另外按2％的比例加入液臘；無機鹽成分同基礎(chǔ)培養(yǎng)基；葡萄糖或蔗糖、淀粉數(shù)量為0.1％，NaNO30.2％，其它氮源按與NaNO3相同的摩爾濃度加入。)結(jié)果表明，以蔗糖為碳源、以NaNO3為氮源、有生長因子的條件下生長最好。
(2)無機鹽組成的選擇如表4所示。
表4無機鹽組成的選擇

以上無機鹽濃度同無機鹽培養(yǎng)基，結(jié)果表明當表中5種無機鹽成分完全時菌種生長最好。
(3)最佳pH的選擇如表5所示。
表5最佳pH的選擇。

結(jié)果表明pH7.2是最佳培養(yǎng)條件。
(4)最佳培養(yǎng)方案的確定，參閱表6所示。
將四個因素按兩種不同水平進行正交實驗。按L8(27)設(shè)計表頭，以第1，2，4，7組成實驗計劃。
NaNO3(％) A1 0.2；A2 0.4蔗糖(％) B1 0.1；B2 0.2酵母粉(％)C1 0.05；C2 0.1無機鹽D1(同無機鹽培養(yǎng)基)；D2(為D1的兩倍)表6正交實驗結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計分析表明，B因素，C因素為主要影響因素，根據(jù)以上實驗，選擇B1，C1，A2和D2為最佳培養(yǎng)基，即NaNO30.4％，蔗糖0.1％，酵母粉0.05％，無機鹽為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的兩倍。
(5)驗證實驗結(jié)果如表7所示。
表7驗證實驗結(jié)果

結(jié)果表明優(yōu)化培養(yǎng)基明顯好于液蠟基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
(四)本發(fā)明的有益使用效果。
1、適應(yīng)地層環(huán)境。
(1)在73℃地層水中生長良好。
分別用地層水和蒸餾水配制液臘基礎(chǔ)培養(yǎng)基，73℃培養(yǎng)4天，比較生長情況，如表8所示。
表8該菌種對地層水適應(yīng)良好

地層水由大港油田提供，其離子類型和含量為(單位mg/L)Na+K+6075；Mg2+87；Ca2+298；Cl-9874；SO42-37；HCO-3419。地層水礦化度高，且含有內(nèi)源微生物，與蒸餾水有很大差別。但以上結(jié)果表明地層水及其中的內(nèi)源微生物并不影響菌種生長，該菌在地層水中生長正常，適應(yīng)良好。
(2)地層水培養(yǎng)條件下的乳化分散試驗。
原油降解率測定精確稱量2.00g脫水原油做乳化分散試驗，發(fā)酵液過濾，用一定量的正己烷收集全部未降解原油，適當稀釋，254nm下測OD值，以未上搖床的空白對照為標準，計算殘余油量，進而計算原油降解率，如表9所示。
表9原油降解率。

由上表可見地層水(不滅菌)培養(yǎng)條件下，G1788對原油的作用比地層水(滅菌)培養(yǎng)時效果好，表明地層水和其中的內(nèi)源微生物并不抑制高溫菌的生長，也不影響高溫菌對原油的作用，地層水(不滅菌)培養(yǎng)條件下的原油降解率比蒸餾水培養(yǎng)條件下顯著提高，表明G1788適應(yīng)該油藏的水及與其他微生物的環(huán)境，可以在油藏中進行正常的生長，并能有效的降解原油。
2、耐高溫。
(1)菌種生長的溫度范圍如表10所示(采用營養(yǎng)瓊脂平板劃線法接種，在不同溫度下培養(yǎng)，觀察生長情況)。
表10菌種生長的溫度范圍。

該菌種生長溫度范圍為45℃～78℃。
(2)不同溫度下的生長情況如表11所示(使用營養(yǎng)瓊脂平板菌落記數(shù)法，做60℃、65℃、73℃下的生長曲線)。
表11不同溫度下的生長情況
在24小時菌濃可達到108個/ml，培養(yǎng)可選擇優(yōu)化培養(yǎng)基65℃培養(yǎng)24小時。
(3)生長溫度曲線如表12所示(使用營養(yǎng)瓊脂平板菌落記數(shù)法，分別在以下溫度培養(yǎng)兩天，測菌濃，作生長溫度曲線)。
表12生長溫度曲線 最佳生長溫度范圍在60℃到73℃。
(4)凍溶對細菌生長的影響，如表13所示的耐低溫性能測定數(shù)據(jù)(使用營養(yǎng)瓊脂平板菌落記數(shù)法，將原菌液置冰箱(-20℃)冷凍如下表中時間后，測菌濃)。
表13耐低溫性能測定數(shù)據(jù) G1788經(jīng)受一定時間的冰凍后菌的濃度基本不變，耐低溫性能良好。菌種良好的耐低溫性對于冬季礦場應(yīng)用有很大的意義。
3、能夠以石油為唯一碳源生長，參閱圖5所示。
在BSM培養(yǎng)基中添加2％的葡萄糖或石油，利用菌落記數(shù)法測定生長情況。
G1788能夠在以石油為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長良好，與在葡萄糖培養(yǎng)基中生長相比，其延遲期稍長，對數(shù)末期生長量稍低。(BSM培養(yǎng)基1000ml中含有KH2PO42.44g，Na2HPO15.57g，NH4CL 2g，MgCL20.2g，CaCl20.001g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.001g，MnCl2·4H2O 0.004g，PH＝7.2.)4、能夠降解石油。
(1)菌株對原油的作用效果。
做乳化分散實驗和降粘實驗，以原油為唯一碳源，73℃油浴振蕩培養(yǎng)時間分別為5，10，15，20天，設(shè)對照組(不加微生物，培養(yǎng)條件與實驗組相同)和實驗組(加入G1788)，A、發(fā)酵液的PH值變化情況如表14所示。
表14發(fā)酵液的PH變化數(shù)值 B、表面張力變化情況如表15所示。
表15表面張力變化數(shù)值 C、對原油的降解作用(降解率％)如表16所示。
表16原油的降解率 B、對原油的降粘作用(降粘率％)如表17所示。
表17原油的降粘率 (5)原油凝固點(℃)如表18所示。
表18原油凝固點(℃) 以上結(jié)果表明G1788顯著提高了原油的降解率，并降低原油的表面張力和凝固點，使原油的粘度顯著下降；經(jīng)過G1788作用的原油降解率提高，流動性增加，易于開采，表明G1788的應(yīng)用可以提高原油采收率。
(2)采用分光光度法測定菌株對石油的降解，結(jié)果如表19所示。
A、在高溫無機鹽培養(yǎng)基中添加2.00g石油，培養(yǎng)G1788并測定生長情況。G1788能在該培養(yǎng)基中生長良好。本試驗中使用的高溫無機鹽培養(yǎng)基KH2PO40.34％，Na2HPO40.15％，(NH4)2SO40.4％，MgSO40.07％，酵母粉0.05％，pH為7.2。
B、做乳化分散實驗分別發(fā)酵120h和168h，到時間后靜止搖瓶30min觀察石油乳化情況，發(fā)酵120h和168h的搖瓶與對照相比，大部分石油均勻分散在水相中，只有少量石油殘渣漂浮在水相表面，發(fā)酵168h的殘渣比120h少。
C、使用正己烷對石油進行稀釋，測定全波長吸收，發(fā)現(xiàn)在250nm處有明顯的吸收峰，石油含量與A250nm呈正相關(guān)關(guān)系，R2＝0.9975，y＝0.0137x。做1-5天的乳化分散實驗，使用正己烷萃取發(fā)酵培養(yǎng)基中石油，適當稀釋后測定A250nm，根據(jù)標準曲線計算石油含量。
表19石油的降解結(jié)果數(shù)值

經(jīng)過G1788的生長代謝，培養(yǎng)基中的2.00g石油在五天內(nèi)逐步下降，在第五天已經(jīng)降解至0.38g，可見G1788促進石油降解的作用顯著。(注分光光度法是較為粗略的方法，受較多因素影響，多作為定性的實驗方法而不是定量方法，但在本實驗中已經(jīng)十分明顯的表明G1788對降解石油有良好的作用)。
(3)采用氣相色譜法分析石油降解情況。
A、儀器設(shè)備及試劑。
a、儀器與設(shè)備KS501數(shù)字化水平搖床Agilent Technologies 6890N氣相色譜儀色譜柱varian cp7542
長10米內(nèi)徑0.53毫米膜厚0.17微米MaxTem450℃B、分析條件進樣口溫度為400℃，壓力為3.6Kpa，冷柱頭進樣；爐溫采用程序二階升溫法，起始溫度60℃，速率5℃/min；終點溫度250℃，速率4℃/min；終點溫度380℃，恒溫10min；檢測器采用氫火焰檢測器，檢測條件溫度400℃，輔助為N2(流速20ml/min)，H2流速為40.0ml/min，空氣流速為450.0ml/min。
(4)細菌培養(yǎng)與樣品處理。
A、使用的培養(yǎng)基。
a、LB培養(yǎng)基蛋白胨為1％，酵母粉為0.5％，NaCl為1％，pH為7.0；b、液蠟誘導(dǎo)培養(yǎng)基Na2HPO4為0.06％，KH2PO4為0.02％，NaNO3為0.4％，CaCl2為0.001％，F(xiàn)eSO4為0.001％，MgSO4為0.003％，酵母粉為0.1％，蔗糖為0.5％，pH為7.2，2％液蠟；c、高溫無機鹽培養(yǎng)基KH2PO4為0.34％，Na2HPO4為0.15％，(NH4)2SO4為0.4％，MgSO4為0.07％，酵母粉為0.05％，pH為7.2；d、普通瓊脂斜面或平板培養(yǎng)基NaCl為0.5％，蛋白胨為1％，牛肉膏為0.4％，瓊脂粉為3％，pH為7.2~7.5；以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌30min后使用。
B、菌種培養(yǎng)。
a、將甘油凍存管中菌種接種挑取3環(huán)接到80mL LB搖瓶，在65℃，120rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)24h；b、轉(zhuǎn)接到液蠟誘導(dǎo)培養(yǎng)基50mL中，振蕩培養(yǎng)24h；c、再轉(zhuǎn)接到100mL液蠟誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)24h；
d、轉(zhuǎn)接100mL高溫無機鹽培養(yǎng)基中，在同樣條件下進行培養(yǎng)，在不同發(fā)酵時間取出，測定該菌體對石油的降解率；e、接種量均為10％。
C、樣品處理。
將發(fā)酵液倒入250mL的分液漏斗中，再將100mL的正己烷分三次加入，每次都先倒入搖瓶中，用膠塞塞緊，在水平搖床上200r/min，振蕩30～60min，再移入分液漏斗中，旋轉(zhuǎn)振蕩，靜置過夜。
用微量取樣器小心的將分液漏斗中的上層清液取出，12000r/min，離心兩次，放入零下20度的冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 石油原樣的處理方法準確稱取2克石油，用100mL正己烷稀釋，振蕩混勻，12000r/min離心兩次，放入零下20度的冰箱保存?zhèn)溆谩?br> D、氣相色譜對不同發(fā)酵時期石油降解情況的測定，石油原樣為2％，結(jié)果參閱圖6至圖13所示。
5、烷烴降解情況的比較，參閱圖14至圖20所示。
由以上的圖可以看出，直鏈烷烴的降解主要集中在前三天，對于C12、C17、C19來說前五天的降解變化率最大，對于C25在前三天有明顯的降解，可到了后幾天，含量卻逐漸增加，甚至比第一天還多(1.073倍)，這可能由于是高分子量的直鏈烷烴降解到了二十五個碳左右的烷烴，引起了該烷烴的增加；C35在第五天時的上升也是因為更高碳數(shù)的烷烴降解；C46的降解效果非常好。結(jié)果表明本發(fā)明篩選的菌種在石油降解中可以很好地降解長至46個碳的長鏈烷烴。本實驗采用內(nèi)標法測定不同發(fā)酵時間的石油降解情況，由于菌體乳化石油的現(xiàn)象很明顯，為了減少實驗的系統(tǒng)誤差，決定以第一天降解情況為基礎(chǔ)，與其比較得到降解率。如果以未降解的原始石油為基礎(chǔ)那么降解效果會更明顯。
綜上，本發(fā)明提供的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株G1788，屬于土壤芽孢桿菌屬，其具有耐高溫，能利用原油作為唯一碳源，而在油藏環(huán)境生長良好的性能，因此該菌株能夠通過在油藏中利用原油為營養(yǎng)來源的生長與代謝活動改善原油的性質(zhì)，從而很好的降解烷烴，提高石油的流動性能，有效達到提高石油采收率的效果。
本發(fā)明提供的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株G1788的又一有益的使用效果是，通過該菌種具有降解石油的性能，使其在某些含有石油的物質(zhì)中生長和進行代謝活動，可以對這些物質(zhì)起到良好的去石油凈化作用。目前，在人們生活的環(huán)境中，由于石油工業(yè)的發(fā)展，在開采、運輸和生產(chǎn)中產(chǎn)生石油污染，有很多被石油污染的物質(zhì)，對環(huán)境的污染非常嚴重，例如含有石油的污水，原油在環(huán)境中的泄露等。應(yīng)用本發(fā)明篩選的菌株可以很好的將這些物質(zhì)中的石油降解，起到凈化污染物的效果，在環(huán)境保護中起到重要作用，特別是石油污染處理技術(shù)領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用價值。
6、本發(fā)明篩選的菌種在發(fā)酵等需要熱穩(wěn)定酶條件的工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
研究表明，嗜熱菌中分離純化出的酶具有很好的熱穩(wěn)定性，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、科學研究等多個方面。
嗜熱細菌的酶幾乎全是熱穩(wěn)定性的。嗜熱細菌酶的耐熱性主要是由酶蛋白分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)所決定的。研究表明，酶本身的一級結(jié)構(gòu)對其耐熱性具有重要作用。酶的一級結(jié)構(gòu)中某些關(guān)鍵區(qū)域的個別氨基酸改變，就會引起高級結(jié)構(gòu)的變化，使酶蛋白結(jié)構(gòu)中的氫鍵、離子鍵或疏水鍵稍有增加，從而提高整個分子的熱穩(wěn)定性。嗜熱細菌可以隨溫度的改變而改變所合成酶的耐熱性，也可通過已有酶蛋白的構(gòu)型的改變而改變它的耐熱性。
從嗜熱菌中分離的酶具有一些優(yōu)良的生物學性質(zhì)，如熱穩(wěn)定性，以及對化學和物理變性劑，有機溶劑，極端Ph等不利因素的抗性等。這些性質(zhì)不僅可以作為設(shè)計和改造酶類的依據(jù)，而且在工業(yè)生產(chǎn)中極具有應(yīng)用價值。
利用嗜熱菌產(chǎn)生的嗜熱酶作為生物催化劑有許多優(yōu)勢(1)酶制劑的成本降低，穩(wěn)定性提高，可在室溫下分離提純和包裝運輸，并能長久地保持活性。
(2)可以加快動力學反應(yīng)的速度。
(3)對反應(yīng)的冷卻系統(tǒng)要求降低，從而可降低能耗，這樣既可降低成本又可減少冷卻過程對環(huán)境造成的污染。
(4)在嗜熱酶催化反應(yīng)的條件下，很少有雜菌污染，可減少對產(chǎn)品的污染，提高產(chǎn)物的純度，簡化其提純過程。
(5)使生化過程可以在高溫下進行，以增加難溶物質(zhì)的溶解性和可利用性，降低有機化合物的黏度而有利于化合物的擴散和混合。
由于以上原因，本發(fā)明中的嗜熱菌株及其產(chǎn)生的嗜熱酶在食品、化工、制藥工業(yè)及環(huán)保等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。同樣，與本菌株特性相關(guān)的酶，如降解長鏈烷烴的酶，分泌的表面活性物質(zhì)等也具有廣泛的應(yīng)用前景。嗜熱酶在嗜熱菌中由相應(yīng)的基因編碼和被表達，為了降低酶的生產(chǎn)成本，現(xiàn)在通用的方法是用基因工程技術(shù)，將編碼嗜熱蛋白酶的基因提取出來，裝載到質(zhì)粒中，在將含該基因的質(zhì)粒導(dǎo)入某種細菌中，建立一個高效的表達體系來大量生產(chǎn)這種嗜熱酶。同樣，降解石油烴的酶和合成表面活性物質(zhì)也是由相應(yīng)的基因編碼和表達或合成的，也可以通過相同的基因工程技術(shù)進行大量生產(chǎn)?；蚬こ碳夹g(shù)已經(jīng)是生物以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)中的常規(guī)方法，所有本發(fā)明菌株特性相關(guān)的基因和蛋白酶或其他有益的物質(zhì)均可以利用基因工程技術(shù)大規(guī)模提取和應(yīng)用。
7、本發(fā)明篩選的菌種具有分泌表面活性劑的特性。
本發(fā)明篩選的菌種中具有產(chǎn)生的降低表面張力相關(guān)物質(zhì)或表面活性物質(zhì)，用該菌做乳化分散實驗，利用經(jīng)乳化分散實驗后的培養(yǎng)液做表面活性劑分析。
(1)表面活性劑提取方法的確定如圖21所示。
(2)表面活性劑的分析粗產(chǎn)物的定量測定將旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)后的干產(chǎn)物用氯仿溶解，移至已稱重的小瓶中，稱重。
定性分析薄層層析法。采用兩步展開法，先用石油醚∶乙醚∶醋酸(體積比80∶20∶1)展開，前沿離薄層頂端1cm左右處停止，再用氯仿∶甲醇∶水(體積比65∶15∶2)展開，前沿過薄板長度的一半距離時取出。UV下觀察，在分別用碘蒸汽、苯酚-硫酸、0.5％茚三酮丙酮溶液、鉬酸銨-高氯酸溶液顯色。
(3)表面張力結(jié)果如圖22所示。
有機溶劑提取后的有機相對表面張力的貢獻最大，表明此表面活性劑主要是類脂化合物。
(4)定性定量結(jié)果，見表18所示。
表20表面活性劑產(chǎn)量


表面活性劑粗產(chǎn)物為多種不同極性物質(zhì)的混合(1)展開劑前沿附近是非極性物質(zhì)或中性物質(zhì)，為磷酸脂(2)展開劑中部斑點對碘蒸汽、苯酚-硫酸顯色劑勻成正反應(yīng)，表明是糖脂類化合物；在第五天和第十五天時有對茚三酮顯色反應(yīng)的斑點，表明是脂肽類物質(zhì)。還有一些極性較強的物質(zhì)，對照組中不存在。據(jù)文獻報道，原油的成分十分復(fù)雜，本身就含一些活性成分即具有表面活性的物質(zhì)，主要是長鏈脂肪酸、醇或酚等含氧化合物和有機酸脂等其他含氧化合物；另外微生物對原油的作用途徑多樣，中間產(chǎn)物豐富，因此產(chǎn)生的表面活性劑種類很多。以上結(jié)果表明G1788可以顯著的提高表面活性劑的含量，降低原油表面張力，從而加強了原油的流動性。
8、本發(fā)明篩選的菌種具有降低石油粘度的特性，可以在石油運輸中的應(yīng)用。
做乳化分散實驗和降粘實驗，以原油為唯一碳源，73℃油浴振蕩培養(yǎng)時間分別為5，10，15，20天，設(shè)對照組(不加微生物，培養(yǎng)條件與實驗組相同)和實驗組(加入G1788)。如表21所示(同表17)原油的降粘率表21

由表中數(shù)據(jù)表明G1788可顯著降低原油的粘度，可能的解釋是該菌種代謝產(chǎn)生了很多物質(zhì)(如表面活性劑等)，而且長鏈石油烴的降解也有效地改善了原油的流動性。
石油在開采和運輸時，如果石油的粘度高不容易流動，就需要更多的生產(chǎn)過程和能量的消耗。因此，人們開發(fā)出多種方法減低原油的粘度，如放射波裂化減低粘度等。本發(fā)明篩選的菌株由于在降低原油的粘度方面具有非常好的效果，因此該菌株或從該菌株提取的有效物質(zhì)可以減低原油的粘度，將其應(yīng)用于石油開采業(yè)和石油的運輸業(yè)中，可以有效提高開采率和運輸效率。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株，其特征在于，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC-1228。
2.一種如權(quán)利要求1所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于，由油田地層水樣中的菌種作為篩選的初始菌種，經(jīng)初篩、復(fù)篩、接種、馴化擴增得到該菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于，所述初篩為在營養(yǎng)瓊脂平板73℃培養(yǎng)篩選，再用以原油為碳源的無機鹽培養(yǎng)基，73℃油浴震蕩培養(yǎng)，進行乳化分散實驗，取分散效果好的菌株；所述復(fù)篩為在乳化分散實驗和降粘降凝實驗中，取乳化分散和降粘降凝效果最好的菌株，得到最優(yōu)菌；將得到的最優(yōu)菌反復(fù)接種液蠟無機鹽培養(yǎng)基，73℃馴化擴增，得到該菌株。
4.一種如權(quán)利要求1所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無機鹽；其特征在于，所述碳源為葡萄糖、蔗糖或淀粉；所述氮源為硝酸鈉、硫酸鐵、硫酸鎂、磷酸氫鈉和磷酸氫甲；所述培養(yǎng)基的PH為6.5至7.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳源選用蔗糖，用量為0.1％；所述氮源選用硝酸鈉，用量為0.1％至0.4％；酵母粉用量為0.05％；所述無機鹽用量為基礎(chǔ)培養(yǎng)基無機鹽用量的1.5至2倍。
6.權(quán)利要求1所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株在石油開采業(yè)、降解石油烴、凈化含石油物質(zhì)、石油運輸業(yè)中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株在需要熱穩(wěn)定酶的工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株在制備表面活性劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述含石油物質(zhì)為含石油的污水等。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株的應(yīng)用，其特征在于，所述需要熱穩(wěn)定酶的工業(yè)是發(fā)酵工業(yè)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種嗜熱脫氮芽孢桿菌菌株及其篩選和應(yīng)用，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC－1228；其由油田地層水樣中的菌種作為篩選的初始菌種，經(jīng)初篩、復(fù)篩、接種、馴化擴增得到；本發(fā)明篩選的菌株屬于土壤芽孢桿菌屬，耐高溫，具有很好的熱穩(wěn)定性能，可應(yīng)用在發(fā)酵等需要熱穩(wěn)定酶條件的工業(yè)生產(chǎn)中；其能在油藏環(huán)境中生長良好，具有降解烷烴的能力和降低原油黏度的性質(zhì)，提高石油的流動性能，可有效提高石油的采收率和石油運輸?shù)男剩灰部衫闷淞己玫慕到馐偷哪芰?，處理凈化被石油污染的污水等物質(zhì)，起到環(huán)境保護的作用；該菌株還具有降低物質(zhì)表面張力的功能，可在制備表面活性劑工業(yè)中應(yīng)用。
文檔編號C10G32/00GK1614006SQ200410072759
公開日2005年5月11日 申請日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者王磊, 劉如林, 馮露, 梁鳳來 申請人:南開大學